劉健翔++秦新民

摘要：采用PCR擴(kuò)增方法測定了憑祥瞼虎（Goniurosaurus luii）線粒體基因組全序列。經(jīng)測序線粒體基因組全長16 519 bp，含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和1個(gè)控制區(qū)。憑祥瞼虎線粒體基因組堿基組成分別為A（34.11%）、T（27.43%）、C（26.01%）、G（12.45%）。除tRNA-Ser（AGY）外，其余21個(gè)tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)均為典型的三葉草結(jié)構(gòu)。13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因中，7個(gè)基因（ND1、ND4、ND5、COⅡ、COⅢ、ATP8、ATP6）的起始密碼子為ATG，2個(gè)基因（ND2、ND3）為ATA，2個(gè)基因（ND4L、Cytb）為ACA，剩余2個(gè)分別為ATC（COI）和GTG（ND6）。終止密碼子一般都是TAA、AGA或者TAA，ND2、ND3、ND4、ND6、ATP6、COⅢ 6個(gè)基因由不完全終止密碼子終止（TA或T）?？刂茀^(qū)全長1 147 bp，含有7個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列、6個(gè)終止相關(guān)序列TAS和2個(gè)保守序列（CBS-2，CBS-3）。

關(guān)鍵詞：憑祥瞼虎（Goniurosaurus luii）；瞼虎科；線粒體基因組；D-環(huán)

中圖分類號：Q953+.3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0976-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.048

Sequencing and Analysis of the Complete Mitochondrial Genome of Goniurosaurus luii

LIU Jian-xiang1，2，QIN xin-min1

（1.College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，Guangxi，China；2.Guilin Medical University，Guilin 541004，Guangxi，China）

Abstract：The complete nucleotide sequence of the mitochondrial genome of Goniurosaurus luii was determined by using PCR amplification and DNA sequencing. The results showed that the entire mitochondrial genome of G. luii is 16 519 bp in length and contained 13 protein-coding genes，2 rRNA genes，22 tRNA genes and 1 control region（D-loop）. The average nucleotide composition were 34.11% A，27.43% T，26.01% C and 12.45% G. The 21 tRNA genes can be fold in the typical cloverleaf structure except tRNA-Ser（AGY）. Among 13 protein-coding genes of the G. luii mitochondrial genome，seven of the 13 protein coding genes（ND1，ND4，ND5，COⅡ，COⅢ，ATP8 and ATP6） used ATG as the start codon，two genes（ND2 and ND3） used ATA，Cytb and ND4L used ACA，COI and ND6 started with ATC and GTG as the start codon，respectively. The remaining six genes had incomplete stop codons（ND3，ND4 and ATP6 with TA-，ND2，COⅢ and ND6 with T-）. In addition，the control area is 1 147 bp， there are 6 tandem repeat sequences，7 terminal associated sequence（TAS） and 2 conserved sequence blocks （CSB-2，CSB-3） in the control region of G. luii.

Key words：Goniurosaurus luii； eublepharidae； mitochondrial genome； D-loop

憑祥瞼虎（Goniurosaurus luii）屬有鱗目（Squamata）瞼虎科（Eublepharidae）爬行動物，主要分布于廣西壯族自治區(qū)。由于棲息地環(huán)境的破壞和人工大量捕獵，憑祥瞼虎種群數(shù)量急劇減少，該物種已被列入中國國家林業(yè)局2000年8月1日發(fā)布的《國家保護(hù)的有益的或者有重要經(jīng)濟(jì)、科學(xué)研究價(jià)值的陸生野生動物名錄》。目前，關(guān)于憑祥瞼虎的研究較少，僅在瞼虎屬物種的研究中有所涉及[1-3]。動物線粒體mtDNA具有分子結(jié)構(gòu)簡單、進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于物種起源、進(jìn)化和親緣關(guān)系的研究，成為研究近緣種間以及種內(nèi)群體之間遺傳分化的有力工具[4-7]。目前，憑祥瞼虎線粒體基因組DNA全序列的研究鮮見報(bào)道，本研究測定了憑祥瞼虎的線粒體基因組全序列，并對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，以期為憑祥瞼虎的系統(tǒng)發(fā)育和物種多樣性保護(hù)提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

憑祥瞼虎尾部肌肉。

1.2 DNA的提取

總DNA的提取采用改進(jìn)的SDS/蛋白酶K的方法[8]。

1.3 引物的設(shè)計(jì)

參考爬行動物通用引物擴(kuò)增12S rRNA、16S rRNA、COI、ND2、ND5和Cytb基因的部分片段，根據(jù)上述片段的測序結(jié)果，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)新引物，用來擴(kuò)增短片段之間的長片段DNA，所用引物見表1。

1.4 PCR擴(kuò)增和序列測定、拼接

PCR的反應(yīng)體系和PCR反應(yīng)參數(shù)參考文獻(xiàn)[9]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由華大基因科技股份有限公司進(jìn)行雙向測序。獲得的序列通過Chromas 2.22軟件分析，運(yùn)用Clustal X1.8[10]軟件比對校正后，使用DNASTAR和BLASTN軟件根據(jù)測得片段間的重疊區(qū)域拼接成完整的線粒體基因組全長。各蛋白質(zhì)編碼基因和rRNA基因通過與GenBank中近緣物種的線粒體基因進(jìn)行同源比對定位。tRNA基因的查找、定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用在線版的tRNAscan-SE Search Server軟件[11]。用MEGA 5.0軟件[12]對蛋白質(zhì)編碼基因進(jìn)行翻譯，最后用Sequin 11.0軟件對全序列進(jìn)行注釋，并提交至GenBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 憑祥瞼虎線粒體基因組的結(jié)構(gòu)和堿基組成

憑祥瞼虎線粒體DNA是閉合的環(huán)狀分子，全長為16 519 bp（GenBank登錄號：KM455054），其中包括了13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因和1個(gè)控制區(qū)（D-loop）（圖1）。除了tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser（UCN）、tRNA-Glu、tRNA-Pro和ND6 這幾個(gè)基因在L-鏈上編碼以外，其余基因均在H鏈編碼。憑祥瞼虎線粒體基因組堿基含量分別為A（34.11%）、T（27.43%）、C（26.01%）、G（12.45%），總的A+T含量為61.54%，與報(bào)道的其他爬行動物相符[13，14]。

2.2 蛋白質(zhì)編碼基因

憑祥瞼虎13個(gè)蛋白編碼基因總長度為11 384 bp，占整個(gè)基因組的69.0%。除ND6由L鏈編碼，其余12個(gè)基因均由H鏈編碼。最長的蛋白質(zhì)編碼基因是ND5，長度為1 820 bp，最短的是ATPase8基因，長度為165 bp。13蛋白質(zhì)編碼基因中，7個(gè)基因（NDI、ND4、ND5、COⅡ、COⅢ、ATP8、ATP6）的起始密碼子為ATG，2個(gè)基因（ND2、ND3）為ATA，2個(gè)基因（ND4L、Cytb）為ACA，剩余2個(gè)分別為ATC（COI）和GTG（ND6）。終止密碼子一般都是TAA、AGA 或者TAA，ND2、ND3、ND4、ND6、ATP6、COⅢ 6個(gè)基因由不完全終止密碼子終止（T或TA），不完全密碼子（TA或T）可以通過轉(zhuǎn)錄后聚腺苷酸化轉(zhuǎn)變?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)的終止密碼子（表2）。

2.3 rRNA和tRNA基因

與其他脊椎動物線粒體基因組一樣，憑祥瞼虎包括1個(gè)12S rRNA和1個(gè)16S rRNA，它們位于tRNA-Phe和tRNA-Leu（UUR）基因之間，12S rRNA與16S rRNA基因被tRNA-Val基因分隔開。憑祥瞼虎線粒體基因組中12S rRNA和16S rRNA基因的長度分別為933、1 591 bp（表2）。12S rRNA基因的堿基組成為36.12% A、24.33% C、17.15% G、22.40% T，16S rRNA基因?yàn)?6.46% A、23.51% C、15.96% G、24.07% T。

憑祥瞼虎線粒體DNA中tRNA基因共有22個(gè)，長度在60～75 bp之間，其中14個(gè)tRNA由重鏈編碼，8個(gè)tRNA由輕鏈編碼。tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)見圖2。

2.4 D-loop

憑祥瞼虎序列控制區(qū)（D-loop）是位于tRNA-Phe和tRNA-Pro之間長1 147 bp的序列，它占整個(gè)基因的6.94%，其堿基組成為35.92% A、30.08 C、10.37% G、23.63% T。在控制區(qū)內(nèi)存在6個(gè)91 bp串聯(lián)重復(fù)單元（AATACCTTAAAGTAAGAGTCTA TTCCTAATCTATTACCTATATACAAATAAGGGGCC- TAAAGGCCCCTTTTTACCCACTACTTATTACAAT），7個(gè)DNA復(fù)制終止相關(guān)序列TAS（ATTCCTAATCTATT），1個(gè)CSB-2（CAAACCCCCCTTACCCCC）和1個(gè)CSB-3（TCGCCAAACCCCTAAAACGA）。

3 討論

瞼虎屬（Goniurosaurus）動物種類較少，目前全世界僅報(bào)道了14個(gè)種，其中中國已命名了6個(gè)種[3]。一些學(xué)者分別采用線粒體12S rRNA、16SrRNA、ND2等基因構(gòu)建了NJ、MP、BI等系統(tǒng)發(fā)育樹探討該屬物種的系統(tǒng)發(fā)育和親緣關(guān)系，但結(jié)果并不一致[2，15-17]，其原因之一是所采用的單個(gè)基因片段包含的遺傳信息數(shù)量不多。相比之下，整個(gè)線粒體基因組序列所含遺傳信息量更為豐富，因此以線粒體基因組全序列進(jìn)行物種的系統(tǒng)發(fā)育分析，其結(jié)果更為可信。近年來，一些學(xué)者利用線粒體基因組全序列信息在解決鱷類、龜類和鳥類的分類地位和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系等方面取得了重要進(jìn)展[7，18-21]。

目前，瞼虎屬物種線粒體基因組全序列鮮見報(bào)道。本研究測定了憑祥瞼虎線粒體基因組序列，mtDNA全長為16 519 bp，含有13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、2個(gè)rRNA基因、22個(gè)tRNA基因和1個(gè)控制區(qū)。堿基含量為A（34.11%）、T（27.43%）、C（26.01%）、G（12.45%）。除tRNA-Ser（AGY）外，其余21個(gè)tRNA基因的二級結(jié)構(gòu)均為典型的三葉草結(jié)構(gòu)。13蛋白質(zhì)編碼基因中，7個(gè)基因（ND1、ND4、ND5、COⅡ、COⅢ、ATP8、ATP6）的起始密碼子為ATG，2個(gè)基因（ND2、ND3）為ATA，2個(gè)基因（ND4L、Cytb）為ACA，剩余2個(gè)分別為ATC（COI）和GTG（ND6）。終止密碼子一般都是TAA、AGA或者TAA，ND2、ND3、ND4、ND6、ATP6、COⅢ 6個(gè)基因由不完全終止密碼子終止（T或TA）。控制區(qū)全長1 147 bp，含有7個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列、6個(gè)終止相關(guān)序列TAS和2個(gè)保守序列（CBS-2、CBS-3）。結(jié)果可為憑祥瞼虎的分類、進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育等方面提供分子依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] GRISMER L L，VIETS B E，BOYLE L J. Two new continental species of Goniurosaurus（Squamata；Eublepharidae）with a phylogeny and evolutionary classification of the genus[J].J Herpetol，1999，33：382-393.

[2] KRATOCHVFL L S， FRYNTA D. Body size， male combat and the evolution of sexual dimorphism in eublepharid geckos （Squamata： Eublepharidae）[J]. Biol J Linn Soc，2002，2：303-314.

[3] 張 潔，慶 寧，易祖盛，等.Goniurosaurus indet.的有效性及中國瞼虎屬（Squamata：Sauria：Eublepharidae）種間的親緣關(guān)系[J].華南師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，46（2）：92-98.

[4] LOPEZ J V，CEVARIO S O，BRIEN S J.Complete nucleotide sequences of the domesticcat（Felis catus） mitochondrial genome and a transposed mtDNA tandem repeat （Numt） in the nuclear genome[J].Genomics，1996，33：229-246.

[5] IVANOV P L，WADHAMS M J，ROBY R K，et a1.Mitochondrial DNA sequence heteroplasmy in the grand duke of Russia georgij romanov establishes the remains of Tsar Nicholas Ⅱ[J].Nature Genetics，1996，12：417-420.

[6] DELPORT W，F(xiàn)ERGUSON J W，BLOOMER P.Characterization and evolution of the mitochondrlal DNA control region in Hornbills （Bucerotifoormes）[J].Mol Evol，2002，54：794-806.

[7] SHEN Y Y，LIANG L，SUN Y B，et al.A mitogenomic perspective on the ancient，rapid radiation in the galliformes with an emphasis on the Phasianidae[J].BMC Evolutionary Biology，2010， 10：132-141.

[8] 汪永慶，王新國，徐來詳，等.一種動物基因組DNA提取方法的改進(jìn)[J].動物學(xué)雜志，2001，36（1）：27-29.

[9] 覃屏生，陶春榮，佘 瑩，等.鱷蜥線粒體基因組全序列及其結(jié)構(gòu)分析[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，53（4）：925-928.

[10] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al.The Clustal X windows interface flexible strategies for multiple sequence aligrunent aided by quality analysis tools[J].Nucleic Acid Res，1997，25（24）：4876-4882.

[11] SCHATTNER P，BROOKS A N，LOWE T M. The tRNAscan-SE，snoscan and snoGPS web servers for the detection of tRNAs and snoRNAs[J]. Nucleic Acids Res，2005，33；686-689.

[12] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al. MEGA 5： Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J].Molecular Biology and Evolution，2011，28：2731-2739.

[13] BOHME M U，F(xiàn)RITZSCH G，TIPPMANN A，et al. The complete mitochondrial genome of the green lizard Lacerta viridis viridis（Reptilia：Lacertidae） and its phylogenetic position within squamate reptiles[J]. Gene，2007，394（1-2）：69-77.

[14] Li H M，ZENG D L，GUAN Q X，et al. Complete mitochondrial genome of Gekko swinhonis（Squamata，Gekkonidae）[J].Mitochondr DNA，2013，24：86-89.

[15] OTA H，HONDA M，KOBAYASHI M，et al. Phylogenetic relationships of eublepharid geckos（Reptilia：Squamata）：A molecular approach[J].Zoological Science，1996，16：659-666.

[16] JONNIAUX P，KUMAZAWA Y. Molecular phylogenetic and dating analyses using mitochondrial NDA sequences of eyelid geckos（Squamata：Eublepharidae）[J].Gene，2008，407：105-115.

[17] WANG Y Y，YANG J H，GRISMER L L. A new species of Goniurosaurs（Squamata：Eublepharidae） from Libo，Guizhou Province，China[J].Herpetologica，2013，69：214-226.

[18] JANKE A，ERPENBCEK D，NILSSON M，et al. The mitochondrial genomes of the iguana （Iguana iguana） and the caiman （Caiman crocodylus）：Implications for amniote phylogey[J].Proc R Soc Lond B，2001，268：623-631.

[19] PARHAM J F，MACEY J R，PAPENFUSS T J，et al. The phylogeny of mediterranean tortoises and their close relatives based on complete mitochondrial genome sequences from museum specimens[J].Mol Phylogenet Evol，2006，38：56-64.

[20] LI H M，SHI J P，ZENG D L，et al. The complete mitochondrial genome of Chrysolophus pictu（Galliformes：Phasianidae） and phylogenetic analysis with related species[J].Mitochondrial DNA，2011，22：159-161.

[21] 張 穎，聶劉旺，宋嬌蓮.緬甸陸龜線粒體全基因組的測序及分析[J].動物學(xué)報(bào)，2007，53（1）：151-158.