王桂清，馬 迪

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

5種不同鐮刀菌的酶學(xué)特性分析

王桂清，馬 迪

(聊城大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 聊城 252059)

采用比色法和電泳技術(shù)對(duì)引起成年國(guó)槐根莖腐爛病的5 種鐮刀菌的酶學(xué)特性進(jìn)行了分析，為鐮刀菌的分類和生理分化研究等提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，5 種鐮刀菌的可溶性蛋白含量及4種保護(hù)酶(EST、SOD、PPO和POD)活性的測(cè)定結(jié)果與電泳結(jié)果相一致，如5種鐮刀菌的SOD活性都很高，介于2 263.09～6 134.42 U/mg，電泳圖譜清晰，譜帶顏色較深、較明亮，說明電泳法可半定量地確定保護(hù)酶活性的大??；供試的5種鐮刀菌在可溶性蛋白和EST、SOD、PPO等同工酶水平上存在差異，不同鐮刀菌之間某些同工酶譜帶數(shù)和同一遷移率譜帶的亮度和色澤差異非常明顯，既存在共同譜帶又有特異性譜帶，如5種鐮刀菌EST同工酶圖譜的共同譜帶占23.5%，特異性譜帶占76.5%，說明5種供試病原菌均屬于鐮刀菌屬，但分屬于不同的鐮刀菌種。

鐮刀菌； 酶學(xué)； 可溶性蛋白； 同工酶； 酶活性

國(guó)槐(SophorajaponicaLinn.)是我國(guó)特有樹種，也是目前我國(guó)園林綠化的主要樹種之一。近年，國(guó)槐根莖腐爛病在山東聊城地區(qū)發(fā)病較重，導(dǎo)致成年國(guó)槐樹勢(shì)衰弱甚至死亡，嚴(yán)重影響了城市綠化和園林建設(shè)。聊城大學(xué)國(guó)槐衰弱原因研究小組前期研究證明，鐮刀菌(Fusariumsp.)是引起國(guó)槐根莖腐爛病的重要致病菌之一。

鐮刀菌是重要的植物病害致病菌，由于其種類多、變異性強(qiáng)，對(duì)其分類、防治等均比較困難。鐮刀菌作為一種生物，由細(xì)胞構(gòu)成，每個(gè)細(xì)胞又由于酶的存在表現(xiàn)出種種生命活動(dòng)，確保其新陳代謝正常進(jìn)行。鐮刀菌體內(nèi)酶越多、越完整，酶活性越高，其生命越健康，適應(yīng)性、侵染能力、致病能力和抗逆能力等越強(qiáng)。同工酶是催化相同的化學(xué)反應(yīng)，但酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)等各不相同的一類酶，其分子構(gòu)型的相似性可反映出生物種群間的親緣關(guān)系，表現(xiàn)出明顯的種屬、組織和發(fā)育階段的特異性，可為種和種以下分類提供理論依據(jù)[1-2]。本試驗(yàn)以引起國(guó)槐根莖腐爛病的5種鐮刀菌為靶標(biāo)，采用分光光度技術(shù)和同工酶技術(shù)，從酶學(xué)角度研究不同鐮刀菌的差異，為鐮刀菌的分類和生理分化研究、國(guó)槐根莖腐爛病的防治及相關(guān)研究等提供有力的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌及培養(yǎng)

供試病原菌為從國(guó)槐根莖腐爛病發(fā)病部位分離得到的5種鐮刀菌：多隔鐮刀菌(F.decemcellulare)、層生鐮刀菌(F.proliferatum)、木賊鐮刀菌(F.equiseti)、F.keratoplasticum和腐皮鐮刀菌(F.solani)，由聊城大學(xué)植物病理學(xué)研究室提供。利用PDA培養(yǎng)基于(25±1) ℃光照恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 d，備用。

1.2 酶蛋白的提取

用直徑7 mm的打孔器自菌落邊緣打取菌片，接種于PA培養(yǎng)液(250 mL三角瓶中裝有培養(yǎng)液100 mL)中，每瓶15個(gè)菌片，于(25±1)℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d。真空抽濾，剔除菌片，獲取菌絲，濾紙壓干。按王桂清等[3]的方法提取酶蛋白。

1.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

參照周先婉等[4]的考馬斯亮藍(lán)G-250染色法進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測(cè)定，以白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確吸取3倍稀釋的樣品0.1 mL，加入3 mL考馬斯亮藍(lán)G-250試劑，混合均勻后放置2 min。在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，在標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線上查得被測(cè)樣品的蛋白質(zhì)含量。

1.4 保護(hù)酶活性測(cè)定

酯酶(EST)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化物酶(POD)的活性測(cè)定參照王桂清等[5]、姬蘭柱等[6]的方法，多酚氧化酶(PPO)活性的測(cè)定參照肖婷等[7]的方法。

1.5 蛋白質(zhì)及同工酶電泳凝膠染色

參照胡能書等[8]的方法制膠并進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離。分離膠濃度為7.5%，濃縮膠濃度為3%；濃縮膠內(nèi)電泳電壓為80 V，分離膠內(nèi)電泳電壓為90 V。可溶性蛋白及同工酶凝膠染色方法參照王桂清等[3]的方法。

1.6 電泳圖譜的聚類分析

電泳后測(cè)量凝膠圖譜各譜帶的泳動(dòng)距離，計(jì)算每條譜帶的遷移率(Rf)。將電泳獲得的每一條譜帶的有無作為統(tǒng)計(jì)參數(shù)，采用有酶帶記為“1”、無酶帶記為“0”的方法，得到電泳的“0、1”矩陣。

Rf的計(jì)算公式如下：

Rf=固定染色后凝膠中酶蛋白區(qū)帶的遷移距離/固定染色后指示劑的遷移距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鐮刀菌可溶性蛋白含量及保護(hù)酶活性比較

5種鐮刀菌的可溶性蛋白含量差異顯著，多隔鐮刀菌的含量最高，為0.031 8 mg/mL，木賊鐮刀菌的含量最低，為0.008 9 mg/mL，前者是后者的3.57倍；腐皮鐮刀菌、層生鐮刀菌和F.keratoplasticum的含量依次為0.025 2 mg/mL、0.013 6 mg/mL和0.011 9 mg/mL，后兩者的可溶性蛋白含量比較接近，差異不顯著(圖1)。

標(biāo)注不同字母代表差異顯著(P<0.05),下同圖1 不同鐮刀菌的可溶性蛋白含量

多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum和腐皮鐮刀菌5種鐮刀菌的SOD活性依次為5 119.99 U/mg、2 263.09 U/mg、3 219.20 U/mg、5 182.41 U/mg和6 134.42 U/mg，除多隔鐮刀菌和F.keratoplasticum差異不顯著外，其余菌之間均差異顯著，其中，腐皮鐮刀菌的SOD活性最高，層生鐮刀菌的最低，前者是后者的2.71倍(圖2)。

供試的5種鐮刀菌的EST活性均很高且差異顯著。其中，多隔鐮刀菌的EST活性最高，為80 109.01 U/mg，木賊鐮刀菌的活性最低，為44 224.72 U/mg，前者是后者的1.81倍；層生鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的EST活性均為75 000 U/mg左右，差異不顯著；F.keratoplasticum的EST活性為58 571.43 U/mg，相對(duì)較低(圖3)。

圖2 不同鐮刀菌的SOD活性

圖3 不同鐮刀菌的EST活性

與SOD和EST 2種酶的活性比較，供試鐮刀菌的PPO活性整體水平較低。不同鐮刀菌間PPO活性差異顯著，其中，層生鐮刀菌的PPO活性最高，為191.18 U/mg，F(xiàn).keratoplasticum的活性最低，為82.77 U/mg，前者是后者的2.31倍(圖4)。

供試5種鐮刀菌的POD活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于SOD、EST和PPO的活性，變化幅度為0.77～2.58 U/mg。菌種間POD活性存在差異，其中，多隔鐮刀菌的活性最高，層生鐮刀菌的活性最低，前者是后者的3.34倍(圖5)。

圖4 不同鐮刀菌的PPO活性

圖5 不同鐮刀菌的POD活性

2.2 不同鐮刀菌的同工酶圖譜分析

供試5種鐮刀菌的可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜見圖6，根據(jù)圖譜統(tǒng)計(jì)出的電泳譜帶數(shù)量見表1。圖6和表1表明，5種鐮刀菌在可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜的譜帶數(shù)量上存在一定的差異。

圖譜從左到右依次為多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum、腐皮鐮刀菌圖6 不同鐮刀菌可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜表1 5種鐮刀菌可溶性蛋白及同工酶電泳圖譜分析結(jié)果

項(xiàng)目譜帶編號(hào)Rf鐮刀菌種類12345項(xiàng)目譜帶編號(hào)Rf鐮刀菌種類12345可溶性蛋白10.00510101EST10.0211100020.0111000020.0270100030.0271111130.0961111140.0331000140.1910001050.0381001150.2451000060.0431110160.2661000070.0541111170.2771111180.0651111180.33000011

續(xù)表1 5種鐮刀菌可溶性蛋白及同工酶電泳圖譜分析結(jié)果

注：鐮刀菌1、2、3、4、5分別為多隔鐮刀菌、層生鐮刀菌、木賊鐮刀菌、F.keratoplasticum、腐皮鐮刀菌。

可溶性蛋白標(biāo)記比較豐富，5 種鐮刀菌共分離出了30 條譜帶，其中，多隔鐮刀菌的譜帶最多，為25 條，其次為腐皮鐮刀菌(23條)、木賊鐮刀菌(15條)，層生鐮刀菌和F.keratoplasticum均13 條。共同譜帶有6 條，Rf值分別為0.027、0.054、0.065、0.087、0.130和0.913，占所有譜帶的20%；特異性譜帶有24 條，占所有譜帶的80%。由此可見，在可溶性蛋白方面供試5 種鐮刀菌間差異較大，生理分化明顯。

EST電泳圖譜共分離出了17條清晰且顏色比較深的譜帶，其中，共同譜帶有4 條，Rf值分別為0.096、0.277、0.383和0.511，占所有譜帶的23.5%，特異性譜帶有13條，占所有譜帶的76.5%，是標(biāo)記最豐富的同工酶圖譜之一。不同菌株之間譜帶數(shù)量差異較大，多隔鐮刀菌的譜帶最多，為11 條，木賊鐮刀菌的譜帶最少，為5條，譜帶在凝膠的上、中、下各部位都有分布。

SOD同工酶電泳產(chǎn)生的條帶數(shù)較少，共分離出了6 條清晰透明的譜帶，每種鐮刀菌的譜帶數(shù)均在3～5 條，其中，共同譜帶3 條，Rf值分別為0.333、0.417和0.479，占所有譜帶的50%。

病菌PPO電泳圖譜共分離出5 條譜帶，無共同譜帶，均為特異性譜帶。POD電泳結(jié)果表明，5 種鐮刀菌均沒有POD同工酶譜帶。

從電泳圖譜(圖2)還可以看出，不同鐮刀菌的可溶性蛋白和同工酶譜帶不僅數(shù)量上有差異，同時(shí)相同譜帶的顏色和寬度也有差異，表明酶活性不同，酶帶越寬、顏色越深，其酶活性越高。如EST，圖譜中多隔鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的譜帶顏色最深、酶帶最寬，兩者的酶活性也最高，分別為80 109.01 U/mg和76 034.39 U/mg；再如POD，圖譜中5種鐮刀菌均無譜帶，酶活性測(cè)定結(jié)果表明，五者的酶活性也均很低，均不高于2.58 U/mg。說明同工酶圖譜與酶活性測(cè)定結(jié)果相一致。

3 結(jié)論與討論

采用分光光度法和同工酶技術(shù)對(duì)引起成年國(guó)槐根莖腐爛病的5種鐮刀菌的酶學(xué)特性進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，5 種鐮刀菌之間可溶性蛋白含量及4 種保護(hù)酶(EST、SOD、PPO和POD)活性存在顯著差異，其中，可溶性蛋白含量較低，EST和SOD的活性較高，SOD活性在2 263.09～6 134.42 U/mg，EST活性在44 224.72～80 109.01 U/mg，PPO活性較低，在82.77～191.18 U/mg，而POD的活性最低，在0.77～2.58 U/mg；5 種鐮刀菌的可溶性蛋白和同工酶電泳圖譜在譜帶數(shù)量上存在差異，可溶性蛋白和EST的譜帶數(shù)量多，而POD無同工酶譜帶，同時(shí)不同菌在譜帶顏色和寬度上也存在差異，電泳結(jié)果與酶活性測(cè)定結(jié)果相一致，說明用電泳法既可鑒定某種保護(hù)酶有無同工酶，也可根據(jù)凝膠上電泳分離的酶帶的著色深淺與面積大小，半定量地確定該保護(hù)酶的活性大小。

可溶性蛋白是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其積累能提高細(xì)胞的保水能力，對(duì)細(xì)胞的生命物質(zhì)及生物膜起到保護(hù)作用。多隔鐮刀菌和腐皮鐮刀菌的可溶性蛋白含量相對(duì)較高，說明這2種鐮刀菌的適應(yīng)能力相對(duì)較強(qiáng)。

酶是生物體的組成成分，不斷在體內(nèi)新陳代謝，其催化作用包括正催化和負(fù)催化，活性受多方面的調(diào)控，以保障生命活動(dòng)中的各種化學(xué)反應(yīng)有條不紊、協(xié)調(diào)一致地進(jìn)行。絕大多數(shù)酶為蛋白質(zhì)，酶促反應(yīng)需要溫和的條件，高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、紫外線、有機(jī)溶劑、重金屬鹽、劇烈振蕩等易使蛋白質(zhì)變性的理化因素均可導(dǎo)致酶變性而失去催化活性。本研究所用靶標(biāo)——5種鐮刀菌，同一時(shí)間分離于國(guó)槐根莖腐爛部位，培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件一致，繼代次數(shù)相同，其酶蛋白提取和酶活性測(cè)定方法一致，酶活性調(diào)控因子和不利的理化因素不存在或系統(tǒng)誤差可忽略不計(jì)。研究結(jié)果表明，供試的5 種鐮刀菌在EST、SOD、PPO和POD等酶活性指標(biāo)上均存在差異，說明5 種供試鐮刀菌的適應(yīng)性、侵染能力、致病能力和抗逆能力等存在差異。

SOD在生物界的分布極廣，是重要的抗氧化酶，是氧自由基的自然天敵，可對(duì)抗與阻斷因氧自由基對(duì)細(xì)胞造成的損害，并及時(shí)修復(fù)受損細(xì)胞，其在生物體內(nèi)的水平高低意味著機(jī)體的抗氧化能力大小和衰老程度高低；SOD參與了生物體中幾乎所有的對(duì)抗各種環(huán)境脅迫的生理生化反應(yīng)，不良條件都會(huì)引起SOD活性的升高[9]。由SOD活性測(cè)定結(jié)果可以看出，5 種鐮刀菌菌體內(nèi)SOD活性都很高，介于2 263.09～6 134.42 U/mg，電泳圖譜清晰，譜帶顏色較深、較明亮，其原因可能是，5種鐮刀菌均來源于腐爛病發(fā)病嚴(yán)重的國(guó)槐莖和根，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量比較低，不能為病原菌提供適宜的水分、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及鹽分條件，病原菌處于逆境中，故SOD活性很高，以抵抗氧自由基對(duì)病原菌細(xì)胞造成的損害。至于具體是哪種或哪幾種逆境條件導(dǎo)致病原菌的SOD活性升高，有待于進(jìn)一步的研究。尤其是優(yōu)勢(shì)致病菌腐皮鐮刀菌的SOD活性高于其他4 種致病菌，也說明了腐皮鐮刀菌的致病性比較強(qiáng)。

PPO是廣泛存在于植物、動(dòng)物、真菌和細(xì)菌中的金屬蛋白酶，在生物體酶促褐變、色素的合成等過程中起著關(guān)鍵的作用，能有效催化多酚類化合物氧化生成相應(yīng)的醌類物質(zhì)。真菌等微生物產(chǎn)生PPO，需要適宜的碳源、氮源、pH值、溫濕度等環(huán)境條件。供試5種鐮刀菌雖然均來源于成年國(guó)槐，但分離部位不同，且寄主植物發(fā)病的嚴(yán)重程度不同，故5種鐮刀菌的PPO活性和同工酶圖譜存在一定的差異。

POD具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的作用，供試菌株的POD活性較SOD、EST和PPO都低，說明供試鐮刀菌體內(nèi)過氧化氫、酚類及胺類物質(zhì)的含量比較低，供試菌株所處的環(huán)境不利于病原菌POD的合成或者不利于POD底物的形成。

種間親緣關(guān)系可以用同工酶酶譜相似度預(yù)判，相似性系數(shù)越大，酶譜差異越小，表明物種間親緣關(guān)系越近[10]。EST常被用于物種的分類鑒定，EST同工酶圖譜和形態(tài)特征一樣，也是物種的基因型與環(huán)境效應(yīng)相互作用的表現(xiàn)型之一，其差異反映了基因型的差異，顯示出了物種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近[11]。本研究結(jié)果顯示，供試5種鐮刀菌的EST活性都比較高，同工酶圖譜譜帶數(shù)量多、顏色深，共同譜帶占23.5%，表明5種供試病原菌均屬于鐮刀菌屬；特異性譜帶占76.5%，說明5種供試病原菌分屬于不同的鐮刀菌種。李萍等[12]采用電泳技術(shù)分別對(duì)安徽不同地區(qū)的46個(gè)辣椒疫霉進(jìn)行EST同工酶分析發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉EST同工酶圖譜與致病力相關(guān)。本研究在采樣分離鑒定過程中發(fā)現(xiàn)，國(guó)槐根莖腐爛較嚴(yán)重，說明其病原菌或部分病原菌的致病性比較強(qiáng)，由于本試驗(yàn)沒有進(jìn)行致病性強(qiáng)弱的研究，故較高的EST活性和清晰的同工酶圖譜是否與致病性有關(guān)還有待于進(jìn)一步研究。

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Enzymatic Properties of Five DifferentFusariumSpecies

WANG Guiqing，MA Di

(College of Agronomy，Liaocheng University，Liaocheng 252059，China)

The enzymatic analysis of fiveFusariumspecies causing root rot disease of adult Chinese scholar tree was carried out by colorimetry and electrophoresis,to provide a theoretical basis for classification and study on physiological differentiation ofFusarium.The results showed that the assay results of soluble protein content and enzymatic activity of four protective enzymes (EST,SOD,PPO and POD) were consistent with their electrophoresis results of the fiveFusariumspecies.For example,the SOD enzyme activities of fiveFusariumspecies were very high,in the range of 2 263.09—6 134.42 U/mg,meanwhile,their electrophoretic patterns were clear,and the color of the spectra was darker and brighter,which indicated that the activity of protective enzymes could be semi-quantitatively determined by electrophoresis.The results also showed that a significant diversity ofFusariumspecies was found in terms of spectrum change of soluble protein and isozyme including EST,SOD and PPO among those strains,and the obvious difference in the number of bands and brightness and color of bands with the same Rf value was also detected,so there were both common bands and specific bands.The common bands of EST isozyme patterns of fiveFusariumspecies accounted for 23.5%,and the specific bands accounted for 76.5%.This indicates that the five pathogens are all members of the genusFusarium,but respectively belong to differentFusariumspecies.

Fusariumsp.; enzymology; soluble protein; isozyme; enzymatic activity

2016-10-19

山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2012CL17)；聊城市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014GJH10)

王桂清(1968-)，女，河北泊頭人，教授，博士，主要從事植物保護(hù)的教學(xué)與科研工作。 E-mail:wangguiqing@lcu.edu.cn

Q936

A

1004-3268(2017)04-0084-05