王 攀，劉運超，魏 薔，柴書軍，陳玉梅，張改平,3*

(1.西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100； 2.河南省農業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗室/農業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

狂犬病病毒G蛋白的原核表達及反應原性分析

王 攀1,2，劉運超2，魏 薔2，柴書軍2，陳玉梅2，張改平1,2,3*

(1.西北農林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100； 2.河南省農業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室/河南省動物免疫學重點實驗室/農業(yè)部動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；3.河南農業(yè)大學 牧醫(yī)工程學院,河南 鄭州 450002)

為優(yōu)化狂犬病病毒G蛋白的原核表達條件,探究其反應原性，參照狂犬病病毒CTN-1V10株編碼G蛋白基因序列，采用生物工程合成的方法合成編碼G蛋白的基因片段，并將該片段命名為G5F。將該片段與pET-28a原核表達載體連接，構建重組表達質粒pET-G5F，并將重組質粒進行誘導表達，在IPTG濃度為0.2 mmol/L、溫度為20 ℃、誘導12 h時，重組蛋白表達量最高。SDS-PAGE電泳及Western blot分析表明， G5F重組蛋白可溶性表達量高，且可以被抗狂犬病病毒單克隆抗體識別，反應原性良好。

狂犬病病毒； G蛋白； 可溶性表達； 反應原性

狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus,RABV)引起的，是最致命的傳染病之一，死亡率接近100%[1]。RABV是狂犬病毒屬(Lyssavirusgenus)彈狀病毒科(Rhabdoviridae family)的單股負鏈RNA病毒，可引起人類、家畜及野生動物急性腦膜炎而導致死亡，并可在大多數哺乳動物中廣泛傳播[2]?？袢≈饕ㄟ^被RABV感染動物的撕咬、抓撓受傷而感染。我國狂犬病的主要傳播源是被RABV感染的狗和貓等[3]。當前，尚無有效的狂犬病治療方法，及時接種相關的各類狂犬病疫苗可在很大程度上有效控制狂犬病[4]?？袢〔《净蚪M全長約12 kb，編碼核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基質蛋白(M)、糖蛋白(G)、RNA依賴的RNA聚合酶(L)結構蛋白[5]。其中，RABV G蛋白存在于病毒囊膜內外兩側，形成跨膜結構，在RABV表面形成一些纖突(spikes)[6-8]， G 蛋白是RABV唯一暴露在病毒表面的蛋白質及唯一糖基化的蛋白質，同時也是唯一誘導機體產生中和抗體的蛋白質[9]。 研究表明，該蛋白質的抗原區(qū)域有8 個抗原結合簇，這8個表位依次是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、a和 G1[10]。其中，除Ⅵ和 G1 抗原結合簇外，其他抗原結合簇在RABV滅活后仍然可被檢測到。G蛋白具有與細胞表面受體結合以及決定病毒親嗜神經組織特性等的功能，G蛋白大約含 524 個aa，其N端是由19 個aa組成的信號肽段，這個序列在RABV轉錄過程中被切去。因此，成熟的G蛋白中不含該區(qū)域[11]。成熟的G蛋白含有 505 個aa，其分子質量約為62 ku。G蛋白含3個中和抗原表位，在 RABV 吸附過程中起到重要作用，其通過與細胞表面受體的相互作用而促進快速吸附。G蛋白能激活特異性輔助性T細胞(helper T cells,Th)和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxiclymphocyte,CTL)。研究證實，G蛋白上存在T細胞線性和空間依賴性表位[12]。綜上可知，G蛋白可有效誘發(fā)機體的免疫反應，尤其是細胞免疫反應。這個特性是后續(xù)針對該蛋白質開展相關研究和新型亞單位疫苗研發(fā)的重要理論依據。

基因工程亞單位疫苗(subunit vaccine),又稱重組亞單位疫苗(recombinat subunit vaccine)，是利用現代分子生物學技術和生物工程的方法，將某病毒特定的所需基因片段克隆重組到相應的表達載體中，制備相應的重組質粒，并將其導入特定的所需細胞培養(yǎng)，使目的蛋白大量表達，可將佐劑加入優(yōu)化表達后的目的蛋白，經乳化設備乳化，制得相應的疫苗。由于此類疫苗只含有病毒的某種或某幾種特定抗原，不含其他遺傳物質，理論上可以使動物獲得保護性免疫。且不含有病毒的感染性組分，無需滅活，致病性風險低，安全性很高[13]。可見，G蛋白既是RABV中最有效的保護性抗原，也是研究基因工程亞單位疫苗的首選抗原。

為了探究G蛋白的相關特性，本研究擬采用大腸桿菌表達系統(tǒng)對狂犬病病毒G蛋白進行優(yōu)化表達。大腸桿菌是目前應用最廣泛的蛋白質表達系統(tǒng)，具有培養(yǎng)操作簡單、轉化效率高、價格相對經濟、生長培養(yǎng)速度快、可大量生產所需蛋白質等優(yōu)點[14]， 一般狀況下，其針對外源基因的表達產物水平遠遠高于其他生物表達系統(tǒng)[15]。本研究中選用的大腸桿菌pET-28a載體，自帶6×His標簽。His標簽基本不改變蛋白質的生物結構及蛋白質的溶解性，同時可以簡化蛋白質純化步驟[16]。鑒于此，本研究在大腸桿菌中表達RABV G蛋白，以期獲得具有活性的重組G蛋白，旨在為RABV基因工程亞單位疫苗的研發(fā)奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 載體和目的片段的合成

表達重組載體pET-28a購自Life Seneors公司；大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109和BL21 (DE3) 購自大連寶生物公司?？袢〔《綠蛋白基因序列參照大腸桿菌密碼子偏愛性進行優(yōu)化，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，并將該片段命名為G5F。

1.2 主要試劑

NdeⅠ和XholⅠ DNA限制性內切酶購自美國新英格蘭生物公司；抗His標簽單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗、RABV單克隆抗體均購自美國Abcam公司；AEC(3-Amino-9ethylcar-bazole)顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司；IPTG購自INALCO公司；質粒抽提試劑盒購自Omega公司；T4 DNA連接酶、DNA純化回收試劑盒、Primestar Max DNA聚合酶均購自TaKaRa公司；標準分子質量蛋白質Marker購自索萊寶公司。

1.3 RABV G蛋白基因序列的優(yōu)化及其表達引物的設計與合成

根據GenBank中公布的狂犬病病毒G蛋白基因序列(AEV43285)，按照大腸桿菌密碼子偏愛性及mRNA結構等信息優(yōu)化RABV病毒G蛋白的基因序列，設計表達用引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司進行合成。

表1 G5F片段的PCR擴增引物

注：下劃線為酶切位點。

1.4 原核表達載體的構建

以合成的G5F片段為模板、G5F-F/G5F-R為引物進行PCR擴增，反應條件為：95 ℃預變性3 min； 95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環(huán)；72 ℃充分延伸10 min，取PCR產物10 μL進行核酸電泳，并觀察結果。紫外燈下切膠回收目的片段，用DNA限制性內切酶NdeⅠ、XholⅠ 酶切消化G5F片段和pET-28a載體。將消化后的載體和基因片段按照1︰5的比例用T4 DNA連接酶連接，16 ℃水浴6 h進行連接。將連接產物轉化入感受態(tài)細胞DH5α，挑取單克隆菌落接種于含卡那霉素(Kan+)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取菌液PCR結果為陽性的重組質粒，送生工生物(上海)股份有限公司進行測序鑒定。將測序正確的陽性菌株命名為pET-G5F，然后將該陽性質粒轉化入感受態(tài)細胞BL21(DE3)中，經菌液PCR鑒定成功后用于后續(xù)的蛋白質表達試驗。

1.5 重組蛋白G5F的誘導表達與Western blot鑒定

將pET-G5F重組質粒按照1︰1 000比例接種于含有100 μg/mL Kan+的LB液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)過夜。第2天以1︰100比例將此菌液再接種于含有100 g/mL Kan+的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD450值約為0.6時，加入誘導劑IPTG使誘導菌液終濃度為1.0 mmol/L，繼續(xù)誘導12 h。收集菌液，10 000 r/min離心10 min，倒去上層液體培養(yǎng)基，加入10 mL PBS Buffer重懸瓶底菌體沉淀。將重懸后的菌體用超聲破碎儀進行超聲破碎：φ2變幅桿，工作3 s，間歇5 s，工作時間20 min。破碎后將液體分裝，10 000 r/min離心15 min，分離上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳檢測。電泳結束后取出凝膠，將分離膠轉移到用甲醇和轉膜緩沖液浸泡好的硝酸纖維膜上，將膜置于5%脫脂奶中，4 ℃封閉過夜。一抗為1︰5 000稀釋的抗His標簽單克隆抗體，37 ℃孵育1 h，然后用PBST洗膜3次，每次5 min；二抗為1︰1 000稀釋的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗膜3次，每次5 min，雙蒸水洗凈后再用AEC顯色試劑盒進行顯色。

1.6 重組蛋白的誘導表達條件優(yōu)化

取pET-G5F陽性菌液加入含Kan+的液體LB培養(yǎng)基中，置于37 ℃、220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時，加入IPTG進行誘導表達。分別對IPTG誘導溫度、誘導時長、IPTG誘導濃度進行優(yōu)化。在誘導時長優(yōu)化試驗中，分別選擇誘導4、8、12、16、20 h收集菌液(IPTG終濃度為1.0 mmol/L、溫度37 ℃)；在IPTG誘導濃度優(yōu)化試驗中，分別選擇0.1～1.0 mmol/L共10個濃度梯度(溫度37 ℃、誘導時長12 h)；誘導溫度的優(yōu)化試驗分別選擇15、20、25、37 ℃溫度梯度(IPTG終濃度為0.2 mmol/L、誘導時長12 h)。收集菌液，表達產物分別用SDS-PAGE電泳檢測，以確定重組蛋白的最佳誘導條件。

1.7 Western blot檢測重組蛋白G5F的反應原性

將含有目的蛋白的SDS-PAGE膠轉移至硝酸纖維膜上，5%脫脂奶封閉，洗膜后加入1︰2 500稀釋的RABV單克隆抗體為一抗，37 ℃孵育1 h，洗膜3次，再加入1︰5 000稀釋的羊抗鼠二抗，37 ℃孵育45 min，PBST洗膜3次，雙蒸水洗凈后用AEC顯色。

2 結果與分析

2.1 G5F片段的擴增與原核表達質粒鑒定

從圖1可以看出，擴增得到約1 884 bp的條帶，與預期目的條帶大小相符。經NdeⅠ和XholⅠ雙酶切的G5F片段和載體pET-28a用T4 DNA連接酶連接，將重組質粒轉化至大腸桿菌JM109。隨機挑取單克隆菌落，用菌液PCR方法進行驗證，結果顯示，在1 884 bp處出現條帶(圖2)。經PCR鑒定為陽性的菌液，提取其質粒DNA后，進行測序鑒定。測序結果與合成的序列一致，表明重組質粒pET-G5F構建成功。

M.DL2000 DNA Marker； 1.G5F 擴增產物圖1 G5F片段的PCR擴增結果

M.DL2000 DNA Marker； 1.pET-G5F重組質粒圖2 重組質粒pET-G5F的菌液PCR鑒定

2.2 G5F重組蛋白的誘導表達及可溶性分析結果

SDS-PAGE結果(圖3)表明，經IPTG誘導后，分子質量約為65 ku的蛋白質大量表達，且大部分以可溶性形式存在，大小與G5F重組蛋白的理論分子質量相符。表明目的蛋白G5F能夠在大腸桿菌中表達，且大部分以可溶性形式存在。

Western blot結果(圖4)顯示，65 ku處條帶能夠與His單抗特異性結合。進一步表明，G5F重組蛋白成功表達。

2.3 重組蛋白G5F的誘導表達條件優(yōu)化結果

分別對pET-G5F菌液的誘導溫度、誘導時間、IPTG濃度進行優(yōu)化，結果(圖5)顯示，誘導12 h和16 h時，目的蛋白表達量并無太大差異，16 h以后，無關蛋白質表達量開始增加，故選擇12 h作為誘導時長。

M.蛋白質Marker； 1、2分別為pET-G5F在20 ℃未誘導時的超聲上清、沉淀； 3、4分別為pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲上清、沉淀圖3 重組蛋白G5F的SDS-PAGE分析

M.蛋白質Marker； 1、2分別為pET-G5F在20 ℃ 未誘導時的超聲上清、沉淀； 3、4分別為 pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲上清、沉淀圖4 重組蛋白G5F誘導表達的Western blot分析

M.蛋白質Marker； 1—5分別為經4、8、12、16、20、24 h 誘導表達的pET-G5F圖5 pET-G5F經不同時間誘導的表達結果

通過對IPTG誘導濃度進行優(yōu)化發(fā)現，當IPTG濃度為0.1 mmol/L時，目的蛋白表達量較低，明顯低于0.2 mmol/L IPTG時的誘導表達量；同時，當IPTG濃度高于0.2 mmol/L時，目的蛋白表達量并無顯著提高(圖6)。因此，選擇0.2 mmol/L作為IPTG誘導濃度。

M.蛋白質Marker； 1.未誘導菌液； 2—11分別為用終濃度0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mmol/L 的IPTG誘導表達的G5F重組蛋白圖6 pET-G5F經不同IPTG濃度誘導的表達結果

通過對誘導表達溫度進行優(yōu)化發(fā)現，37 ℃誘導時，上清中重組蛋白含量不高；當溫度降至15 ℃時，目的蛋白表達量較20 ℃時低(圖7)。因此，選擇20 ℃作為誘導溫度。

M.蛋白質Marker； 1.未誘導菌液上清； 2—5分別為在15、20、25、 37 ℃時表達的G5F重組蛋白圖7 pET-G5F經不同溫度誘導的表達結果

2.4 Western blot鑒定重組蛋白的反應原性

從圖8可以看出，在65 ku處出現相應的特異條帶，與預期的G5F重組蛋白大小一致。可見，表達的G5F重組蛋白能被抗RABV單克隆抗體識別，具有良好的反應原性。

M.蛋白質Marker； 1.pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲上清； 2.pET-G5F在20 ℃誘導表達時的超聲沉淀圖8 重組蛋白G5F的反應原性分析

3 結論與討論

RABV G蛋白是多年來針對狂犬病研究的熱點，同時也是新型基因工程亞單位疫苗的研究熱點。His標簽帶有6個組氨酸殘基(咪唑基)，有利于重組蛋白誘導表達后的進一步純化。由于His標簽是若干個AA殘基的多肽，一般對蛋白質的結構不會改變過多[17]。目前，His標簽已經廣泛應用于多種表達系統(tǒng)重組蛋白的表達和純化，如大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞等。其純化條件有時可以跨越很大的pH值范圍，甚至可以在如尿素、鹽酸胍、非離子型變性劑等嚴苛環(huán)境中正常進行[18]。此外，有研究結果表明，帶有His標簽的融合蛋白在進行SDS-PAGE分析時會出現分子質量比實際值偏大的情況，這種情況可能是由于His融合標簽中的His為堿性氨基酸，含較多的正電荷，導致目的重組蛋白在電泳過程中速度降低[19]。在本研究中，SDS-PAGE 電泳結果表明，重組G蛋白分子質量比理論值略大，試驗結果符合預期。G5F重組蛋白具有較好的水溶性。

本研究利用pET-28a表達載體在大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21 (DE3)中成功表達了 RABV G蛋白，通過優(yōu)化表達條件，重組蛋白可溶性表達效果較好，且該重組蛋白與RABV單克隆抗體有良好的反應原性，為進一步研究RABV G蛋白的功能及進行新型基因工程亞單位疫苗的制備奠定了基礎。

[1] Fontana D,Kratje R,Etcheverrigaray M,etal.Immunogenic virus-like particles continuously expressed in mammalian cells an a veterinary rabies vaccine candidate[J].Vaccine,2015,33(35):4238-4246.

[2] Li X,Luo J,Wang S,etal.Engineering,expression,and immuno-characterization of recombinant protein comprising multi-neutralization sites of rabies virus glycoprotein[J].Protein Expression and Purification,2010,70(2):179-183.

[3] Davis A,Jarvis J,Pouliott C,etal.Susceptibility and pathogenesis of little brown bats(Myotislucifugus) to heterologous and homologous rabies viruses[J].Journal of Virology,2013,87(16):9008-9015.

[4] 李露,王化磊,趙國星,等.3株我國狂犬病病毒街毒株在細胞和乳鼠腦內的培養(yǎng)及生長特性[J].中國生物制

品學雜志,2014,27(5):612-616.

[5] Johnson N,Cunningham A,Fooks A.The immune response to rabies virus infection and vaccination[J].Vaccine,2010,28(23):3896-3901.

[6] Coulon P,Rollin P,Flamand A.Molecular basis of rabies virus virulence.Ⅱ.Identification of a site on the CVS glycoprotein associated with virulence[J].The Journal of General Virology,1983,64(Pt3):693-696.

[7] Wunner W,Reagan K,Koprowski H.Characterization of saturable binding sites for rabies virus[J].Journal of Virology,1984,50(3):691-697.

[8] Delagneau J F,Perrin P,Atanasiu P.Structure of the rabies virus:Spatial relationships of the proteins G,M1,M2 and N[J].Ann Inst Pasteur Virol,1981,132:473-493.

[9] 羅金燕,馬志永.狂犬病病毒G蛋白的結構和功能[C]//中國畜牧獸醫(yī)學會.中國畜牧獸醫(yī)學會2009學術年會論文集(下冊).北京:[出版者不詳],2009.

[10] Nagaraja T,Madhusudana S,Desai A.Molecular characterization of the full-length genome of a rabies virus isolate from India[J].Virus Genes,2008,36(3):449-459.

[11] Lentz T,Burrage T,Smith A,etal.Is the acetylcholine receptor a rabies virus receptor[J].Science,1982,215:182-184.

[12] Dietzschold B,Li J,Faber M,etal.Concepts in the pathogenesis of rabies[J].Future Virology,2008,3(5):481-490.

[13] 殷相平.動物狂犬病基因工程亞單位疫苗研究[D].蘭州:甘肅農業(yè)大學,2011:32-33.

[14] Nuc P,Nuc K.Recombinant protein production inEscherichiacoli[J].Postepy Biochem,2006,52(4):448-456.

[15] Dong X,Tang B,Li J,etal.Expression and purification of intact and functional soybean(Glycinemax) seed ferritin complex inEscherichiacoli[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,18(2):299-307.

[16] Hochuli E,Bannwarth W,Dobeli H,etal.Genetic approach to facilitate purification of recombinant proteins with a novel metal chelate adsorbent[J].Biotechnology,1988,6(11):1321-1325.

[17] 崔超,呼延霆,尹大川.重組標簽蛋白在蛋白質純化中的研究進展[J].現代生物醫(yī)學進展,2014,14(32):6372-6378.

[18] Chaga G.Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography:Past,present and future[J].Journal of Biochemical and Biophysical Methods,2001,49(1/2/3):313-334.

[19] 唐威華,張景六,王宗陽.SDS-PAGE法測定His-tag融合蛋白分子量產生偏差的原因[J].植物生理學報,2010,33(1):65-69.

Prokaryoticexpression and Immunoreactivity Analysis of Rabies G Protein

WANG Pan1,2，LIU Yunchao2，WEI Qiang2，CHAI Shujun2，CHEN Yumei2，ZHANG Gaiping1,2,3*

(1.College of Veterinary Medicine,Northwest A&F University,Yangling 712100,China; 2.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences/Henan Provincial Key Laboratory of Animal Immunology/Key Laboratory of Animal Immunology of Ministry of Agriculture,Zhengzhou 450002,China;3.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Henan Agricultural University,Zhengzhou 450002,China)

To optimize the prokaryotic expression condition and the immunoreactivity of the rabies virus G protein(RABV G protein).Herein G protein coding genes section G5F was successfully synthesized with biological engineering synthesis method,using the rabies virus CTN-1V10 strain as a template.The recombinant plasmid was constructed by cloning the G5F gene into pET-28a,and then the plasmid was transformed intoE.coliBL21(DE3)competent cells.Highest protein expression level was achieved when induced with 0.2 mmol/L IPTG at 20 ℃ for 12 h.The results of SDS-PAGE and Western blot showed that RABV G protein was expressed as a soluble recombinant protein,and it could be recognized by anti-RABV monoclonal antibody，which revealed a good immunoreactivity of this protein.

RABV； G protein； soluble protein expression； immunoreactivity

2016-11-06

河南省重大科技專項(141100110100)

王 攀(1988-)，男，河南鄭州人，在讀碩士研究生，研究方向：獸醫(yī)免疫學。E-mail：dennis1999@126.com

*通訊作者：張改平(1960-)，男，河南內黃人，研究員，博士，主要從事動物免疫學及重大疫病快速檢測技術研究。 E-mail：zhanggaiping2003@163.com

S855.3

A

1004-3268(2017)04-0108-05