張 晶李文祥鄒 紅李 明王桂堂吳山功

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 中國(guó)科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

草魚不同組織膽汁酸組成分析

張 晶1,2李文祥1,2鄒 紅1李 明1,2王桂堂1,2吳山功1,2

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所, 中國(guó)科學(xué)院水生生物多樣性與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

膽汁酸是由膽固醇通過一系列酶促反應(yīng)在肝細(xì)胞中合成的, 根據(jù)側(cè)鏈羥基數(shù)目的多少膽汁酸分為初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸。初級(jí)膽汁酸隨食物到達(dá)腸道, 在腸道微生物的作用下脫羥基形成次級(jí)膽汁酸[1]。初級(jí)膽汁酸和次級(jí)膽汁酸都可與?；撬峄蛘吒拾彼峤Y(jié)合形成結(jié)合型膽汁酸。肝臟中合成的以及經(jīng)由腸肝循環(huán)回到肝臟的膽汁酸都被儲(chǔ)存在膽囊中。膽汁酸的主要生理功能是幫助脂溶性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收, 高脂肪的攝入刺激膽汁酸合成酶基因的表達(dá)[2]。除此之外, 膽汁酸可作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)能量代謝[3]。

草魚(Ctenopharyngodon idellus)是重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 2013年我國(guó)草魚養(yǎng)殖產(chǎn)量達(dá)到5.07×109kg[4]。草魚養(yǎng)殖過程中受到各種病害的威脅, 其中肝膽綜合癥是目前草魚養(yǎng)殖過程中危害嚴(yán)重的一種疾病[5]。患病草魚肝臟顏色發(fā)白或發(fā)黃, 膽囊腫大, 但該病的發(fā)病機(jī)理尚不清楚。陸生脊椎動(dòng)物的研究發(fā)現(xiàn), 肝膽疾病的發(fā)生常伴隨有膽汁酸的代謝異常[6], 例如肝硬化病人與健康人糞便膽汁酸含量相比差異顯著[7]。膽汁酸可通過“腸-肝軸”調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的代謝以及肝臟炎癥進(jìn)程, 在肝臟損傷和自我修復(fù)過程中起重要作用[8]。因此, 草魚肝膽綜合癥的發(fā)生可能與膽汁酸含量的變化有關(guān)系, 但迄今我們對(duì)草魚膽汁酸的研究尚處于空白。本研究運(yùn)用超高效液相色譜-三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定草魚體內(nèi)膽汁酸含量, 為解析草魚肝膽綜合癥發(fā)病機(jī)制提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器試劑

所用儀器為超高效液相色譜——三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用儀。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備需要以下標(biāo)準(zhǔn)品: 膽酸(Cholic acid, CA)、脫氧膽酸(Deoxycholic acid, DCA)、鵝脫氧膽酸(Chenodeoxycholic acid, CDCA)、熊脫氧膽酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)、甘氨酸結(jié)合膽酸(Glycocholic acid, G-CA)、石膽酸(Lithocholic acid, LCA)、甘氨酸結(jié)合熊脫氧膽酸(Glycoursodeoxycholic acid, G-UDCA)和甘氨酸結(jié)合石膽酸(Glycolithocholic acids, G-LCA)購(gòu)自美國(guó)CATO, ?；撬峤Y(jié)合脫氧膽酸鹽(Sodium taurodeoxy-cholic, TDC)和牛磺酸結(jié)合鵝脫氧膽酸鹽(Sodium taurochenodeoxycholic, TCDC)購(gòu)自美國(guó)SIGMA, 甲醇、乙腈和乙酸銨為色譜純, 購(gòu)自美國(guó)TEDIA。樣品處理過程中所用乙醇為分析純, 購(gòu)自中國(guó)上海國(guó)藥。

1.2 樣品采集及處理

2014年9月于武漢市水產(chǎn)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)基地一魚塘和武漢市江夏多福農(nóng)場(chǎng)兩魚塘每個(gè)魚塘取3條草魚。3個(gè)取樣點(diǎn)的平均體長(zhǎng)分別為(50±1.3)、(39.8±0.6)和(43.8±0.9) cm, 平均體重分別為(1628.4±45.8)、(978.4± 77.6)和(1172.0±17.7) g。肥滿度是反應(yīng)魚體肥瘦程度和生長(zhǎng)情況的指標(biāo), 計(jì)算公式為K=(W/L3)×100其中W為體重(g), L為體長(zhǎng)(cm)。

魚體消毒后尾靜脈取血, 無菌剝離肝臟、膽囊和腸道組織。將肝臟組織剪碎裝入2 mL無菌離心管中, 并用注射器收集膽汁。草魚腸道按照倪達(dá)書[9]方法分為前、中、后三段, 分別取中腸和后腸內(nèi)容物混勻后裝入5 mL離心管中。樣品-80℃保存。

1.3 膽汁酸測(cè)定

腸道及肝臟樣品的處理參考Hagio的方法[10]。稱取100 mg磨碎后的樣品加入1 mL乙醇, 超聲破碎后加熱使蛋白沉淀, 并用乙醇萃取3次, 將萃取液置于氮?dú)饬飨? 35℃吹干。吹干后的樣品復(fù)溶于200 μL甲醇中并用C18固相萃取小柱純化。用冰乙腈沉淀法萃取血清中的膽汁酸。直接取100 μL膽汁樣品用C18固相萃取小柱純化。所有純化后的樣品需氮?dú)獯蹈珊蠖ㄈ? 4℃保存。

超高效液相色譜條件如下: 進(jìn)樣盤溫度和柱溫分別為10℃和40℃; 流動(dòng)相流速為0.35 mL/min, 每次進(jìn)樣量5 μL。流動(dòng)相A為10 mmoL/L乙酸銨, pH 4.0; 流動(dòng)相B為乙腈, 流動(dòng)相A的梯度程序(A%)為0—10min, 70%; 10—11min, 30%; 11—13min, 70%。質(zhì)譜采用電噴霧電離模式, 檢測(cè)模式為多反應(yīng)檢測(cè); 毛細(xì)管電壓為2500 V,脫溶劑氣溫度為350℃; 脫溶劑氣大小為650 L/H。每種膽汁酸的質(zhì)譜條件見表 1。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)的方式來表示。用SPSS 20進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 采用單因素方差分析(ANOVA)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 如果檢測(cè)到顯著性差異,則采用Duncan多重比較, 用Pearson相關(guān)系數(shù)表示兩個(gè)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性, P＜0.05被認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

肝臟中初級(jí)膽汁酸檢測(cè)到CA, 其平均濃度達(dá)到(728.68±303.11) ng/mg, 并未檢測(cè)到CDCA; 在肝臟中沒有檢測(cè)到次級(jí)膽汁酸。膽汁中檢測(cè)到的主要膽汁酸有初級(jí)膽汁酸CA和CDCA, 平均含量分別為(11.23±5.00)和(0.83±0.36) ng/μL; 次級(jí)膽汁酸DCA, 平均含量為(0.14± 0.07) ng/μL (圖 1)。在個(gè)別膽汁樣品中檢測(cè)到G-CA、TDC和T-CDC, 所有膽汁樣品中都沒有檢測(cè)到UDCA、LCA、G-UDCA和G-LCA。

腸道內(nèi)容物中共檢測(cè)到9種膽汁酸CA、CDCA、DCA、UDCA、LCA、T-CDC、T-DC、G-CA和G-UDCA。中腸和后腸內(nèi)容物中主要膽汁酸是CA, 其平均含量分別為(6.54±2.30)和(1.23±0.57) ng/mg(圖 2)。腸道檢測(cè)到的主要次級(jí)膽汁酸是DCA和UDCA, 在中腸內(nèi)容物中平均含量分別是(0.13±0.09)和(0.3±0.18) ng/mg; 在后腸內(nèi)容物中平均含量分別是(0.08±0.04)和(0.2±0.09) ng/mg。只在個(gè)別腸道樣品中檢測(cè)到LCA, 但其結(jié)合物G-LCA則完全沒有檢測(cè)到。草魚血清中沒有檢測(cè)到膽汁酸。

單因素方差分析顯示中腸和后腸內(nèi)容物中CA和GCA含量差異顯著(P＜0.05); CDCA、DCA、UDCA、TDC、T-CDC及G-UDCA含量差異不顯著(P＞0.05)。將草魚的肥滿度與所檢測(cè)到的膽汁酸做相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肥滿度與膽汁中總膽汁酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.748, P＜0.05)。進(jìn)一步將草魚肥滿度與膽汁中初級(jí)膽汁酸做相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)肥滿度與CA和CDCA的含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.741, P＜0.05; r=-0.712, P＜0.05)。除此之外, 肥滿度與中腸內(nèi)容物中CA含量也呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.698, P＜0.05)。

表 1 不同種類膽汁酸的質(zhì)譜條件Tab. 1 The mass spectrometry conditions of different bile acids

3 討論

3.1 草魚組織膽汁酸種類

人類肝臟合成CA與CDCA的量幾乎相等, 但在老鼠和熊體內(nèi)CDCA分別轉(zhuǎn)化為m-CA(鼠膽酸)和UDCA[11]。本研究在草魚肝臟中沒有檢測(cè)到CDCA, 但在膽汁中檢測(cè)到了, 因此推測(cè)草魚只合成少量的CDCA或者合成的CDCA部分轉(zhuǎn)化為其他形式的膽汁酸。肝臟不能直接合成次級(jí)膽酸鹽, 因此草魚膽汁中檢測(cè)到的次級(jí)膽汁酸DCA及T-DC為經(jīng)過腸肝循環(huán)后被肝臟重新吸收的。

圖 1 膽汁中主要膽汁酸含量Fig. 1 The concentration of bile acids in gallA為水產(chǎn)科學(xué)研究所試驗(yàn)基地魚塘樣品, B和C分別為江夏多福農(nóng)場(chǎng)兩個(gè)魚塘A stands for the samples from the base of aquatic science institute. B and C represent for the samples from two ponds in Duo Fu farm, respectively

草魚中腸內(nèi)容物中CA與G-CA的含量顯著高于后腸(P＜0.05), 而次級(jí)膽汁酸DCA、UDCA、T-DC及GUDCA含量差異不顯著, 證實(shí)膽汁酸在隨食物經(jīng)過腸道的過程中存在重吸收作用[12]。在腸道中, 一部分膽汁酸在微生物的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)榇渭?jí)膽汁酸, 產(chǎn)膽酸鹽脫氫酶的細(xì)菌大多為擬桿菌門(Bacteroidetes)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、胃瘤球菌屬(Rumminococcus)和大腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的一些細(xì)菌[1], 而擬桿菌(Bacteroides)是草魚腸道的優(yōu)勢(shì)類群[13,14], 草魚腸道的DCA、UDCA、T-DC及G-UDCA可能主要是在擬桿菌的作用下生成的。

哺乳動(dòng)物腸道次級(jí)膽汁酸主要是DCA和LCA[15], 我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示草魚腸道主要次級(jí)膽汁酸是DCA和UDCA, 只在個(gè)別腸道樣品中檢測(cè)到LCA。膽汁中的次級(jí)膽汁酸DCA為經(jīng)過腸肝循環(huán)后回到膽囊中的, 但在膽汁中并未檢測(cè)到次級(jí)膽汁酸UDCA, 可能的原因是腸道對(duì)膽汁酸的吸收有一定的選擇性[16]。

血液中的膽汁酸主要來自腸道的吸收, 但血液中的膽汁酸會(huì)被肝臟快速吸收, 血液中膽汁酸的含量通常很低(小于10 μmol/L)[17]。我們的研究在草魚血清中沒有發(fā)現(xiàn)膽汁酸, 這可能是由于草魚血清膽汁酸含量較低而沒有檢測(cè)到的緣故。

3.2 草魚肥滿度與膽汁酸含量的關(guān)系

圖 2 腸道膽汁酸含量Fig. 2 The concentration of bile acids in intestinal圖M為中腸內(nèi)容物膽汁酸含量, 圖H后腸樣品膽汁酸含量; A, B, C為三個(gè)取樣點(diǎn)M and H described the concentrations of bile acids in the midgut and hindgut respectively. A, B and C stand for the three sampling points

草魚肝膽綜合癥的主要原因之一是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的過度積累。研究表明CA具有調(diào)節(jié)能量消耗的作用[18]。本研究將草魚的肥滿度與所檢測(cè)到的膽汁酸做相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)肥滿度與膽囊中膽汁酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)膽汁中CA和CDCA含量與肥滿度呈負(fù)相關(guān)關(guān)系, 即魚越胖體內(nèi)CA和CDCA含量越低。這個(gè)結(jié)果與Suzuki等[19]的研究一致, 他們發(fā)現(xiàn)正常人體脂含量與體內(nèi)膽汁酸含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系; 另外, 在牛蛙的飼料中添加一定量的膽汁酸, 可降低牛蛙的體脂含量[20]。本研究說明若在飼料中添加適量的CA或CDCA, 則可以調(diào)節(jié)草魚的能量代謝, 減少脂肪在草魚肝臟的積累, 從而可以降低草魚肝膽綜合癥的發(fā)病率。

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AN ANALYSIS OF BILE ACID COMPOSITION IN DIFFERENT TISSUES OF GRASS CARP (CTENOPHARYNGODON IDELLUS)

ZHANG Jing1,2, LI Wen-Xiang1,2, ZOU Hong1, LI Ming1,2, WANG Gui-Tang1,2and WU Shan-Gong1,2
(1. The Key Laboratory of Aquatic Biodiversity and Conservation of Chinese Academy of Sciences, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

草魚; 膽汁酸; 肝膽綜合癥

Grass carp; Bile acid; Liver and gallbladder syndrome

Q174

A

1000-3207(2017)02-0479-04

10.7541/2017.60

2016-03-14;

2016-07-15

國(guó)家自然科學(xué)基金(31372571、31272706)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31272706, 31372571)]

張晶(1990—), 女, 河北石家莊人, 碩士研究生; 研究方向?yàn)槟c道微生物與疾病。E-mail: zhjing926@126.com

吳山功, 副研究員; E-mail: wusgz@ihb.ac.cn