李春艷黃 貝熊 靜彭喜霞梁 英聶 品黃文樹,

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廈門 361021; 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心, 廈門 361021; 3. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 4. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 廈門 361005)

日本鰻鱺TLR21基因的鑒定、免疫應(yīng)答與啟動(dòng)子分析

李春艷1,2黃 貝1,2熊 靜1,2彭喜霞1,2梁 英1,2聶 品1,3黃文樹1,2,4

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 廈門 361021; 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心, 廈門 361021; 3. 中國科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 4. 福建省海洋生物資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心, 廈門 361005)

為研究TLR21 (Toll like receptor 21)在低等脊椎動(dòng)物中的功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制, 我們擴(kuò)增獲得了日本鰻鱺TLR21 (AjTLR21)cDNA序列, 其編碼的蛋白具有TLR家族的共同特征。AjTLR21基因結(jié)構(gòu)與其他魚類和兩棲類TLR21相同, 由單個(gè)外顯子編碼。熒光定量結(jié)果顯示, AjTLR21在血液、鰓、脾臟、中腎等11個(gè)組織/器官中轉(zhuǎn)錄表達(dá), 其中在血液中表達(dá)量最高。經(jīng)Poly I:C誘導(dǎo)后8h, AjTLR21在脾臟和中腎中的表達(dá)量顯著性上調(diào);誘導(dǎo)后16h, AjTLR21在血液、鰓、腸和脾臟中的表達(dá)量顯著性上調(diào)(P＜0.05)。雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示,在AjTLR21 5′上游調(diào)控序列-1179 bp到+117 bp存在Poly I:C調(diào)節(jié)的正調(diào)控元件。經(jīng)Edwardsiella tarda誘導(dǎo)后16h和72h, AjTLR21分別在血液和中腎組織的表達(dá)量顯著性上調(diào), 表明AjTLR21同時(shí)也參與了抗細(xì)菌免疫應(yīng)答,其在機(jī)體免疫系統(tǒng)中的功能具有多樣性。研究對(duì)于理解日本鰻鱺AjTLR21的免疫學(xué)功能具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

日本鰻鱺; TLR21; 基因表達(dá); 免疫應(yīng)答; 啟動(dòng)子

天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體抵御病原入侵的第一道防線, Toll樣受體(Toll like receptors, TLRs)是天然免疫系統(tǒng)中的重要成分之一[1]。TLRs是可識(shí)別入侵微生物的病原相關(guān)分子模式(Pathogen associated molecular patterns, PAMPs), 包括細(xì)菌的脂多糖、脂肽、肽聚糖、糖脂、鞭毛蛋白、核苷酸等成分;真菌的酵母聚糖, 磷脂甘露糖、甘露聚糖等成分;寄生蟲的甘油肌磷脂、瘧原蟲色素、弓形體膠原蛋白樣分子(Profilin-like molecule)等成分; 病毒DNA、雙鏈/單鏈RNA分子、外殼蛋白等[2]。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白, 其胞外區(qū)為多個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列(Leucine-rich repeat, LRR), 主要行使識(shí)別功能。胞內(nèi)區(qū)含TIR結(jié)構(gòu)域(Toll-IL-1 receptor domain, TIR結(jié)構(gòu)域), 可募集同樣含有TIR結(jié)構(gòu)域的銜接分子如髓樣分化因子88 (Myeloid differentiation primary response gene 88, MyD88)或β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白[Toll/interleukin 1 receptor (TIR)-domain-containing adaptor protein inducing interferonβ, TRIF]等, 通過級(jí)聯(lián)反應(yīng), 將信號(hào)向下游傳遞, 進(jìn)而調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[3]。

迄今為止, 在人類中共克隆獲得10個(gè)TLR基因(TLR1—10, 其中TLR11為假基因)[4], 而硬骨魚類中目前已鑒定獲得了至少17種不同的TLR。其中, TLR14及TLR19—23、TLR25、TLR26是首先在硬骨魚類中被克隆、鑒定[5,6]。TLR21基因最早發(fā)現(xiàn)于河豚中, 且在人和小鼠基因組中未能發(fā)現(xiàn)其直系同源物, 一度被認(rèn)為是一個(gè)魚類特有的TLR基因[7]。此后, 研究人員相繼從爪蟾[8]和紅原雞[9,10]中鑒定獲得了該基因。鳥類TLR21定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)溶酶體, 其功能與哺乳動(dòng)物TLR9類似, 參與識(shí)別病原微生物的CpG寡脫氧核苷酸。由于缺乏鳥類TLR9基因, TLR21被認(rèn)為是TLR9的替代者[10], 有趣的是,魚類同時(shí)具有中TLR9和TLR21基因[11]。斑馬魚TLR21和TLR9具有相似的表達(dá)模式, 在胚胎發(fā)育早期就能檢測到其表達(dá)。在成魚中, TLR21和TLR9大量表達(dá)于免疫相關(guān)組織中, 包括腸、脾臟和腎臟[12]。斑馬魚TLR9廣泛識(shí)別不同基序的CpG-ODN。相比于其他CpG-ODN, 包含GACGTT或AACGTT基序的CpG-ODN可顯著上調(diào)TLR9介導(dǎo)的NF-κB的活化, 而斑馬魚TLR21則對(duì)包含GTCGTT基序的CpGODN的響應(yīng)最為強(qiáng)烈[12]。已有研究表明, 魚類TLR21基因的表達(dá)具有多樣性。斑點(diǎn)叉尾TLR21基因廣泛表達(dá)于除肌肉外的各組織器官中[13]; 斜帶石斑魚TLR21基因主要表達(dá)于頭腎、中腎、脾臟和心臟中, 刺激隱核蟲感染后, 斜帶石斑魚的皮膚和鰓組織中TLR21基因表達(dá)量顯著上調(diào)[14]。牙鲆TLR21基因主要表達(dá)于鰓和脾臟中, 在血液、心臟, 肌肉中的表達(dá)量較低, 而在頭腎組織中表達(dá)量最低。鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、CpG ODN和Poly I:C均可上調(diào)牙鲆TLR21基因的表達(dá)[15]。

鰻鱺(Anguilla spp.)是我國重要的養(yǎng)殖魚類, 特別是近十年來, 鰻鱺養(yǎng)殖發(fā)展迅速, 2014年, 我國鰻鱺產(chǎn)量近2.2×108kg, 主要集中在福建、廣東和江西三省[16]。由于養(yǎng)殖所需鰻苗完全依靠天然捕撈,在鰻苗資源逐年下降的背景下, 病害防治在鰻鱺養(yǎng)殖中的地位尤顯重要。目前, 有關(guān)鰻鱺免疫反應(yīng)機(jī)理的研究較為匱乏, 對(duì)于鰻鱺免疫系統(tǒng)如何識(shí)別病原, 及針對(duì)所識(shí)別病原引發(fā)的免疫反應(yīng)的分子機(jī)理未見報(bào)道。本研究首次克隆獲得了日本鰻鱺TLR21基因, 并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、在不同病原感染狀態(tài)下的表達(dá)規(guī)律以及啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了初步分析。本研究結(jié)果有助于深入了解鰻鱺的抗病機(jī)制, 奠定其病害防治的免疫學(xué)基礎(chǔ)。另一方面, 對(duì)不同進(jìn)化類群魚類的免疫系統(tǒng)的研究, 可豐富魚類先天免疫的理論, 有助于認(rèn)識(shí)脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的進(jìn)化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

日本鰻鱺(203±53) g購于福建省集美大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地, 實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)2周, 養(yǎng)殖水溫 (28±2)℃。采樣前用0.05%的丁香酚麻醉。采集血液、鰓、心臟、肝臟、腸、胃、脾臟、中腎、鰾、皮膚和性腺用以研究AjTLR21在不同組織中的分布。免疫刺激實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置: 設(shè)PBS對(duì)照組、Poly I:C刺激組(1 mg/100 g魚, Sigma)、LPS刺激組(1 mg/100 g魚, Sigma)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)刺激組(2×107cfu/100 g魚)。分別在腹腔注射8h、16h、 24h和72h后采樣, 每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取鰻鱺8尾,每尾魚分別采集上述組織/器官用以研究免疫刺激后AjTLR21的基因表達(dá)變化。采集血液及組織/器官樣品的處理參考本實(shí)驗(yàn)室以前的研究[17]。

1.2 基因組DNA、RNA提取以及cDNA合成

采用MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0試劑盒(TaKaRa, 日本)提取日本鰻鱺基因組DNA?？俁NA提取參照Trizol?reagent試劑盒說明書。利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA/DNA的完整性, 采用分光光度計(jì)NanoDrop 2000 (Thermo, 美國)檢測RNA或DNA的濃度及純度。

脾臟總RNA經(jīng)RNase-free DNase Ⅰ (New England Biolabs Inc, 美國)處理后, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit (Clontech, 美國)合成第一鏈, 制備RACE PCR模板。

參照GoScripTMReverse Transcription System反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega, 美國)說明書, 取4 μg各組織總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄用以制備熒光定量模板。所制備模板用1×TE buffer稀釋后保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 日本鰻鱺TLR21 cDNA、基因組以及啟動(dòng)子序列克隆

以斑馬魚TLR21基因作為種子序列, 對(duì)日本鰻鱺基因組數(shù)據(jù)(GenBank登錄號(hào): AVPY00000000.1)進(jìn)行比對(duì), 利用Primer Premier 6.0 軟件對(duì)所獲得最佳匹配序列的潛在編碼區(qū)設(shè)計(jì)引物(表 1)。以脾臟cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為: cDNA 1 μL, 上下游引物(表 1, 10 μmol/L)各1 μL, Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL, HSTMKit, 東盛生物)0.25 μL, 2 ×HSTMReaction Mix 12.5 μL, 補(bǔ)充無菌水至總體積為25 μL, 反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min后; 94℃變性30s, 56℃退火30s, 72℃延伸 2min, 運(yùn)行35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。根據(jù)獲得的中間片段設(shè)計(jì)RACE引物, 參照SMARTer試劑盒說明書進(jìn)行PCR,獲得AjTLR21 cDNA全長。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性3min后; 94℃變性30s, 62℃退火30s, 72℃延伸2min, 運(yùn)行7個(gè)循環(huán); 94℃ 變性30s, 60℃ 退火30s, 72℃ 延伸2min, 18個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。從第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中取1 μL做為第二輪PCR反應(yīng)的模板, 反應(yīng)條件同上, PCR反應(yīng)運(yùn)行35個(gè)循環(huán)。

以肌肉基因組DNA為模板, 引物Ex_TLR21_F和Ex_TLR21_R (表 1)進(jìn)行擴(kuò)增AjTLR21基因組全長。PCR反應(yīng)體系: 基因組DNA 1 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, LA Taq DNA聚合酶(5 U/μL, TaKaRa, 日本)0.25 μL, 10 × LA PCR Buffer Ⅱ(Mg2+Plus) (TakaRa, 日本)2.5 μL, dNTP Mixture (2.5 mmol/L)4 μL, 補(bǔ)充無菌水至總體積為25 μL。反應(yīng)條件為: 94℃ 預(yù)變性3min; 94℃ 變性30s, 64℃退火30s, 72℃ 延伸2min, 35個(gè)循環(huán), 72℃延伸10min。

根據(jù)本地比對(duì)到的基因組序列, 設(shè)計(jì)5′側(cè)翼序列引物, 以肌肉基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用JASPAR數(shù)據(jù)庫(http://jaspar.genereg.net/)分析其潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。根據(jù)位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(表 1), 構(gòu)建全長及5個(gè)缺失表達(dá)載體并分別命名為pGL-3-TLR21P1－ pGL-3-TLR21P6。

1.4 AjTLR21的轉(zhuǎn)錄表達(dá)研究

熒光定量PCR在Lightcycler 480 Ⅱ PCR儀(Roche, 德國)上進(jìn)行。參照Lightcycler 480 SYBR Green I試劑盒(Roche, 德國)說明設(shè)置PCR反應(yīng)體系, 體系如下: cDNA模板4 μL, 正反向引物(qTLR21F/ qTLR21R, 10 μmol/L)各0.25 μL, LightCycler 480 SYBR Green I Master (2×) 10 μL, 補(bǔ)充水至20 μL。反應(yīng)條件: 95℃變性20 s, 58℃退火 20s, 72℃延伸25s, 80℃采集熒光信號(hào), 運(yùn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后分析擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線, 檢驗(yàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。

以β-actin作為內(nèi)參基因。梯度稀釋已知拷貝數(shù)的AjTLR21和β-actin質(zhì)粒樣品, 與組織/器官樣品同時(shí)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 計(jì)算擴(kuò)增的濃度以及引物擴(kuò)增效率。AjTLR21基因表達(dá)量用βactin進(jìn)行校準(zhǔn); 刺激前后AjTLR21基因表達(dá)倍數(shù)變化是根據(jù)同一時(shí)間點(diǎn)(實(shí)驗(yàn)組AjTLR21基因表達(dá)量)/ (對(duì)照組AjTLR21基因表達(dá)量)來表示[18]。

數(shù)據(jù)用Excel軟件和DPS軟件進(jìn)行計(jì)算, 用單因素方差分析法和Student t test分析不同組織樣品和免疫原刺激樣品間AjTLR21表達(dá)量差異。P＜0.05表示差異顯著, P＜0.01和P＜0.001表示差異極顯著。利用GraphPad.Prism.v5.0軟件進(jìn)行作圖。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因分析

將回收純化后的PCR產(chǎn)物TLR21P1-TLR21P6和熒光素酶報(bào)告基因pGL-3-Basic載體(Promega公司)經(jīng)過BglⅡ/KpnⅠ雙酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后, 利用T4 DNA連接酶將目的片段和載體連接, 構(gòu)建獲得AjTLR21啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體, 并將其分別命名為pGL-3-TLR21P1 (-1875/+117)、pGL-3-TLR21P2 (-1555/+117)、pG-L3-TLR21P3 (-1179/+117)、pGL-3-TLR21P4 (-907/+117)、pGL-3-TLR21P5 (-635/+117)、pGL-3-TLR21P6 (-332/+ 117)。

表 1 所用引物序列Tab. 1 Primers used in the study

用Endo-free Plasmid Mini Kit Ⅱ試劑盒(Omega, 美國)提取質(zhì)粒。細(xì)胞轉(zhuǎn)染利用Lipofectamine3000試劑盒(Invitrogen, 美國), 按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1天, 細(xì)胞以1×104/孔的密度接種于24孔板上。HEK293在含10%胎牛血清、100 Units/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基(Gibco, 美國)中培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為37℃、5% CO2, 細(xì)胞用0.25%胰蛋白酶-EDTA (Gibco, 美國)進(jìn)行消化傳代。轉(zhuǎn)染時(shí), pGL-3-TLR21P1-pGL-3-TLR21P6或pGL-3 Basic與pRL-TK共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞, 其中pRL-TK作為內(nèi)參質(zhì)粒。用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System (E1910)進(jìn)行樣品熒光素酶活性檢測。

1.6 序列生物信息學(xué)分析

圖 1 日本鰻鱺TLR21和其他脊椎動(dòng)物TLR21基因結(jié)構(gòu)及TIR結(jié)構(gòu)域的比較Fig. 1 Comparative analysis in gene structure and TIR domain of TLR21 in vertebrates多重比對(duì)灰色部分表示TIR結(jié)構(gòu)域上3個(gè)保守基序: Box1-Box3在序列上方注釋; 序列上方的箭頭表示TIR結(jié)構(gòu)域二級(jí)結(jié)構(gòu)中的β折疊,矩形框表示α螺旋The grey parts in the alignments indicate three conserved motifs of TIR domain, Box1-Box3 that annotated above the sequence. The arrows above the sequence represent β folding structure of TIR domain, and the boxes represent α helix

如圖 1, 用NCBI網(wǎng)站中的Blast (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行序列查找, 利用ExPASy的翻譯工具(http://web.expasy.org/translate/)推導(dǎo)AjTLR21的氨基酸序列, ExPASy (http://web.expasy. org/compute_pi/)預(yù)測分子量和pI值, 用SignalP 4.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析信號(hào)肽, 用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi)預(yù)測LRRs、TIR結(jié)構(gòu)域和跨膜區(qū); Phyre2程序(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi？id=index)預(yù)測AjTLR21 TIR結(jié)構(gòu)域的二級(jí)結(jié)構(gòu)。利用DNAman軟件對(duì)AjTLR21的TIR結(jié)構(gòu)域進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì), 應(yīng)用MEAG6.0軟件, 采用鄰位相接法(NJ法)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其他魚類基因組數(shù)據(jù)來源于Ensembl數(shù)據(jù)庫(http:// asia.ensembl.org/index.html)。

2 結(jié)果

2.1 日本鰻鱺TLR21基因序列分析

日本鰻鱺TLR21cDNA全長為4013 bp (AjTLR 21 GenBank登錄號(hào): KU950320), 其中開放閱讀框(ORF)2937 bp, 5′ UTR 447 bp, 3′ UTR 629 bp。ORF編碼978個(gè)氨基酸, 其分子量為112.60 kD, pI為8.92。基因結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示, AjTLR21的結(jié)構(gòu)類似于其他魚類TLR21, 由單個(gè)外顯子編碼。氨基酸序列結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示, AjTLR21由胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)構(gòu)成, 其胞外區(qū)含有一個(gè)信號(hào)肽、14個(gè)LRRs, 各LRR都包含“LxxLxLxxN”這一共同基序;跨膜區(qū)為單次跨膜, 屬于Ⅰ型跨膜蛋白; 胞內(nèi)區(qū)含有TIR結(jié)構(gòu)域, 并含有3個(gè)典型基序: Box1 (FDAFISY), Box2 (LCY/LxxRDxLPG), Box3 (FW)(圖 1)。序列同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示AjTLR21成熟肽的氨基酸序列與大西洋鮭相似性達(dá)68.2%; 其次為條石鯛和蟾胡鯰, 分別為65.74%和65.33% (表 2)。AjTLR21的TIR結(jié)構(gòu)域也是與大西洋鮭相似性最高, 其次為蟾胡鯰和斑點(diǎn)叉尾。將硬骨魚類TLR21和其他脊椎動(dòng)物TLRs氨基酸序列用MEGA6.0軟件構(gòu)建了NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(Jones Taylor Thornton model, JTT模型)。系統(tǒng)進(jìn)化樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)表明: 脊椎動(dòng)物TLR21聚為一枝, 然后再與魚類TLR19、TLR20、TLR22、TLR23、TLR26以及小鼠TLR11聚為一枝, 并與小鼠其他TLR分開(圖 2)。

2.2 AjTLR21基因在不同組織中的分布

定量結(jié)果顯示, AjTLR21在所檢測的不同組織/器官中均有轉(zhuǎn)錄表達(dá), 其中血液中的表達(dá)量最高,其平均表達(dá)量是β-actin的0.13倍(圖 3), 性腺中的表達(dá)量最低。

表 2 各物種TLR21的序列信息和相似性Tab. 2 Sequence information and similarity of TLR21

圖 2 魚類TLR21及脊椎動(dòng)物TLRs系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of teleost TLR21 and vertebrate TLRs節(jié)點(diǎn)上的數(shù)字表示為bootstrap的置信度。所用序列的Gen-Bank登錄號(hào)如下: 斜帶石斑魚TLR21 AEK49148.1; 條石鯛TLR21 AIT52504.1; 牙鲆TLR21 AFW04263.1; 羅非魚TLR21 AHK 13949.1; 紅鰭東方鲀TLR21 AAW69371.1; TLR22 AAW69372.1; TLR23 AAW70378.1; 蟾胡鯰TLR21 AGM39445.1; 草魚TLR20 AHH85805.1; TLR21 AGM21642.1; 斑馬魚TLR21 NP_0011-86264.1; TLR22 AAI63527.1; 日本鰻鱺TLR21 KU950320; 紅原雞TLR21 NP_001025729.1; 斑點(diǎn)叉尾TLR19 AEI59675.1; TLR20.1 AEI59676.1; TLR22 AEI59679.1; TLR26 AEI59681.1;大西洋鮭TLR19 CDH93609.2; TLR20a CDH93610.2; TLR20d CDH93613.1; TLR21 CDH93614.1; 鯉TLR20 AHN49762.1; 小鼠TLR1 AAG37302.1; TLR2 EDL15415.1; TLR3 AAH99937.1; TLR4 EDL31078.1; TLR5 AAI25248.1; TLR6 BAA78632.1; TLR7 AAI32386.1; TLR8 EDL40710.1; TLR9 EDL21125.1; TLR11 AAI09165.1Bootstrap values are indicated at nodes. GenBank accession numbers are as follows: E. coioides TLR21 AEK49148.1; O. fasciatus TLR21 AIT52504.1; P. olivaceus TLR21 AFW04263.1; O. niloticus TLR21 AHK13949.1; T. rubripes TLR21 AAW69371.1; TLR22 AAW69372.1; TLR23 AAW70378.1; C. batrachus TLR21 AGM39445.1; C. idella TLR20 AHH85805.1; TLR21 AGM21642.1; D. rerio TLR21 NP_001186264.1; TLR22 AAI63527.1; A. japonica TLR21 KU950320; G. gallus TLR21 NP_001025729.1; I. punctatus TLR19 AEI59675.1; TLR20.1 AEI59676.1; TLR22 AEI59679.1; TLR26 AEI59681.1; S. salar TLR19 CDH93609.2; TLR20a CDH93610.2; TLR20d CDH93613.1; TLR21 CDH93614.1; C. carpio TLR20 AHN49762.1; M. musculus TLR1 AAG37302.1; TLR2 EDL15415.1; TLR3 AAH99937.1; TLR4 EDL31078.1; TLR5 AAI25248.1; TLR6 BAA78632.1; TLR7 AAI32386.1; TLR8 EDL40710.1; TLR9 EDL21125.1; TLR11 AAI09165.1

2.3 免疫刺激后AjTLR21的基因表達(dá)變化

日本鰻鱺在感染遲緩愛德華氏菌后, 其血液中的AjTLR21的表達(dá)量在16h上調(diào)7.66倍(P＜0.05)。而感染72h后, 其中腎組織中AjTLR21的表達(dá)量上調(diào)5.83倍(P＜0.01)(圖 4)。Poly I:C能顯著誘導(dǎo)AjTLR21的上調(diào)表達(dá)。在刺激8h后, 脾臟中AjTLR21的表達(dá)量極顯著性上調(diào)(P＜0.01)并達(dá)到最高水平, 為對(duì)照組的6.44倍, 隨后開始下降, 在16h后, Poly I:C刺激組的表達(dá)量為對(duì)照組的。Poly I:C刺激后16h, AjTLR21在血液、皮膚、鰓、腸和腎中的表達(dá)量顯著上調(diào),分別為對(duì)照組的5.76、3.32、5.47、5.83和4.40倍(圖 5)。

2.4 AjTLR21啟動(dòng)子活性分析

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)我們所擴(kuò)增得到的AjTLR21 5′側(cè)翼序列中所包含的潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)其中含有C/EBP-β、AP-1、STAT 、NF-κB、IRF、Sp-1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(圖 6A)。對(duì)所獲得的TLR21 5′調(diào)控序列進(jìn)行刪除突變。將截短后的片段與載體pGL-3 Basic相連, 構(gòu)建重組質(zhì)粒, 即pGL-3-TLR21P1－ pGL-3-TLR 21P6。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中, 利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示, pGL-3-TLR21P1－pGL-3-TLR21P5的熒光素酶活性均顯著高于對(duì)照組, 分別為對(duì)照組的2.28、2.81、5.51、2.79、4.06倍(P＜0.01), 其中pGL-3-TLR21P3的熒光素酶活性最高, 推測在該區(qū)域(-635/-332)具有控制AjTLR21啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的關(guān)鍵片段(圖 6B)。此外, 在Poly I:C(50 μg/mL)刺激下, 轉(zhuǎn)染pGL-3-TLR21P3的HEK293細(xì)胞的熒光素酶活性升高, 為對(duì)照組的2.59倍(圖 6C)。

3 討論

本研究首次從日本鰻鱺中克隆得到了TLR21基因, 并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式和啟動(dòng)子活性等進(jìn)行了初步的研究。AjTLR21基因結(jié)構(gòu)與已報(bào)道的硬骨魚類、兩棲類TLR21基因結(jié)構(gòu)類似, 其編碼區(qū)無內(nèi)含子[8,11,13,14,19,20]。而鳥類TLR21基因由兩個(gè)外顯子構(gòu)成[21]。序列相似性比對(duì)分析結(jié)果顯示脊椎動(dòng)物TLR21的胞外區(qū)的相似性為58%—63%, 跨膜區(qū)的相似性為44%—81%, 胞內(nèi)區(qū)TIR結(jié)構(gòu)域的相似性為64%—91%。這表明相比于其胞外區(qū)和跨膜區(qū), TLR21的TIR結(jié)構(gòu)域在脊椎動(dòng)物進(jìn)化的過程中更為保守。已有的研究揭示, TLR基因的胞外區(qū)主要由2—25個(gè)LRR結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 負(fù)責(zé)識(shí)別病原相關(guān)分子模式[22]。AjTLR21胞外區(qū)含有14個(gè)LRR重復(fù)序列, 除第6個(gè)LRR外, 其LRR重復(fù)序列中都含有典型的LxxLxLxxN基序, LRR6中第三位的亮氨酸被疏水性的苯丙氨酸所替代。在LxxLxLxxN基序中, 其側(cè)鏈中3個(gè)位置十分保守的亮氨酸用以形成疏水性核心, 天冬氨酸則可保持蛋白整體結(jié)構(gòu)。其中亮氨酸偶有被疏水性氨基酸, 如纈氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸所替代, 末端的天冬氨酸可被蘇氨酸、絲氨酸和半胱氨酸所替代[4]。AjTLR21胞內(nèi)段的TIR結(jié)構(gòu)域含有3個(gè)保守的基序, Box1-Box3, 其中Box1與Box2形成β折疊, 主要參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo); Box3則形成α螺旋, 可與細(xì)胞骨架的相互作用, 介導(dǎo)受體在細(xì)胞內(nèi)的定位[23,24]。位于Box2中的脯氨酸對(duì)TLR分子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至關(guān)重要, 突變該位點(diǎn)的小鼠TLR4對(duì)LPS的刺激無應(yīng)答[23,25]。斑馬魚TLR21 TIR結(jié)構(gòu)域Box2的C827、R831和L835突變后, 對(duì)CpGODN的刺激無應(yīng)答[12]。對(duì)魚類TLR21序列比對(duì)結(jié)果顯示, 日本鰻鱺TLR21分子的TIR結(jié)構(gòu)域都具有這些保守的基序, 表明其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制可能類似于斑馬魚TLR21和其他脊椎動(dòng)物TLRs。

圖 3 TLR21基因在健康日本鰻鱺不同組織/器官中相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Expression of TLR21 in different tissues/organs from Japanese eelβ-actin為內(nèi)參基因, 誤差線表示平均數(shù)±SEM (N≥3)β-actin served as an internal control. Vertical bars indicating the mean±SEM (N≥3)

圖 4 日本鰻鱺TLR21在遲緩愛德華氏菌刺激后的表達(dá)變化Fig. 4 Expression of AjTLR21 following the E. tarda stimulation in Japanese eel檢測腹腔注射遲緩愛德華菌8、16、24和72h后日本鰻鱺的血液、皮膚、鰓、腸、脾臟和中腎組織中AjTLR21表達(dá)量; 以β-actin為內(nèi)參基因; 星號(hào)表示誘導(dǎo)組和對(duì)照組存在顯著性差異(*P＜0.05, **P＜0.01); 誤差線表示平均數(shù)±SEM; N≥4The fish were injected intraperitoneally with E. tarda and tissues, such as blood, skin, gill, intestine spleen and kidney, were collected at 8, 16, 24 and 72 hour post injection for expression analysis. β-actin served as an internal control. The asterisk (*) indicates the significant difference between induced and control group (*P＜0.05, **P＜0.01). Vertical bars represented the mean±SEM (N≥4)

圖 5 日本鰻鱺TLR21在Poly I:C刺激后的表達(dá)變化Fig. 5 Expression of AjTLR21 following the Poly I:C stimulation in Japanese eel檢測腹腔注射Poly I:C 8、16、24和72h后日本鰻鱺的血液、皮膚、鰓、腸、脾臟和中腎組織中AjTLR21表達(dá)量; 以β-actin 為內(nèi)參基因; 星號(hào)表示誘導(dǎo)組和對(duì)照組存在顯著性差異(*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001)。誤差線表示平均數(shù)±SEM; N≥4The fish were injected intraperitoneally with Poly I:C and tissues, such as blood, skin, gill, intestine spleen and kidney, were collected at 8, 16, 24 and 72 hour post injection for expression analysis. β-actin served as an internal control. The asterisk (*) indicates the significant difference between induced and control group (*P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001). Vertical bars represented the mean±SEM (N≥4)

圖 6 AjTLR21啟動(dòng)子活性分析Fig. 6 Analysis of AjTLR21 promoter activityA. AjTLR21的5′調(diào)控序列的潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及報(bào)告基因構(gòu)建模式圖, pGL-3-TLR21P1 (-1875/+117)、pGL-3-TLR21P2(-1555/+ 117)、pGL-3-TLR21P3(-1179/+117)、pGL-3-TLR21P4(-907/+117)、pGL-3-TLR21P5(-635/+117)、pGL-3-TLR21P6(-332/+117); B.在HEK293細(xì)胞中轉(zhuǎn)染AjTLR21啟動(dòng)子缺失質(zhì)粒; C. 用Poly I:C刺激HEK293細(xì)胞后的pGL-3-TLR21P3熒光素酶活性的變化。以pRLTK為內(nèi)參, 誤差線表示平均數(shù)±SEM (N=4); 星號(hào)表示存在顯著性差異(***P＜0.001)A. Schematic representation of AjTLR21 promoter construct and serial deletion constructs, pGL-3-TLR21P1 (-1875/+117, pGL-3-TLR21P2(-1555/+117), pGL-3-TLR21P3 (-1179/+117), pGL-3-TLR21P4 (-907/+117), pGL-3-TLR21P5 (-635/+117), pGL-3-TLR21P6 (-332/+117); B. HEK293 cells were cotransfected with the serial promoter constructs and pRL-TK which served as an internal control. C. Luciferase activity of pGL-3-TLR21P3 in HEK293 cells after stimulated by Poly I:C. pRL-TK was performed as an internal control. Vertical bars represented the mean±SEM (N=4). Asterisks (*) above each bar indicate significant difference (***P＜0.001)

已有的研究表明, TLR21在不同硬骨魚中有不同表達(dá)模式。TLR21主要在大西洋鱈的腎臟、肝臟、鰓和精巢中表達(dá)[20]; 而草魚TLR21則在皮膚組織中表達(dá)量最高, 其次為脾臟和腸[26]。牙鲆TLR21在鰓和皮膚組織中表達(dá)量最高, 在頭腎組織中表達(dá)量最低[15]。大西洋鮭TLR21主要在脾臟、鰓、頭腎、肌肉和肝臟中表達(dá)。在本研究中, 熒光定量結(jié)果顯示日本鰻鱺TLR21基因在所檢測的不同組織/器官中均有轉(zhuǎn)錄表達(dá), 其中血液中的表達(dá)量最高,其次為鰓、脾臟, 在性腺中表達(dá)量最低。Yeh等[12]通過體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 斑馬魚TLR21主要參與識(shí)別含有GTCGTT基序的CpG寡脫氧核苷酸, 而對(duì)Poly I:C, LPS等無應(yīng)答。在本研究中, 我們發(fā)現(xiàn)Poly I:C能顯著誘導(dǎo)日本鰻鱺脾臟組織AjTLR21上調(diào)表達(dá),在刺激8h后, 其表達(dá)量最高。啟動(dòng)子活性分析進(jìn)一步證實(shí)了Poly I:C能顯著誘導(dǎo)AjTLR21的表達(dá)。日本鰻鱺感染遲緩愛德華菌后, 其血液和中腎組織中的AjTLR21表達(dá)量也顯著上調(diào)。Gao等[15]發(fā)現(xiàn)牙鲆TLR21在Poly I:C刺激或鰻弧菌感染1h后, 其表達(dá)量顯著上調(diào), 在鰻弧菌感染4h后達(dá)到高峰。此外, 草魚感染呼腸孤病毒3h后, 其在鰓組織中TLR21基因顯著上調(diào)表達(dá), 嗜水氣單胞菌可顯著上調(diào)草魚肝臟、脾臟中TLR21的表達(dá)[26]。條石鯛虹彩病毒、遲緩愛德華菌以及海豚鏈球菌均可顯著誘導(dǎo)石鯛脾臟組織中TLR21基因的上調(diào)表達(dá), 表明TLR21參與了機(jī)體抗病毒、抗細(xì)菌的免疫應(yīng)答[27]。有趣的是,在感染刺激隱核蟲的斜帶石斑魚的皮膚和鰓組織中, TLR21基因的表達(dá)量顯著上調(diào)[14]。這表明魚類TLR21在免疫系統(tǒng)中功能的具有多樣性。已有的研究揭示, TLR11家族成員多以異源二聚體形式行使其免疫識(shí)別的功能[28]。TLR21屬于TLR11家族, 魚類TLR21基因?qū)Χ喾N免疫刺激物都有應(yīng)答, 其免疫功能的多樣性是否源自于此, 亦或是TLR21基因的上調(diào)表達(dá)是機(jī)體為應(yīng)對(duì)病原微生物感染所作出的次級(jí)應(yīng)答, 還有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。

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MOLECULAR CLONING AND CHARACTERIZATION OF TLR21 GENE FROM JAPANESE EEL, ANGUILLA JAPONICA

LI Chun-Yan1,2, HUANG Bei1,2, XIONG Jing1,2, PENG Xi-Xia1,2, LIANG Ying1,2, NIE Pin1,3and HUANG Wen-Shu1,2,4
(1. College of Fisheries, Jimei University, Xiamen 361021, China; 2. Engineering Research Center of the Modern Technology for Eel Industry, Ministry of Education PRC, Xiamen 361021, China; 3. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China; 4. Fujian Collaborative Innovation Center for Development and Utilization of Marine Biological Resources, Xiamen 361005, China)

Toll like receptor 21 (TLR21) is a non-mammalian Toll-like receptor that recognizes unmethylated CpG DNA to trigger innate immune responses against pathogenic microorganism infection. The present study cloned the full-length cDNA sequence of TLR21 (AjTLR21) from Japanese eel, Anguilla japonica, which had the common characteristics of Toll like receptors (TLRs). The intronless AjTLR21 shared similar gene structure with other vertebrate TLR21 genes. AjTLR21 widely expressed in all examined tissues/organs with the highest expression in blood. Poly I:C treatment significantly induced the expression of AjTLR21 in spleen and kidney at 8 hours and in blood, gill, intestine and spleen at 16 hours (P＜0.05). Luciferase reporter assay exhibited that the 5′ flanking region of the AjTLR21 contains positive regulatory elements for Poly I:C induced AjTLR21 expression. The stimulation of Edwardsiella tarda also increased the expression of AjTLR21 in blood and kidney at both 16h and 72h, suggesting an important role in anti-bacterium immune response. Our results revealed multiple effects of teleosts TLR21 in immune system, which has important theoretical significance and application value to understand the immunological function of AjTLR21.

Anguilla japonica; TLR21; Expression; Immune response; Promoter

Q344+.1

A

1000-3207(2017)02-0296-10

10.7541/2017.36

2016-04-25;

2016-07-20

福建省自然科學(xué)基金(2014J05042、2012J06008); 國家自然科學(xué)基金(31402329、31174238和U1205123)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of Fujian Province (2014J05042, 2012J06008); the National Natural Science Foundation of China (31402329, 31174238 and U1205123)]

李春艷(1991—), 女, 河南安陽人; 碩士; 主要研究方向?yàn)轸~類免疫學(xué)。E-mail: 1114291018@qq.com; 黃貝(1982—), 男, 江西萍鄉(xiāng)人; 博士; 主要研究方向?yàn)轸~類免疫學(xué)。E-mail: huangbei@jmu.edu.cn

聶品, E-mail: pinnie@ihb.ac.cn; 黃文樹, E-mail: wshuang@jmu.edu.cn, Tel: 0592-6181597