鞏高瑞張 晉丹 成桂建芳,梅 潔

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實驗室, 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室, 武漢 430072)

應(yīng)用DNA分子標(biāo)記鑒定黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種的研究

鞏高瑞1張 晉1丹 成1桂建芳1,2梅 潔1

(1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)部淡水生物繁育重點(diǎn)實驗室, 淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心, 武漢 430070; 2. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室, 武漢 430072)

為區(qū)分黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli Richardson)及其雜交種, 前期研究構(gòu)建了一個YY超雄黃顙魚的BAC文庫并篩選到了一個包含性別連鎖標(biāo)記Pf62-Y的BAC克隆。研究對該BAC克隆進(jìn)行測序并鑒定到了一個新基因Inad-like, 而且Inad-like的外顯子序列在X和Y染色體上基本一致。通過黃顙魚Inad-like的外顯子序列及序列的保守性我們設(shè)計引物在瓦氏黃顙魚中擴(kuò)增獲得了其部分內(nèi)含子序列。通過內(nèi)含子序列比對, 發(fā)現(xiàn)瓦氏黃顙魚比黃顙魚少了一個DNA片段?；邳S顙魚和瓦氏黃顙魚的顯著遺傳差異, 設(shè)計了一對引物, 該引物在黃顙魚和瓦氏黃顙魚基因組中分別擴(kuò)增出1908和1178 bp DNA片段, 而且在雜交黃顙魚中同時擴(kuò)增出這兩個DNA片段。總之, 這個新的遺傳標(biāo)記提供了一種穩(wěn)定、高效識別黃顙魚及其與瓦氏黃顙魚雜交種的方法。

黃顙魚; 瓦氏黃顙魚; 雜交黃顙魚; 分子標(biāo)記; 種類鑒定

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco Richardson)是我國江河、湖泊中的一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類, 廣泛分布于我國淡水水體中。黃顙魚在分類上隸屬于鯰形目, 鲿科, 黃顙魚屬, 主要有黃顙魚、瓦氏黃顙魚(江黃顙魚)、中間黃顙魚和光澤黃顙魚等4種, 目前用于人工養(yǎng)殖的主要是黃顙魚和瓦氏黃顙魚。黃顙魚雄性比雌性生長快, 在養(yǎng)殖的第二年, 雄性黃顙魚的體重約是雌性的2—3倍。因此, 在生產(chǎn)實踐中, 人們通過各種人工控制方法培育全雄魚。劉漢勤等利用雌激素誘導(dǎo)和人工雌核發(fā)育技術(shù), 成功地從黃顙魚XY生理雌魚雌核發(fā)育獲得了YY超雄魚[1]。但傳統(tǒng)的方法需要?dú)⒌粜埕~從精巢獲得精液進(jìn)行測交實驗才能鑒定出其父本為遺傳YY或XY雄魚,這些因素阻礙了其在生產(chǎn)上的應(yīng)用?；趦尚苑敝车狞S顙魚家系和人工雌核發(fā)育獲得的XX雌魚、XY雄魚和YY超雄魚, 中國科學(xué)院水生生物研究所桂建芳研究員課題組結(jié)合BSA分析方法和個體篩選, 分離得到了黃顙魚X和Y染色體連鎖的AFLP標(biāo)記, 并將它們轉(zhuǎn)化為黃顙魚X和Y染色體連鎖的SCAR標(biāo)記(Pf33和Pf62), 建立了黃顙魚遺傳性別PCR鑒定方法[2]。由此開拓出了一條X和Y染色體連鎖標(biāo)記輔助的全雄魚培育技術(shù)路線[3,4]。但是這些性連鎖的SCAR標(biāo)記只在以上一個人工養(yǎng)殖群體中成功測試, 而且引物Pf62-X和Pf62-Y僅兩個堿基的差異, 可能會使它們的應(yīng)用有一定的局限性。通過基因組步移技術(shù)進(jìn)一步得到等位基因Pf62-X和Pf62-Y側(cè)翼的基因組序列(長度分別為5362和8102 bp),篩選出能廣泛鑒定黃顙魚野生和養(yǎng)殖群體性別的分子標(biāo)記[5]。

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli Richardson),俗稱江黃顙, 為我國特有種, 該魚生長速度顯著快于普通黃顙魚, 最大個體可達(dá)1850 g[6]。瓦氏黃顙魚在野生及養(yǎng)殖群體中雌雄生長速度差異較大, 雄魚體重通常大于雌魚50%左右, 有的甚至大于雌魚一倍以上[6,7]。瓦氏黃顙魚的仔、稚、幼魚的生長和成活率顯著高于黃顙魚[8]。以黃顙魚為母本, 以瓦氏黃顙魚為父本雜交獲得的子一代雜交黃顙魚,從形態(tài)特征上比較接近黃顙魚, 但其在受精率和生長速度上比黃顙魚有明顯的優(yōu)勢[9,10]。雜交黃顙魚作為近年來嶄露頭角的一種養(yǎng)殖新品種, 市場前景非常看好, 因此, 近年來全雄黃顙魚和雜交黃顙魚在黃顙魚養(yǎng)殖中占有相當(dāng)大的比例。

目前, 從形態(tài)學(xué)上較難區(qū)分雜交黃顙魚和普通黃顙魚的苗種和成魚。養(yǎng)殖實踐表明, 以黃顙魚為母本、瓦氏黃顙魚為父本的一齡雜交后代是不育的, 不能用于后期的苗種制備。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和成熟, 利用DNA標(biāo)記進(jìn)行種間鑒定成為可能。我們構(gòu)建了YY超雄魚的BAC文庫, 篩選到了包含Pf62-Y標(biāo)記的BAC克隆并進(jìn)行測序, 與性腺轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行比較[11,12], 發(fā)現(xiàn)該BAC克隆含有一個Inad-like基因; Pf62-Y標(biāo)記定位于Inad-like基因的內(nèi)含子上(結(jié)果未發(fā)表)而且Inad-like基因的外顯子在X和Y染色體上基本一致。由于黃顙魚和瓦氏黃顙魚同為黃顙魚屬, 親緣關(guān)系比較近, 我們用黃顙魚Inad-like基因的外顯子序列設(shè)計引物在瓦氏黃顙魚中進(jìn)行擴(kuò)增。我們擴(kuò)增出瓦氏黃顙魚Inadlike基因的部分內(nèi)含子序列。通過Inad-like基因在黃顙魚和瓦氏黃顙魚基因組中的序列差異, 我們篩選得到了一對可以將黃顙魚、瓦氏黃顙魚以及其雜交種準(zhǔn)確鑒定出來的標(biāo)記, 為黃顙魚下一步的育種研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

健康的黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種黃顙魚取樣于武漢市江夏區(qū)上涉湖養(yǎng)殖基地。

1.2 基因組DNA的提取

取鰭條0.2 g左右, 使用醋酸銨法提取基因組DNA, 將DNA溶于100 μL的超純水中, 4℃保存?zhèn)溆?。利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測總DNA的完整性,用紫外分光光度計(Thermo, NanoDrop 2000, 美國)檢測DNA濃度和質(zhì)量。

1.3 PCR擴(kuò)增

所用引物為經(jīng)篩選得到的Pfv標(biāo)記(Pfv-F 5′-TTTCCATCAGCATCCCCTCA-3′, Pfv-R 5′-AGCTCGGAGCCTTCATTCC-3′)。PCR反應(yīng)體系為10 μL: 模版1 μL (50 ng/μL), 上下游引物各0.5 μL (10 μmol/μL), 2×Es Taq Master Mix (Dye) 5 μL, 加ddH2O補(bǔ)至10 μL。PCR反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性3min, 34個循環(huán)(94℃ 30s, 61℃ 30s, 72℃ 1min 45s), 72℃ 5min。PCR反應(yīng)在T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, 美國)上進(jìn)行。

1.4 純化回收及測序

黃顙魚、瓦氏黃顙魚PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖膠上進(jìn)行電泳, 回收(E.Z.N.A Gel Extraction Kit, OMEGA, 美國), 連接到pMD-18T載體(TaKaRa, 日本), 之后熱激轉(zhuǎn)化至Trans5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全金式)。經(jīng)PCR檢測選取陽性克隆測序。

1.5 序列比對

黃顙魚、瓦氏黃顙魚測序結(jié)果用DNAMAN 8進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 黃顙魚Inad-like基因的結(jié)構(gòu)示意圖

Inad-like基因共包含18個外顯子, ORF長度為2982 bp。Pfv標(biāo)記的上下游引物分別位于第6和第7個外顯子序列(圖 1)。

2.2 黃顙魚和瓦氏黃顙魚擴(kuò)增序列的比對

通過使用Pfv引物擴(kuò)增出瓦氏黃顙魚Inad-like基因部分序列同黃顙魚序列進(jìn)行比對可以發(fā)現(xiàn)(圖 2), 瓦氏黃顙魚該片段大小為1178 bp, 較黃顙魚的1908 bp少了730 bp。

2.3 黃顙魚, 瓦氏黃顙魚及其雜種的分子鑒定

Pfv引物在黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種中的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖(圖 3)可直觀的進(jìn)行區(qū)分。實驗魚的雌雄性別通過解剖鑒定。如圖 3所示, 黃顙魚和瓦氏黃顙魚各有一條條帶, 條帶大小分別為1908和1178 bp, 雜交黃顙魚由于為黃顙魚和瓦氏黃顙魚的雜交種, 出現(xiàn)大小為1178和1908 bp的兩條條帶, 從而可以準(zhǔn)確鑒定黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種黃顙魚。結(jié)果顯示, 該鑒定引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物大小在黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種中沒有明顯的雌雄差異。

3 討論

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和成熟, 應(yīng)用DNA分子標(biāo)記鑒定近緣物種已成為可能。DNA分子標(biāo)記具有準(zhǔn)確可靠、成本較低、簡捷等特點(diǎn)。目前, 在魚類中已有報道的DNA分子標(biāo)記技術(shù)包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性脫氧核糖核酸技術(shù)(RAPD), 限制性片段長度多態(tài)性(RFLP), 微衛(wèi)星脫氧核糖核酸(SSR), 擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)和單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記等[13]。

圖 1 黃顙魚Inad-like基因的結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Structure of Inad-like gene in Pelteobagrus fulvidraco

圖 2 黃顙魚與瓦氏黃顙魚擴(kuò)增序列比對結(jié)果Fig. 2 Sequence alignment between Pelteobagrus fulvidraco and Pelteobaggrus vachelli

黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)隸屬鯰形目(Siluriformes)、鯰科(Siluridae)、黃顙魚屬(Pelteobagrus)。黃顙魚屬主要有黃顙魚(Pelteobagrus fulvidraco)、瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachelli)、中間黃顙魚(Pelteobagrus intermedius)和光澤黃顙魚(Pelteobagrus nitidus)。應(yīng)用形態(tài)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對黃顙魚進(jìn)行分類尚存在一些爭議, 研究人員試圖運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)來鑒別不同種類的黃顙魚。童芳芳等應(yīng)用RAPD和SCAR復(fù)合分子標(biāo)記法對湖北境內(nèi)采集的光澤黃顙魚、黃顙魚和瓦氏黃顙魚種類進(jìn)行鑒別, 但沒有得到只針對一種黃顙魚的特異引物[14]。肖調(diào)義等利用RAPD技術(shù)對長江流域洞庭湖4種黃顙魚種群的遺傳多樣性進(jìn)行分析, 運(yùn)用聚類分析(UPGMA)的方法建立聚類圖, 探討了4種黃顙魚系統(tǒng)演化的親緣關(guān)系。其中的RAPD引物多態(tài)性比較高, 需要更多的個體來進(jìn)一步鑒定和驗證[15]。養(yǎng)殖實踐表明, 雜交黃顙魚(黃顙魚♀×瓦氏黃顙魚♂)具有受精率和存活率高、生長快等優(yōu)勢, 但從形態(tài)特征上較難區(qū)分雜交黃顙魚與黃顙魚[9,10]。近年來雜交黃顙魚的養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)上升, 迫切需要一種準(zhǔn)確可靠、成本較低、簡捷的DNA分子標(biāo)記來鑒定。本研究根據(jù)黃顙魚和瓦氏黃顙魚基因組序列的差異, 設(shè)計了單對引物能準(zhǔn)備區(qū)分黃顙魚, 瓦氏黃顙魚和雜交黃顙魚, 而且該擴(kuò)增片段在單個物種中不存在多態(tài)性, 鑒定結(jié)果準(zhǔn)確。

圖 3 Pfv引物對黃顙魚、瓦氏黃顙魚及其雜交種的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖Fig. 3 Electrophoresis results of PCR products by using Pfv primers in Pelteobagrus fulvidraco, Pelteobaggrus vachelli and their Hybrid

INAD (Inactivation no after-potential D)蛋白是一種典型的支架蛋白, 其核心結(jié)構(gòu)由5個PDZ結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成, 定位于果蠅光感受器的微絨毛上, 負(fù)責(zé)介導(dǎo)G蛋白偶聯(lián)級聯(lián)視覺信號通路, 調(diào)控果蠅視覺信號的傳導(dǎo)[16]。但I(xiàn)NAD蛋白的其他功能研究非常少, 尤其是在生殖發(fā)育中的功能鮮有報道。一些研究表明, PDZ結(jié)構(gòu)域蛋白在脊椎動物的性別決定和分化及配子形成過程中發(fā)揮著潛在的功能。小鼠含有PDZ結(jié)構(gòu)域的SIP-1/NHERF2蛋白與SRY蛋白直接結(jié)合, 在雄性決定過程中共定位于原支持細(xì)胞的細(xì)胞核中并可能發(fā)揮一定的功能[17]。含有PDZ結(jié)構(gòu)域的GOPC蛋白可與自噬相關(guān)蛋白Beclin1 (Atg6)或外周膜蛋白PICK1結(jié)合, 在精子頂體發(fā)生過程中受Atg7的調(diào)控, 而且敲除GOPC, Atg7或PICK1的小鼠由于頂體合成缺陷而無生殖能力, 表現(xiàn)出人類圓頭精子癥的表型[18—20]。在黃鰭短須石首魚(Seriola quinqueradiata)中, 對性別決定位點(diǎn)連鎖的BAC進(jìn)行測序和連鎖分析, 發(fā)現(xiàn)包含PDZ結(jié)構(gòu)域的GIPC蛋白可能會參與該石首魚的性別決定中[21]。基因打靶和編輯技術(shù)如TALEN和CRISPR/ Cas9的出現(xiàn)使在經(jīng)濟(jì)魚類中進(jìn)行基因功能性研究變得相對簡單。闡明Inad-like在黃顙魚性別決定中的功能或許為黃顙魚的性染色體進(jìn)化及魚類的性別決定機(jī)制提供新的見解, 為基于性別控制的遺傳育種改良提供必要的理論和技術(shù)方法。

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IDENTIFICATION OF PELTEOBAGRUS FULVIDRACO, PELTEOBAGGRUS VACHELLI AND THEIR INTERSPECIFIC HYBRID BY DNA MARKERS

GONG Gao-Rui1, ZHANG Jing1, DAN Cheng1, GUI Jian-Fang1,2and MEI Jie1
(1. Key Laboratory of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, Freshwater Aquaculture Collaborative Innovation Center of Hubei Province, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China; 2. State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

Yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco) is an important aquacultural fish species in China. Since hydrid breeding is an efficient method to improve aquaculture products, interspecific hybrid between Pelteobagrus fulvidraco and its close species Pelteobaggrus vachelli that grows faster than Pelteobagrus fulvidraco, has been massively produced. However, it is hard to distinguish Pelteobagrus fulvidraco from the interspecific hybrid by morphological features. Moreover, the interspecific hybrid could not being used as parents for the existence of sterile hybrids. Previously, we constructed a bacterial artificial chromosome (BAC) library from YY super-male yellow catfish and screened out a BAC clone containing the sex-linked marker, Pf62-Y. In this study, we identified a novel gene inad-like in Pelteobagrus fulvidraco after sequencing the BAC clone, and the exons of inad-like are the same in X and Y chromosomes. Moreover, we cloned partial intron sequences of inad-like in Pelteobaggrus vachelli based on the exon sequences of inad-like in Pelteobagrus fulvidraco. Interestingly, there is a small segment deletion in Pelteobaggrus vachelli in comparison with the corresponding sequence in Pelteobagrus fulvidraco. Based on the significant genetic difference between Pelteobagrus fulvidraco and Pelteobaggrus vachelli sequences, we designed one pair of primers, by which 1908 bp and 1178 bp were amplified in Pelteobagrus fulvidraco and Pelteobaggrus vachelli, respectively. Moreover, both 1908 bp and 1178 bp were amplified in the interspecific hybrid. Together, this new genetic marker develops a highly stable and efficient method for distinguishing Pelteobagrus fulvidraco and its interspecific hybrid.

Pelteobagrus fulvidraco; Pelteobaggrus vachelli; Hybrid; Molecular marker; Species identification

Q173

A

1000-3207(2017)02-0321-05

10.7541/2017.39

2016-10-14;

2016-12-12

淡水生態(tài)與生物技術(shù)國家重點(diǎn)實驗室自主課題(2015FB03)資助 [Supported by Fund of State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology]

鞏高瑞(1994—), 男, 山東人; 碩士研究生; 主要從事魚類遺傳育種研究。E-mail: two216@qq.com

梅潔, 博士, 教授; E-mail: jmei@mail.hzau.edu.cn