周 江王麗娟王 波鄭鳳榮王長海

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 江蘇省海洋生物學重點實驗室, 南京 210095; 2. 中華人民共和國鹽城出入境檢驗檢疫局,鹽城 224002; 3. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 260061)

卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織的轉(zhuǎn)錄組比較分析

周 江1王麗娟2王 波3鄭鳳榮3王長海1

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院, 江蘇省海洋生物學重點實驗室, 南京 210095; 2. 中華人民共和國鹽城出入境檢驗檢疫局,鹽城 224002; 3. 國家海洋局第一海洋研究所, 青島 260061)

為了解星斑川鰈(Starry Flounder, Platichthys stellatus)腦組織基因表達與卵巢發(fā)育調(diào)控的關(guān)系, 發(fā)掘相關(guān)功能基因, 研究提取卵巢成熟期和退化期星斑川鰈雌魚腦垂體和下丘腦組織總RNA, 運用HiSeq 2000高通量測序技術(shù)進行轉(zhuǎn)錄組測序分析。測序結(jié)果經(jīng)拼接組裝后共獲得30640條Unigenes, Blast同源性比對顯示, 其中24128條Unigenes獲得注釋; 經(jīng)eggNog功能注釋后29137條Unigenes序列分為26類, 分別涉及信號轉(zhuǎn)導、翻譯機制等生理生化過程。KEGG pathway數(shù)據(jù)比對顯示, 卵巢成熟期涉及98種代謝途徑, 135條序列表達上調(diào); 卵巢退化期涉及192種代謝途徑, 648條序列表達上調(diào)。Unigenes表達量及表達差異分析表明在卵巢成熟期334條序列表達上調(diào), 卵巢退化期987條序列表達上調(diào)。獲得功能注釋的Unigene中, 408條涉及生殖調(diào)控和內(nèi)分泌調(diào)控, 參與生殖調(diào)控的信號分子有1508條。試驗采用實時定量 PCR研究了涉及生殖調(diào)控和內(nèi)分泌調(diào)控基因促性腺激素釋放激素(GnRH)、神經(jīng)激肽B(NKB)、促性腺激素(GtH)、促濾泡激素(FSH)、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制因子(Kiss)以及催乳素釋放肽受體(PrRPR)在卵巢兩個不同發(fā)育時期腦垂體和下丘腦的表達情況, 結(jié)果表明除FSH外, 其余均在卵巢退化期時期腦組織中表達升高, 與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致。

星斑川鰈; 腦組織; 轉(zhuǎn)錄組測序; 實時定量PCR

星斑川鰈(Starry Flounder, Platichthys stellatus)又稱星突江鰈, 隸屬鰈形目鰈科川鰈屬, 為廣鹽、冷水性種類, 在中國、朝鮮、韓國、日本、俄羅斯及美國太平洋沿岸海域均有分布, 具有廣溫廣鹽、耐受性強、易于馴化和營養(yǎng)豐富等特點, 是理想的集約化養(yǎng)殖對象[1]。近年來, 雖然星斑川鰈人工繁育技術(shù)有所突破[2], 但對于其卵巢發(fā)育的調(diào)控機制卻了解不多。目前, 國內(nèi)外有關(guān)星斑川鰈的研究報道多集中在其生長[3], 生物學地位[4,5]、生態(tài)分布以及營養(yǎng)價值[1]等方面, 少數(shù)學者的研究涉及了星斑川鰈的種群遺傳結(jié)構(gòu)和生理、生化等方面[6—8], 我國于2004年開始對星斑川鰈親魚培育技術(shù)進行研究[9]之后相繼對人工育苗和工廠化養(yǎng)殖技術(shù)[10,11]、胚胎發(fā)育[12]、幼魚形態(tài)發(fā)育與生長[13]進行了研究,對于星斑川鰈繁殖相關(guān)分子機制研究還未見報道。由于魚類配子發(fā)生和性腺成熟是通過神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)經(jīng)由腦-垂體-性腺軸調(diào)控得以實現(xiàn), 其結(jié)果表現(xiàn)為性腺發(fā)育周期性變化, 下丘腦分泌促性腺激素釋放激素, 垂體隨后分泌促性腺激素, 性腺接受調(diào)控分泌相應(yīng)的性激素和孕激素, 隨后性腺發(fā)育,成熟后進入生殖階段, 完成繁殖后即退化。繁殖和退化過程的完成經(jīng)過了許多結(jié)構(gòu)和功能的轉(zhuǎn)變, 了解調(diào)控這些轉(zhuǎn)變的因子是研究星斑川鰈人工繁殖的關(guān)鍵。

對魚類卵巢發(fā)育的調(diào)控及影響的早期研究多從內(nèi)分泌角度出發(fā), 但轉(zhuǎn)錄組學分析技術(shù)的應(yīng)用為研究硬骨魚類卵巢發(fā)育及排卵的分子調(diào)控機制提供了新的工具[14,15]。迄今為止, 有關(guān)卵巢發(fā)育轉(zhuǎn)錄表達的研究工作較多地集中在模式魚類, 如斑馬魚(Danio rerio)、鰷(Pimephales promelas)[16,17], 盡管近期在養(yǎng)殖魚類, 如花條鱸(Morone saxatilis)、橄欖比目魚(Paralichthys olivaceus)等也有關(guān)于卵巢轉(zhuǎn)錄組研究報道, 但這些研究或者采用的定量效率較弱：如基因芯片技術(shù)、抑或是各期卵巢的混合樣品, 其關(guān)注的依然是卵巢器官特異基因表達的特性分析, 而非對不同成熟期的卵巢轉(zhuǎn)錄特征進行分析[18, 19]。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)可以獲得特定細胞在某一狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA, 包括非編碼RNA和信使RNA (mRNA), 可高通量地獲得基因表達的RNA水平有關(guān)信息, 通過獲得研究對象基因組轉(zhuǎn)錄區(qū)域的信息, 鑒定轉(zhuǎn)錄發(fā)生位點, 可變剪切等, 可對基因進行精確的定量分析[20—22]。目前, 轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已逐步取代基因芯片技術(shù), 成為從全基因組水平研究基因表達的主流方法。為了詳細了解星斑川鰈的繁殖機理和遺傳特點, 本研究借助高通量測序技術(shù)對卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織進行了分析, 為今后我國星斑川鰈人工繁殖技術(shù)水平提高以及雜交育種和品種改良研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及總RNA提取

試驗用星斑川鰈取自日照海洋水產(chǎn)資源增殖站, 隨機取樣卵巢成熟期和退化期健康星斑川鰈3齡雌性親魚各10尾(1053.6±42.5) g, 分別取腦垂體和下丘腦組織后迅速投入液氮轉(zhuǎn)入-80℃保存待用?？俁NA提取方法參照Trizol Reagent (Invitrogen)說明書進行, 以1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢驗總RNA質(zhì)量。

1.2 樣品前處理及測序

將卵巢成熟期和退化期親魚腦垂體和下丘腦組織RNA檢測濃度和純度后, 各選取5條質(zhì)量最佳的親魚RNA作為混合測序樣品。根據(jù)測得的RNA濃度, 將符合要求的RNA樣品等量混合至新離心管中, 再次檢測混合后RNA樣品的濃度和純度?；旌虾驲NA樣品置于1.5 mL離心管中送上海派森諾公司測序。

將提取的卵巢成熟期和退化期的星斑川鰈腦垂體和下丘腦總RNA用帶有Oligo (dt)的磁珠富集mRNA, 由反轉(zhuǎn)錄酶和隨機引物將片段化的mRNA合成cDNA第一鏈, 第二鏈合成使用緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase Ⅰ, 經(jīng)核酸外切酶和聚合酶進行末端修復, 連接接頭, 分離純化, 擴增DNA文庫。采用Picogreen和熒光分光光度計定量文庫, Agilent 2100控制PCR富集片段質(zhì)量, 驗證DNA文庫質(zhì)量, 樣品稀釋至4—5 pmol/L后上機測序。

利用HiSeq 2000平臺獲得星斑川鰈卵巢成熟期和退化期腦垂體和下丘腦組織圖像序列信息, 然后轉(zhuǎn)化為相應(yīng)核苷酸序列, 進行可信度分析及質(zhì)量評估。去除低質(zhì)量序列, 運用Velvet和Oases軟件進行組裝拼接, blast聚類得到Unigene(http://www.ebi.ac. uk/～zerbino/velvet; http://www.ebi.ac.uk/～zerbino/ oases)[23,24]。

1.3 序列比對、eggNOG功能注釋、KEGG代謝通路分析及表達差異分析

將所得序列與SwissProt、nr、Non Redudant數(shù)據(jù)庫進行序列比對, 統(tǒng)計與數(shù)據(jù)庫中已收錄基因具有高度相似性的序列, 獲取最佳注釋(E-value＜10-5); 將所有序列在eggNOG數(shù)據(jù)庫中進行比對(E-value＜10-5), 獲得表達序列的NOG功能注釋及分類,收集建立基因同源組群, 包括COG和KOG數(shù)據(jù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG; http://eggnog. embl.de/)[25]。

使用RPKM值(Reads per kb per million reads),計算基因表達量, 2-fold法統(tǒng)計成熟期和退化期序列RPKM值差異(定義: 一條序列的RPKM值在成熟期大于或等于退化期的2倍, 則為成熟期表達上調(diào),反之則為退化期表達上調(diào)。若兩時期RPKM值差異不超過2倍, 則為表達無差異) 。全部序列在KEGG pathway數(shù)據(jù)庫中進行比對, 獲得相關(guān)序列代謝通路注釋及在代謝通路中的具體位置信息(http://www. genome.jp/kegg/)[26,27]。

1.4 GnRH、NKB、GtH、Kiss、FSH及PrRPR在不同卵巢發(fā)育時期實時定量PCR分析

為驗證RNA測序結(jié)果, 將進行轉(zhuǎn)錄組測序時提取的卵巢成熟期和退化期星斑川鰈腦垂體和下丘腦組織總RNA各取3個樣本, 使用Prime ScriptTMII 1st strand cDNA synthesis Kit試劑盒(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。按照Real-time PCR說明書FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)進行Real-time PCR反應(yīng), 所用引物如表 1, 目的基因Ct值取3個平行均值, 管家基因β-actin為內(nèi)參, 目的基因Ct值與內(nèi)參基因的Ct值之間差異稱為ΔΔCt, 2-ΔΔCt值即為樣品的該基因的相對表達水平[28], 設(shè)成熟期為對照,即成熟期樣品的值均設(shè)為1倍, PCR反應(yīng)條件為: 95℃, 10min; 95℃, 15s; 60℃, 60s; 72℃, 1min, 40個循環(huán)。

2 結(jié)果

2.1 序列注釋及分析

拼接組裝得到的30640條Unigenes經(jīng)Blast同源比對NCBI數(shù)據(jù)庫, 其中24128條獲得同源序列注釋,占總數(shù)的78.75% (E-value＜10-5)。將全部Unigenes進行eggNOG注釋后, 歸入適當?shù)膃ggNOG簇。在功能已知的29137條Unigenes中, 按功能不同將其分為26大類, 其中涉及信號轉(zhuǎn)導機制的Unigenes所占比例最大, 為21.20%, 其次是涉及基本功能和轉(zhuǎn)錄機制的Unigenes各占9.29%和8.84% (圖 1)。利用RPKA值差異顯著性(P＜0.05)計算兩個卵巢發(fā)育時期基因表達量, 并用2-fold法進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析差異表達基因分析（圖 2）。在獲得的轉(zhuǎn)錄組序列數(shù)據(jù)中, 成熟期表達上調(diào)的序列有334條, 退化期表達上調(diào)的序列有987條。

表 1 實時定量PCR引物序列Tab. 1 Sequences of Real-time PCR primers

2.2 差異表達unigene的GO富集分析

在兩期表達上調(diào)的1321條Unigenes與GO數(shù)據(jù)庫進行比對的結(jié)果顯示如圖 3所示, 三大功能分類分別包含了6、9和37個功能分類。在細胞組分分組中, 兩時期腦組織差異表達基因在細胞、細胞內(nèi)和細胞組分類型比例最高, 分別為22.60%、19.21%、19.21%和21.69%、18.81%和17.08%。在分子功能分組中, 兩時期腦組織差異表達基因在分子功能、離子結(jié)合所占比例較高, 為50.43%、27.35%和44.95%和29.62%。在生物學過程分組中, 兩時期腦組織差異表達基因在生物學過程、生物合成過程和細胞氮代謝過程所占比例較高, 分別為16.13%、8.06%、7.66%和17.69%、7.85%和6.62%。差異表達基因的GO功能富集分析表明, 在星斑川鰈卵巢發(fā)育過程中, 蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)的積累, 包括鈣磷等微量元素在體內(nèi)的變化以及因此導致的胞內(nèi)胞外一系列信號應(yīng)答機制和相關(guān)激素的合成、釋放、調(diào)控生殖發(fā)育作用為此期間主要的神經(jīng)內(nèi)分泌行為。

圖 1 Unigenes eggNOG功能分類Fig. 1 eggNOG function classification of unigenesA. RNA加工與修飾RNA processing and modification; B. 染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與變化Chromatin structure and dynamics; C. 能量產(chǎn)生與轉(zhuǎn)化Energy production and conversion; D. 細胞周期調(diào)控與分裂,染色體重排Cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E. 氨基酸運輸與代謝Amino acid transport andmetabolism; F. 核苷酸運輸與代謝Nucleotide transport and metabolism; G. 碳水化合物運輸與代謝Carbohydrate transport and metabolism; H. 輔酶運輸與代謝Coenzyme transport and metabolism; I. 脂類運輸與代謝Lipid transport and metabolism; J.翻譯, 核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成Translation, ribosomal structure and biogenesis; K. 轉(zhuǎn)錄Transcription; L. 復制、重組與修復Replication, recombination and repair; M. 胞壁/膜生物發(fā)生Cell wall/memberance/envelope biogenesis; N. 細胞運動Cell motility; O. 蛋白質(zhì)翻譯后修飾與轉(zhuǎn)運, 分子伴侶Posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. 無機離子運輸與代謝Inorganic ion transport and metabolism; Q. 次生產(chǎn)物合成, 運輸及代謝Secondary metabolites biosynthesis, transport andcatabolism; R. 一般功能基因General function prediction only; S. 功能未知Function unknown; T. 信號傳導機制Signal transduction mechanisms; U. 胞內(nèi)分泌與膜泡運輸Intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V. 防御機制Defense mechanisms; W. 細胞外結(jié)構(gòu)Extracellular; X. 未確定Undetermined; Y.核酸結(jié)構(gòu)Nuclear structure; Z. 細胞骨架Cytoskeleton

2.3 KEGG pathway注釋及富集分析

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫記錄細胞中基因產(chǎn)物的功能以及基因產(chǎn)物的相互作用網(wǎng)絡(luò), 基于KEGG通路的分析有助于我們進一步了解基因的生物學功能以及所有可能的代謝途徑, 而且可以對催化各步反應(yīng)的酶進行全面的注解。對全部序列進行KEGG代謝通路數(shù)據(jù)庫比對和注釋, 結(jié)果表明成熟期涉及98種代謝途徑, 表達上調(diào)的序列有135條; 退化期涉及192種代謝途徑, 表達上調(diào)的序列有648條(圖 4)。結(jié)合差異表達基因的KEGG功能注釋結(jié)果, 進行Pathway顯著性富集分析。共得到顯著富集的Pathway包括免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、信號分子相互作用、信號轉(zhuǎn)導、內(nèi)分泌系統(tǒng)、細胞通訊等代謝通路。此外,一些參與生殖、生長和發(fā)育的功能基因分入卵母細胞減數(shù)分裂(Oocyte meiosis)和促性腺激素釋放激素信號通路(GnRH signaling pathway)(表 2)。通過對注釋結(jié)果進一步統(tǒng)計分析, 查找到與生殖發(fā)育調(diào)控以及內(nèi)分泌相關(guān)的基因有408條, 不同分類的生殖發(fā)育調(diào)控以及內(nèi)分泌相關(guān)的基因及數(shù)目如表3所示。參與生殖調(diào)控與內(nèi)分泌相關(guān)的信號分子及基因數(shù)目主要有鈣調(diào)蛋白98條、磷酸酯酶534條、蛋白激酶798條及環(huán)腺苷酸 87條, 共計1508條。

圖 2 卵巢發(fā)育不同時期序列表達差異Fig. 2 Unigenes different expression in different ovary deve-lopment stages

2.4 GnRH、NKB、GtH、Kiss、FSH及Pr-RPR在不同卵巢發(fā)育時期的腦組織中的表達驗證

圖 5所示, 生長激素釋放激素GnRH、促性腺激素GtH、促濾泡激素FSH、PrRPR、神經(jīng)激肽BneurokininB及Kisspeptin基因在卵巢不同發(fā)育時期的表達不同, GnRH、NKB、GtH、Kis和PrRPR在卵巢退化期的表達水平高, PrRPR的表達水平在退化期超過了成熟期的5倍, 而FSH則在卵巢成熟期的表達水平較高, 與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致, 盡管表達量存在一定差異。

3 討論

目前, RNA測序技術(shù)在魚類的研究中已經(jīng)發(fā)揮了重要作用, 郭威[29]利用該技術(shù)進行了黃鱔腦及性腺轉(zhuǎn)錄組分析及差異基因篩選, 發(fā)現(xiàn)在3種不同性腺發(fā)育時期黃鱔間, 差異表達基因多集中在性腺中;程云英[30]對6月齡奧里亞羅非魚雌雄性腺經(jīng)行了轉(zhuǎn)錄組測序, 發(fā)現(xiàn)二者中大部分基因表達模式相一致; Zucchi等[31]使用微陣列雜交的方法研究了雌性斑馬魚孕酮誘導后腦和卵巢中基因變化情況。星斑川鰈為我國新興的經(jīng)濟海水魚類, 具有重要的經(jīng)濟價值, 但該魚分子遺傳基礎(chǔ)研究較為薄弱, 基因組序列信息缺乏, 本研究采用HiSeq 2000高通量測序技術(shù)對卵巢發(fā)育不同時期的星斑川鰈的腦組織進行測序分析, 有望充實星斑川鰈的公共EST數(shù)據(jù)資源, 挖掘更多具有潛在價值的基因并更好地理解星斑川鰈生殖和發(fā)育的分子生物學機制。

3.1 卵巢差異表達基因的分析

本次測序共獲得30640條Unigenes, 24128Uni-genes能獲得生物信息學注釋。其中408條與生殖調(diào)控相關(guān), 而參與生殖調(diào)控的信號分子則有1508條。Unigenes的KEGG pathway數(shù)據(jù)比對分析,卵巢成熟期涉及98種代謝途徑, 表達上調(diào)的序列有135條; 卵巢退化期涉及192種代謝途徑, 表達上調(diào)的序列有648條。Unigenes表達量及表達差異分析表明在卵巢成熟期基因表達上調(diào)的334條Unigenes,在卵巢退化期表達上調(diào)987條Unigenes。

圖 3 Unigenes的GO分類Fig. 3 GO classification of unigenes

圖 4 KEGG信號通路中的unigenes數(shù)量分布Fig. 4 The distribution of unigenes in KEGG pathway

表 2 星斑川鰈卵巢發(fā)育相關(guān)基因Tab. 2 The Genes involved in ovary development of Platichthys stellatus

表 3 生殖調(diào)控相關(guān)的基因Tab. 3 The genes involved in procreation regulation

圖 5 GnRH、FSH、NKB、GtH、Kis、PrRPR在卵巢成熟期和退化期腦組織中的表達Fig. 5 The expression of GnRH, NKB, FSH, GtH, Kiss and PrRPR during the stage of ovary maturation and stage of ovary degeneration

星斑川鰈的卵巢發(fā)育是屬于非同步型, 繁殖期分批成熟多次產(chǎn)卵, 即卵巢內(nèi)含有至少兩種處于不同發(fā)育階段的卵母細胞群, 在第一次排卵結(jié)束后卵巢中還存留相當部分的待成熟卵母細胞。據(jù)本研究結(jié)果顯示, 在第一次排卵前, 差異表達基因中包括促進葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白、蛋白磷酸酶、微管蛋白、過氧化物酶、果糖-二磷酸醛縮酶、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、鐵傳遞蛋白、二氫蝶啶還原酶等基因, 涉及的信號通路包括蛋白質(zhì)、脂肪代謝、鈣磷代謝, 而有關(guān)促性腺激素釋放激素、促性腺激素的調(diào)控基因等只是常態(tài)表達, 這說明了在此期間, 卵巢發(fā)育需要大量營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素的支持而相關(guān)的性激素只是緩慢平穩(wěn)的上升; 排卵行為產(chǎn)生是以促性腺激素分泌到峰值為先導, 與此相對應(yīng), 在本研究中,星斑川鰈雌魚排卵過程中差異表達基因包括促性腺激素釋放激素受體、神經(jīng)肽Y、胰島素樣生長因子、電壓門控鈣離子通道、孕激素受體等一批配合排卵過程調(diào)控的基因表達都變?yōu)樯险{(diào)狀態(tài), 據(jù)對金魚、鯉等的研究表明, 促性腺激素釋放激素刺激促性腺激素釋放依賴于細胞外鈣離子的有效性, 白細胞介素等免疫因子參與排卵過程的調(diào)控[32—35]。

采用實時定量PCR的方法對與生殖調(diào)控相關(guān)的基因進一步的研究發(fā)現(xiàn), FSH基因在星斑川鰈性腺成熟期時的腦組織中表達較高, 而GtH、PrRPR、NKB、GnRH以及Kiss則在退化期的表達水平較高。Levavi等[36]在鮭科魚中的研究表明, FSH主要在性腺發(fā)育早期起調(diào)控作用, 并不參與排卵的調(diào)控,而LH主要參與配子成熟和排出, Rocha等[37]在舌齒鱸中的研究發(fā)現(xiàn), FSHR強烈表達于卵黃生成期和早期卵黃生成階段, 但并不表達于成熟卵細胞, 真鯛(Pagrus major) LHβ轉(zhuǎn)錄本在兩性配子發(fā)生到排出始終保持較高水平[38]。這些結(jié)果表明GtHs在硬骨魚生殖調(diào)控中的功能存在一定的種屬特異性。

3.2 與卵巢發(fā)育相關(guān)的信號通路

從本次轉(zhuǎn)錄組測序中, 胰島素樣生長因子(IGF1)、表皮生長因子受體(EGFR)、細胞周期蛋白依賴性激酶(Cyclin Dependent Kinase, CDK)、細胞分裂周期因子(cell division cycle, cdc)、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase)、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2 (ERK1/2)等一系列關(guān)鍵酶和受體調(diào)節(jié)因子蛋白激酶A (PKA)都被發(fā)現(xiàn)。其中細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extra-cellular signal-regulated kinase, ERK)信號通路、p38 絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase, p38)信號通路、Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase, JNK)信號通路和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶5 (extracellular-regulated kinase 5, ERK5)信號通路[39]是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號轉(zhuǎn)導途徑的子通路, 各子途徑相互交錯聯(lián)系并作用, 形成一個巨大的信息傳遞網(wǎng)。據(jù)研究, MAPK信號通路在海星(Asterina miniata)卵母細胞減數(shù)分裂過程發(fā)揮重要作用, 即MAPK途徑維持卵母細胞減數(shù)分裂MI期的穩(wěn)定, 但也人有認為MI期停滯與MAPK途徑無關(guān), 但MAPK會影響排卵后的MI期的長短[40]。Roux等[41]發(fā)現(xiàn)MAPK通路會影響紫海膽(Strongylocentrotus purpuratus)精子和卵子的結(jié)合, 由此可見, MAPK信號通路對卵子發(fā)生、精子形成和性腺發(fā)育都有著顯著的功能。

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COMPARISON ANALYSIS ON TRANSCRIPTOME IN THE PITUITARY GLAND AND HYPOTHALAMUS OF STARRY FLOUNDER (PLATICHTHYS STELLATUS) AT THE OVARY MATURATION AND DEGRADATION STAGES

ZHOU Jiang1, WANG Li-Juan2, WANG Bo3, ZHENG Feng-Rong3and WANG Chang-Hai1
(1. Jiangsu Provincial Key Laboratory of Marine Biology, College of Resources and Environmental Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Yancheng Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau of the People’s Republic of China, Yancheng 224002, China; 3. The First Institute of Oceanography, State Oceanic Administration, Qingdao 260061, China)

To investigate the relationship of genes expression between brain tissue and ovary development, and explore more functional genes of Platichthys stellatus, total RNA from the mixed sample of pituitary gland and hypothalamus at the ovary maturation and degradation stages were isolated and sequenced by HiSeq 2000 high throughput sequencing technology. After assembly and splicing, 24128 unigenes from a total of 30640 unigenes were annotated based on the blast homology alignment. All 29137 unigenes with eggNog annotations were divided into 26 categories that were involved in physiological processes, such as signaling transduction, translation mechanism, etc. The results from KEGG pathway analysis showed that all unigenes at the ovary maturation stage were involved in metabolic pathways with 135 up-regulated sequences, while the unigenes at the ovary degradation stage were associated with 192 metabolic pathways with 648 up-regulated sequences. Moreover, 334 differentially expressed genes (DEGs) were up-regulated at the ovary maturation stage, while 987 up-regulated DEGs were observed at the ovary degradation stage. Total 408 unigenes were involved in reproductive and endocrine regulation, and 1508 unigenes were involved in signaling molecules. The expression of some reproduction-associated DEGs including growth hormone releasing hormone (GnRH), neurokinin B (NKB), gonadotropin (GtH), follicle stimulating hormone (FSH), kisspeptin (Kiss), and prolactin-releasing peptide receptor (PrRPR) were verified by qRT-PCR. All genes except FSH were consistent with the results of the transcriptome sequencing.

Platichthys stellatus; Brain tissue; Transcriptome sequencing; qRT-PCR

S961.6

A

1000-3207(2017)02-0346-10

10.7541/2017.42

2016-05-26;

2016-07-11

國家高技術(shù)發(fā)展計劃“863項目”(2012AA10A413、2012AA10A408); 國家海洋公益性行業(yè)科研專項(201305005)資助[Supported by the National High-tech R&D Program “863 Program” (2012AA10A413, 2012AA10A408); Public Science and Technology Research Funds Projects of Ocean (201305005)]

周江(1979—), 男, 湖北荊州人; 博士研究生; 主要從事海洋生物學研究。E-mail: zhoujiang768@126.com

王長海(1962—), 男, 山東煙臺人; 教授、博士生導師; 主要從事海洋生化工程研究。E-mail: chwang@njau.edu.cn