摘 要 從沈撫污灌渠三寶屯附近采集長(zhǎng)期被石油嚴(yán)重污染的底泥樣品，以原油為唯一碳源，采用富集培養(yǎng)、平板涂布、平板劃線等方法，篩選得到9株石油降解菌，其中4株為細(xì)菌、5株為真菌；通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列比對(duì)分析，對(duì)其中1株真菌菌株（ODF-3）進(jìn)行鑒定，確定其為煙曲霉（Aspergillus sp.），與模式種Aspergillus fumigatus的相似度為99%。將菌株在偏酸環(huán)境中培養(yǎng)2 d后投放使用，其穩(wěn)定性與降解速率最好。

關(guān)鍵詞 污灌渠底泥；石油降解菌；篩選；鑒定；煙曲霉

中圖分類(lèi)號(hào)：X53 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.13.018

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沈撫灌區(qū)位于遼寧省沈陽(yáng)和撫順兩市的近郊區(qū)，該污水灌渠作為國(guó)內(nèi)最早建設(shè)的污水灌渠至今已運(yùn)行幾十年，雖然灌渠曾經(jīng)為農(nóng)業(yè)灌溉發(fā)揮過(guò)作用，但所造成的地下水污染和農(nóng)作物的污染，給人居環(huán)境造成的影響和危害是極大的[1]。其上游和中游地區(qū)從 20 世紀(jì) 40 年代末就已經(jīng)開(kāi)始接受主要來(lái)自撫順石油二廠的污水灌溉。隨著工業(yè)的迅猛發(fā)展和人口的增加，大量超標(biāo)污水未經(jīng)處理長(zhǎng)年直接排入灌渠中，導(dǎo)致灌渠內(nèi)水質(zhì)日趨惡化，灌區(qū)土壤中芳烴、揮發(fā)酚、重金屬等污染物嚴(yán)重超標(biāo)，土壤通透性下降，肥力減低，土壤（尤其是底泥）微生物種群發(fā)生了很大改變（有較多的嗜油菌），灌區(qū)土壤生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能被嚴(yán)重破壞[2]。由于生物降解法具有獨(dú)特的優(yōu)越性，利用微生物降解烴類(lèi)物質(zhì)的能力來(lái)消除石油污染已經(jīng)越來(lái)越受到人們的重視[3]。探明沈撫灌區(qū)這樣一個(gè)特殊環(huán)境下微生物種群的組成結(jié)構(gòu)，開(kāi)展與土壤生物修復(fù)有關(guān)的基礎(chǔ)性研究以及提出具有經(jīng)濟(jì)效益的污染防治措施，具有重要的理論和實(shí)踐研究?jī)r(jià)值[4]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1 污灌底泥

2014年10月底2015年3月初，于遼寧省撫順市沈撫灌渠三寶屯附近用采泥器取污灌渠底泥，規(guī)定距離處分東西南北4個(gè)方位分別用采樣工具采集0～20 cm的地面土，采集后混合均勻，將樣品立即帶回實(shí)驗(yàn)室，置于4℃保存?zhèn)溆肹4]。

1.1.2 原油

由撫順石油二廠提供。

1.1.3 儀器與試劑

1.1.3.1儀器

實(shí)驗(yàn)中所用的主要儀器列于表1。

1.1.3.2試劑

真菌基因組DNA快速抽提試劑盒：生工生物（上海）股份有限公司。

PCR擴(kuò)增試劑盒：生工生物（上海）股份有限公司。

18S rDNA序列擴(kuò)增引物：生工生物（上海）股份有限公司合成。

1.1.4 培養(yǎng)基

1.1.4.1富集培養(yǎng)基

將污灌底泥樣品1 g分別加入100 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、100 mL馬鈴薯培養(yǎng)基中制備成富集培養(yǎng)基。

1.1.4.2石油平板培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4·7H2O 0.5 g、CaCl2 0.02 g、KH2PO4 1.0 g、NH4NO3 1.0 g、FeCl3 0.05 g、瓊脂20 g，原油適量，pH值調(diào)至7.0。

1.1.4.3馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）

馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH值自然。

1.1.4.4牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基

牛肉膏 3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、水1 000 mL，pH值7.0～8.0。

1.2方法

1.2.1 石油降解菌的富集、分離、純化

分別在含有污灌底泥的富集牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基、馬鈴薯液體培養(yǎng)基中，接入底泥懸浮液，于37℃、24℃，120 rpm搖床培養(yǎng)1周；然后，取一定量的上述富集培養(yǎng)液接入100 mL新鮮富集培養(yǎng)液中，再次于37℃、24℃，120 rpm搖床培養(yǎng)1周。采用稀釋平板法分離石油降解菌[5]。將富集培養(yǎng)液按10倍稀釋法稀釋?zhuān)?0-4～10-6倍培養(yǎng)液各0.1 mL涂布于含油固體培養(yǎng)基上，置于37℃、24℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)。恒溫培養(yǎng)24 h后，觀察菌株生長(zhǎng)情況。待平板上長(zhǎng)出菌落時(shí)，選取具有優(yōu)勢(shì)、不同顏色及形態(tài)的單菌落，在油平板上多次劃線分離純化，以得到形態(tài)一致的單菌落。將純化菌株接種于試管斜面培養(yǎng)基后保存于4℃冰箱。

1.2.2 石油降解真菌ODF-3菌株的形態(tài)學(xué)觀察

菌落形態(tài)觀察：將石油降解真菌ODF-3接種于PDA平板上，25℃條件下，倒置培養(yǎng)數(shù)天，觀察記錄菌株的生長(zhǎng)速度，菌落形態(tài)，有無(wú)同心螺紋，是否有色素產(chǎn)生等。用平皿插片法觀察菌株的顯微形態(tài)特征[6]。

菌絲形態(tài)觀察：將石油降解真菌ODF-3接種于PDA平板上，插片，置25℃恒溫箱中培養(yǎng)數(shù)天，取出用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲大小、形狀、表面特征以及是否有隔，是否有孢子以及孢子大小、形狀、類(lèi)型、顏色等。參照戴芳滿(mǎn)的《中國(guó)真菌總匯》和魏景超的《真菌鑒定手冊(cè)》對(duì)石油降解真菌ODF-3進(jìn)行形態(tài)學(xué)的分類(lèi)鑒定[6]。

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

采用真菌基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA作為PCR模版[4]。以18S-ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和18S-ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物進(jìn)行擴(kuò)增[7]。PCR產(chǎn)物的純化和測(cè)定由生工生物（上海）股份有限公司完成。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2，反應(yīng)條件見(jiàn)表3。將測(cè)得的18S rDNA序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)序列同源性確定菌種[8-10]，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 石油降解真菌ODF-3的系統(tǒng)發(fā)育分析

用Mega 6.0對(duì)測(cè)得的序列和相關(guān)參考序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建，以及系統(tǒng)進(jìn)化分析[8-9]。

1.2.5 石油降解真菌ODF-3菌株的生物學(xué)物性研究

1.2.5.1菌株的活化

將保藏狀態(tài)的石油降解真菌ODF-3菌株放入適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用移液管移取0.3～0.4 mL冷藏菌液滴入無(wú)菌水中輕輕震蕩，溶解成懸浮狀液體。再取出0.2 mL菌懸液轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基斜面，將剩余的菌液注入PDB培養(yǎng)基中，在25℃、135 rpm的恒溫培養(yǎng)箱中震蕩3 d后，備用[10]。

1.2.5.2菌株的生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將已經(jīng)活化的石油降解真菌ODF-3菌液接種到已滅菌的PDB培養(yǎng)基中，置25℃、135 rpm的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在0， 6， 12， 18， 24， 30， 42， 54， 66， 78， 80， 92 h分別取3瓶菌液進(jìn)行過(guò)濾，105℃或100℃烘干至恒重，測(cè)定其干重并記錄數(shù)據(jù)[11]。

1.2.5.3菌株的初始pH值測(cè)定

配制pH值分別為3， 4， 5， 6， 7， 8， 9的7組PDB培養(yǎng)基，將已活化好的石油降解真菌ODF-3菌液分別接種其中，每組3瓶；于25℃、135 rpm的恒溫培養(yǎng)箱中震蕩60 h，取出后進(jìn)行過(guò)濾，105℃或100℃烘干至恒重，測(cè)定其干重并記錄數(shù)據(jù)[11-12]。

2結(jié)果與分析

2.1石油降解菌的篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)富集、純化，共篩選到4株細(xì)菌，5株真菌，分別命名為ODB-1、ODB-2、ODB-3、ODB-4和ODF-1、ODF-2、OD-F3、ODF-4、ODF-5。

2.2石油降解真菌ODF-3菌株的形態(tài)學(xué)觀察

石油降解真菌ODF-3菌株的顯微形態(tài)見(jiàn)圖1。ODF-3菌株菌落初呈白色，后菌落正面產(chǎn)生孢子后呈褐色。在光學(xué)顯微鏡下菌絲無(wú)色，分枝，有橫隔。

2.3石油降解真菌ODF-3菌株的分子鑒定結(jié)果

2.4石油降解真菌ODF-3菌株的生物學(xué)特性

2.4.1 石油降解真菌ODF-3菌株生長(zhǎng)曲線

石油降解真菌ODF-3菌株的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)，0～24 h為菌株生長(zhǎng)的適應(yīng)期（又稱(chēng)停滯期、調(diào)整期），在這個(gè)時(shí)間內(nèi)菌絲細(xì)胞干重（生物量）基本不增加或增加非常緩慢；24～84 h為為菌株生長(zhǎng)的指數(shù)增長(zhǎng)期，在該時(shí)期菌株的生長(zhǎng)繁殖速度很快，活菌的數(shù)目呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間達(dá)84 h左右時(shí)，菌絲細(xì)胞干重（生物量）達(dá)最大值；84～154 h為菌株生長(zhǎng)的穩(wěn)定期（又稱(chēng)恒定期或最高生長(zhǎng)期），即菌絲細(xì)胞干重（生物量）不再繼續(xù)增加，保持平衡，這是由于此階段營(yíng)養(yǎng)物尤其是生長(zhǎng)限制因子耗盡、營(yíng)養(yǎng)物的比例失調(diào)，酸、醇、毒素或H2O2等有害代謝產(chǎn)物累積，pH值、氧化還原等物化條件越來(lái)越不適宜，使得在此階段的細(xì)胞分裂間隔時(shí)間延長(zhǎng)，曲線上升開(kāi)始緩慢，隨后部分細(xì)胞停止分裂，少數(shù)細(xì)胞開(kāi)始死亡，致使新生細(xì)胞與死亡細(xì)胞處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)；154 h后，菌株生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，在此時(shí)期菌絲細(xì)胞干重（生物量）減少，呈現(xiàn)出負(fù)生長(zhǎng)趨勢(shì)，這主要是由于外界環(huán)境對(duì)繼續(xù)生長(zhǎng)越來(lái)越不利，從而引起細(xì)胞內(nèi)的分解代謝大大超過(guò)合成代謝，繼而導(dǎo)致菌體死亡。

2.4.2 初始 pH值對(duì)石油降解真菌ODF-3菌株生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基的初始pH值對(duì)石油降解真菌ODF-3菌株生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，ODF-3菌株生長(zhǎng)的初始最佳pH值為6左右，中性偏酸比偏堿的生長(zhǎng)環(huán)境更適合石油降解真菌ODF-3菌株的生長(zhǎng)。

3結(jié)論與討論

本試驗(yàn)選用石油烴為培養(yǎng)基的唯一碳源，采用連續(xù)富集篩選的方法，共得到9株可降解石油的菌株，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和18S rDNA序列分析，鑒定其中石油降解真菌ODF-3菌株為煙曲霉，可考慮選擇該菌株作為油廢水生物處理的石油降解菌。

通過(guò)對(duì)ODF-3菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定得知，ODF-3菌株在培養(yǎng)24 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在84 h后進(jìn)入穩(wěn)定生長(zhǎng)期，在154 h后進(jìn)入生長(zhǎng)衰亡期；ODF-3菌株的初始最佳pH值為6左右，且偏酸的生長(zhǎng)環(huán)境比偏堿的生長(zhǎng)環(huán)境更適合菌株生長(zhǎng)。由此顯示，將菌株在偏酸環(huán)境中培養(yǎng)2 d后投放使用，其穩(wěn)定性與降解速率最好。

通過(guò)本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，被石油污染的污灌渠底泥中潛藏著較為豐富的“土著”石油降解菌，分離篩選這些微生物并對(duì)其進(jìn)行深入研究，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)石油降解菌資源和開(kāi)展石油污染的生物修復(fù)工作提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）