徐傳標(biāo),霍冬雪,胡淇淞,李從發(fā),張家超

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

海南發(fā)酵食品魚茶中乳桿菌發(fā)酵特性的研究

徐傳標(biāo),霍冬雪,胡淇淞,李從發(fā),張家超*

(海南大學(xué)食品學(xué)院,海南?？?570228)

在前期研究中,從海南省傳統(tǒng)發(fā)酵食品魚茶中分離獲得144株乳桿菌,主要隸屬于植物乳桿菌、戊糖片球菌、香腸乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及干酪乳桿菌等。本文從發(fā)酵應(yīng)用的角度出發(fā),對分離得到的乳桿菌進(jìn)行了一系列的魚肉發(fā)酵特性實(shí)驗(yàn),包括pH變化率實(shí)驗(yàn),耐食鹽、耐亞硝鹽實(shí)驗(yàn)、氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)等。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:R19-5,M1-4,R21-3,R21-4和RD-1五株菌具有快速產(chǎn)酸能力,經(jīng)過12～16 h發(fā)酵后,pH分別能達(dá)到3.75、3.89、3.86、3.73和3.74,同時都能耐受150 mg/kg NaNO2溶液和8%鹽濃度;菌株在發(fā)酵時都不產(chǎn)氨基酸脫羧酶。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果,篩選出具有優(yōu)良發(fā)酵特性的植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)3株,香腸乳桿菌(Lactobacillusfarciminis)1株和短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)1株。本研究將對尋找優(yōu)良的肉制品發(fā)酵劑和合理利用新的生物資源具有一定的理論指導(dǎo)作用。

魚茶,乳桿菌,發(fā)酵性能

海南魚茶是我國海南黎族和苗族的一種傳統(tǒng)淡水全魚發(fā)酵制品,產(chǎn)品具有回甜咸鮮、香氣獨(dú)特、回味醇厚、保質(zhì)期長等特點(diǎn),其是一種高蛋白、低脂肪、富含多種游離氨基酸的風(fēng)味食品。本課題組對魚茶制品進(jìn)行了菌相分析，分離出制品中乳酸菌同時對可培養(yǎng)部分的菌進(jìn)行分離純化后測序鑒定出其種屬關(guān)系。其中乳酸菌包括植物乳桿菌、戊糖片球菌、香腸乳桿菌、短乳桿菌、棒狀乳桿菌、鼠李糖乳桿菌及干酪乳桿菌等144株[1]。

在熱帶或亞熱帶地區(qū),人們?yōu)榱嗽诟邷亍⒏邼穸葪l件下保存魚肉,采用發(fā)酵的方式加工傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品。發(fā)酵魚制品具有濃郁的發(fā)酵風(fēng)味,還具有獨(dú)特的保健作用,深受當(dāng)?shù)厝嗣竦南矏?。國?nèi)外學(xué)者對發(fā)酵魚制品進(jìn)行研究,其中東南亞地區(qū)的Nampla、Bakasang[2-3]等傳統(tǒng)發(fā)酵魚制品進(jìn)行了菌相分析和優(yōu)勢菌種的篩選,發(fā)現(xiàn)乳酸菌為重要的優(yōu)勢菌群,且與產(chǎn)品品質(zhì)有著密切的關(guān)聯(lián)性。乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素能抑制或殺死食源性致病菌,應(yīng)用生物發(fā)酵方法來保持和改善肉類制品的品質(zhì)或抑制腐敗菌的生長是一種很好的食品加工保藏方法[4],同時乳酸菌還有重要的益生功效,如抗癌、降膽固醇、抗氧化、抑菌抗病等[5-8]。但海南魚茶發(fā)酵制品自然發(fā)酵方法進(jìn)行手工作坊式生產(chǎn),存在著發(fā)酵時間長、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差、安全性低等問題。在自然發(fā)酵的情況下存在著其他雜菌生長代謝影響產(chǎn)品的安全性及穩(wěn)定,并且不同型乳酸菌代謝也會極大的影響產(chǎn)品的風(fēng)味。發(fā)酵劑的選擇對發(fā)酵制品后期成品的組織結(jié)構(gòu),安全,風(fēng)味等特性起關(guān)鍵性作用。

表2 海南魚茶中分離出的乳酸菌的耐鹽實(shí)驗(yàn)Table 2 Salt tolerance test of lactic acid bacteria isolated from Hainan Yucha

注:1:分離的菌株數(shù)2:實(shí)驗(yàn)存活百分含量(%)，是指占該類菌株的百分含量。表3、表4同。本課題組對魚茶制品菌相分析,發(fā)現(xiàn)乳酸菌是重要的優(yōu)勢菌,而迄今為止,對海南魚茶制品中乳酸菌的菌種特性尚無相關(guān)報(bào)道。本研究也是首次對海南傳統(tǒng)發(fā)酵魚茶制品中存在的乳酸菌菌株特性的考查,對改進(jìn)我國魚發(fā)酵制品傳統(tǒng)發(fā)酵工藝、實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)具有理論指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

于魚茶制品中分離出的144株乳桿菌(已完成分離鑒定見表1)。

表1 魚茶中微生物分離鑒定結(jié)果Table 1 Results of isolation and identification of microorganisms in Yucha

蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、瓊脂、酵母膏、溴甲酚紫、精氨酸、半胱氨酸等 BR 級;膽鹽、NaCl、檸檬酸二銨、KH2PO4、NaOH、HCl、NaNO2等試劑 AR 級;MRS 培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

PB303-N型電子精密天平 梅特勒-托利多儀;RE-5203AA型立式旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮儀器設(shè)備有限公司;YXQ SG41.280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠;CSY-2型超凈工作臺 上海凈化設(shè)備廠;TD5M型臺式低速離心機(jī) 長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 乳酸菌的生長性能及pH變化率 采取Ammor等人[9]的方法并做修改。將分離得到的不同乳酸菌株接種到MRS 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng),同時以未接種的MRS 液體培養(yǎng)基作空白對照,37 ℃培養(yǎng)0 h開始每隔2 h后分別測定其pH。

1.2.2 耐鹽性實(shí)驗(yàn)、耐亞硝鹽測定 采用胡永金等人[10]和趙亞娟等人[11]方法并做修改。將活化后待測乳酸菌株以1%(v/v)接種至含有2%、4%、8%、10%的NaCl濃度,0、50、100、150 mg/kg的NaNO2濃度液體MRS 培養(yǎng)基中,分別在37 ℃厭氧培養(yǎng)36 h和24 h,同時做空白對照,于λ=600 nm 處測定其OD 值。

1.2.3 氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)方法 采用Ammor等人[9]的并做修改。將活化后的待測菌株分別按1%(v/v)接入添加有1%(m/v)組氨酸、酪氨酸、賴氨酸及鳥氨酸的含0.06%溴甲酚紫作為指示劑的MRS 培養(yǎng)液中,37 ℃厭氧培養(yǎng)7 d后觀察培養(yǎng)液顏色變化,顏色由黃變紫表示菌株氨基酸脫羧酶活性陽性。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 所得數(shù)據(jù)為三次測定值的平均值,通過Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,用origin作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽、耐亞硝酸鹽測定

根據(jù)比濁法原理,以菌株在MRS 液體培養(yǎng)基OD 值的變化,作為微生物生長指標(biāo),研究菌株的耐鹽和耐亞硝酸鹽特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

由表2可得出,篩出的菌株均能耐受4%鹽濃度,8%鹽濃度下對一些菌有抑制作用但是其中13.4%乳桿菌,5.6%戊糖乳桿菌,4.2%香腸乳桿菌能耐受8%鹽濃度,所測試菌株均不能耐受10%鹽濃度。經(jīng)過耐鹽初篩出的42株乳酸菌進(jìn)行耐鹽硝酸實(shí)驗(yàn),結(jié)果見表3,篩選出的菌株在150 mg/kg濃度下的硝酸鹽環(huán)境下生長正常,均未出現(xiàn)對其產(chǎn)生抑制作用。

表3 海南魚茶中分離出的乳酸菌的耐亞硝酸鹽實(shí)驗(yàn)Table 3 Nitrite tolerance test of lactic acid bacteria isolated from Hainan Yucha

表4 氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Test results of amino acid decarboxylase

注:“-”表示實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。2.2 乳酸菌的生長性能及pH變化率

2.2.1 乳酸菌生長曲線 由圖1,乳酸菌R19-5,M1-4,R21-3,R21-4,RD-1等五株菌在2 h后進(jìn)入生長對數(shù)期,12～14 h 后達(dá)到生長穩(wěn)定期,而其他乳酸菌進(jìn)入對數(shù)期的時間較上述五株菌稍有延后,但其進(jìn)入穩(wěn)定期時間相一致。

圖1 生長曲線Fig.1 Growth curve

2.2.2 pH變化率 乳酸菌生長過程的pH變化率見圖2,6株植物乳桿菌和其他6株菌顯示了較快的pH變化率,在37 ℃,14 h和16 h 內(nèi)分別使pH迅速降至4.0以下。pH變化表明,乳酸菌R19-5,M1-4,R21-3,R21-4,RD-1均能快速形成乳酸,12 h后pH由起始的pH5.87降至pH3.8左右,而后趨于緩慢下降,在20 h后pH分別能達(dá)到3.75、3.89、3.86、3.73、3.74。

圖2 pH變化Fig.2 pH change of the samples

2.3 氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過耐鹽篩選后,對42株菌進(jìn)行氨基酸脫羧酶實(shí)驗(yàn),通過表4可確定其中所有菌株均未有產(chǎn)氨基酸脫羧酶的陽性反應(yīng)。

3 討論與結(jié)論

乳酸菌的生長性能和產(chǎn)酸能力在發(fā)酵過程中起著重要的作用,接入基質(zhì)中后在經(jīng)歷盡可能短的停滯期后,乳酸菌應(yīng)能夠迅速增殖,快速積累乳酸,以減少致病菌和腐敗菌生長導(dǎo)致的危害[15]?？焖俚漠a(chǎn)酸能夠有效抑制致病菌的生長、加速產(chǎn)品風(fēng)味的形成、促進(jìn)產(chǎn)品色澤形成等作用。RingoE[16]等人研究了9株乳酸菌對魚源致病菌抗菌活性研究發(fā)現(xiàn),其所產(chǎn)的乳酸等酸能抑制病原菌的生長。所測試的菌株具備快速產(chǎn)酸能力,其中由生長曲線圖發(fā)現(xiàn)12株菌進(jìn)入穩(wěn)定期后曲線很快下降的原因可能是在三角瓶中發(fā)酵受限于容積和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。測試菌株在12～16 h能達(dá)到穩(wěn)定期而文獻(xiàn)中大多是16～22 h才能達(dá)到,這可能是乳酸菌在培養(yǎng)時與其設(shè)置的溫度相關(guān),文獻(xiàn)中采用多采用30 ℃,而本次實(shí)驗(yàn)選取37 ℃培養(yǎng)從而使其代謝增快而導(dǎo)致的[17],其次可能是菌株的生長特性。

生物胺(biogenic amines,Bas)是一類含氮的脂肪族、芳香族或雜環(huán)類有機(jī)化合物的總稱。國外學(xué)者研究認(rèn)為BAs在發(fā)酵肉制品中普遍存在,特別是在發(fā)酵香腸中發(fā)酵食品中的BAs主要是由于游離氨基酸被微生物產(chǎn)生的脫羧酶脫羧形成[18-19]。發(fā)酵肉制品中的部分乳酸菌具有氨基酸脫羧酶活性,尤其在低pH和高水分含量的條件下,它們往往脫羧某些特定的氨基酸,生成酪胺、組胺、尸胺、腐胺及苯基乙胺。這些化合物不僅會影響發(fā)酵食品的風(fēng)味而且其會對人健康產(chǎn)生危害。因而,研究海南傳統(tǒng)魚茶制品中的乳酸菌是否具有氨基酸脫羧酶活性,對了解魚茶制品的安全品質(zhì)及產(chǎn)品是否具備推廣價值具有十分重要的意義。

優(yōu)良的肉制品發(fā)酵劑具有安全性,耐6%鹽,耐亞硝酸,在15～40 ℃下生長,快速產(chǎn)酸抑菌等特性[18]。本文研究擬在海南的傳統(tǒng)魚茶制品中分離出乳酸菌并對分離出的乳酸菌進(jìn)行篩選,以期篩選出具有潛在優(yōu)良商業(yè)價值的肉制品發(fā)酵劑。本文在海南魚茶制品中共分離出144株乳酸菌基礎(chǔ)上,分別對各菌株進(jìn)行生理生化、pH變化率、耐鹽及亞硝酸鹽、氨基酸脫羧酶及生長曲線的菌株特性研究。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3株植物乳桿菌(R19-5,M1-4,R21-3),1株香腸乳桿菌(R21-4)和1株短乳桿菌(RD-1)具有產(chǎn)酸速率快、高耐鹽、無氨基酸脫羧酶活性等特性,并發(fā)現(xiàn)其具有開發(fā)成淡水魚發(fā)酵制品發(fā)酵劑的潛力。

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Fermentation characteristics ofLactobacillusisolated in Hainan fermented food Yucha

XU Chuan-biao,HUO Dong-xue,HU Qi-song,LI Cong-fa,ZHANG Jia-chao*

(College of Food Science,Hainan University,Haikou 570228,China)

In previous study,a total of 144 strains ofLactobacilluswere isolated from Yucha,a traditional fermented food of Hainan province. After identification,these strains mainly belonged to theLactobacillusplantarum,Lactobacilluspentosus,Lactobacillusfarciminis,Lactobacillusbrevis,Lactobacilluscasei,LactobacilluscoryniformisandLactobacillusrhamnosus. From the perspective of fermentation application,we had made a series ofLactobacillusfermentation characteristic test,including acidification rate test,resistance to salt and the nitrate test,amino acid decarboxylase test. Experimental results showed that:R19-5,M1-4,R21-3,RD-1and R21-4 had fast capacity of acid,after 12～14 h after fermentation,pH can reach 3.75,3.89,3.86,3.89 and 3.86,both tolerated concentration of 150 mg/kg NaNO2and 8% NaCl. Strains in the fermentation did not produce amino acid decarboxylase. The results showed that 3Lactobacillusplantarumstrains,1Lactobacillusfarciminisstrain and 1Lactobacillusbreviswith excellent fermentation characteristics were selected based on the comprehensive test. This research had certain theoretical guidance for looking for excellent meat starter cultures and rational utilization of biological resources.

Yucha;Lactobacillus;fermentation;performance

2016-10-24

徐傳標(biāo)(1990-),男,碩士研究生,研究方向:食品微生物,E-mail:myyou163@163.com。

*通訊作者:張家超(1986-),男,博士,教授,研究方向:食品微生物,E-mail:zhjch321123@163.com。

海南省高等學(xué)校科學(xué)研究項(xiàng)目(Hnky2016-12);海南大學(xué)科研啟動基金(KYQD1548)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0117-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.004