鄧永平,郭建華,艾瑞波,馬占春,劉曉蘭,王曉杰

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江齊齊哈爾 161006; 3.齊齊哈爾大學(xué)理學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

好食脈孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶條件的優(yōu)化

鄧永平1,2,郭建華1,2,艾瑞波3,馬占春3,劉曉蘭1,2,王曉杰1,2

(1.齊齊哈爾大學(xué)食品學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006; 2.黑龍江省普通高校農(nóng)產(chǎn)品深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,黑龍江齊齊哈爾 161006; 3.齊齊哈爾大學(xué)理學(xué)院,黑龍江齊齊哈爾 161006)

本文以脂肪酶活力為測定指標(biāo),通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定好食脈孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:培養(yǎng)基由麩皮和豆粕組成,比例為5∶3,培養(yǎng)基中添加1.0%的tween80以及0.1 g/L的 KCl,培養(yǎng)基初始pH為6.0,250 mL三角瓶裝液量50 mL,接種量為1%,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間72 h,優(yōu)化后脂肪酶活力達(dá)到377.51 U/mL,較優(yōu)化前提高了約6倍。通過優(yōu)化有效的提高了好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶的活力。

好食脈孢菌,脂肪酶,液體發(fā)酵,培養(yǎng)基優(yōu)化,培養(yǎng)條件

脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3)又稱為三?；视王；饷?在油水界面可以催化三酰甘油酯及一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)[1]。脂肪酶催化反應(yīng)具有區(qū)域選擇性和對映選擇性,反應(yīng)條件溫和,副產(chǎn)物少,被廣泛的應(yīng)用于食品、化工、畜牧業(yè)、制藥等領(lǐng)域[2]。市售的脂肪酶價(jià)格均相對較高,限制了其大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用,因此,亟需研發(fā)新型質(zhì)優(yōu)價(jià)廉的脂肪酶。微生物生長條件寬泛、培養(yǎng)周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng),是開發(fā)商業(yè)脂肪酶的主要來源。科研人員研究了Candidautilis(假絲酵母)、PenicilliumcamembertiiKCCM 11268(卡門柏青霉)、Thermomyceslanuginosus(嗜熱絲孢菌)、CandidarugosaNCIM 3462(皺褶假絲酵母)、Pichiapastoris(畢赤酵母)、Stenotrophomonasmaltophilia(嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌)、Penicilliumchrysogenum(產(chǎn)黃青霉)等微生物產(chǎn)脂肪酶的情況[3-9]。

工業(yè)和農(nóng)業(yè)加工下腳料一般含豐富的有機(jī)質(zhì),且價(jià)格低廉、來源豐富,是培養(yǎng)微生物的良好基質(zhì),通過固體發(fā)酵或液體發(fā)酵可以用于生產(chǎn)脂肪酶等菌體代謝產(chǎn)物。Moftah O A研究了假絲酵母固態(tài)發(fā)酵橄欖油餅生產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,堿處理橄欖油餅后,補(bǔ)充麥芽糖和酵母提取物使脂肪酶產(chǎn)量提高了39%[3]。Coradi G V等人比較了哈茨木霉發(fā)酵農(nóng)業(yè)或工業(yè)廢渣產(chǎn)脂肪酶的情況,發(fā)現(xiàn)無論液體發(fā)酵還是固體發(fā)酵,培養(yǎng)基中添加1%(v/v)的橄欖油都可以有效提高產(chǎn)酶量[10]。Salgado J M等人利用橄欖油廠和酒廠的下腳料作為培養(yǎng)基質(zhì)固態(tài)發(fā)酵曲霉生產(chǎn)脂肪酶,發(fā)現(xiàn)尿素是影響脂肪酶產(chǎn)量的關(guān)鍵因子[11]。Venkatesagowda B等人以椰子油粕為原料固體發(fā)酵LasiodiplodiatheobromaeVBE-1,發(fā)現(xiàn)一定量的礦物鹽和椰油均可以增強(qiáng)脂肪酶活性[12]。Fleuri L F等人研究發(fā)現(xiàn)以75%麥麩和25%甘蔗渣為培養(yǎng)基,含水量40%時(shí)脂肪酶產(chǎn)量為10.82 U/g[13]。利用工農(nóng)業(yè)加工下腳料培養(yǎng)微生物生產(chǎn)脂肪酶,不僅可以降低脂肪酶的生產(chǎn)成本,而且為這些物質(zhì)的再利用及生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品提供了新的途徑。

本文中使用的菌種是分離自北方傳統(tǒng)發(fā)酵食品的好食脈孢菌(Neurosporasitophila)菌株17號,該菌株是遺傳學(xué)和生物化學(xué)研究中非常重要的模式生物,是FDA組織認(rèn)證的安全菌株之一[14]。好食脈孢菌生長速率快,是其它工業(yè)真菌如黑曲霉和產(chǎn)黃青霉的兩到三倍。本研究利用麩皮和豆粕為底物培養(yǎng)好食脈孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶,通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)確定了培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件,以期為微生物發(fā)酵廉價(jià)底物生產(chǎn)脂肪酶提供新思路,為降低脂肪酶的生產(chǎn)成本提供新方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

好食脈孢菌(Neurosporasitophila),保藏號CGMCC No.1836。

對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP) ALADDIN,其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑;隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱PYX-DHS 上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;雙層振蕩培養(yǎng)箱DZP-2F 金壇市城西崢嶸儀器廠;PHS-25型酸度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;himac CF15RX冷凍離心機(jī) 天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 脂肪酶的生產(chǎn)

斜面培養(yǎng):斜面培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA),配制方法見參考文獻(xiàn)[15]。將菌體接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)中,在28 ℃培養(yǎng)3 d。

種子培養(yǎng):種子培養(yǎng)基組成為3%麩皮水和1.5%蛋白胨。將15 g麩皮加入到500 mL水中,浸泡1 h,煮沸1 h,向過濾后的濾液中加入7.5 g蛋白胨,冷卻到室溫,補(bǔ)水至500 mL,初始pH為5.0。250 mL三角瓶中裝50 mL培養(yǎng)基,滅菌冷卻后加入1 mL孢子懸浮液(107個(gè)孢子/mL)。將三角瓶在28 ℃、150 r/min搖床上振蕩培養(yǎng)15 h。

液體發(fā)酵:碳源、氮源及濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要而定。250 mL三角瓶中含有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基,121 ℃滅菌30 min。培養(yǎng)結(jié)束后,將發(fā)酵液在4 ℃條件下10000 r/min離心10 min,取上清液即為粗酶液。

1.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

碳源分別為麩皮、馬鈴薯汁、玉米粉、葡萄糖和蔗糖,添加量均為0.8 g/L;氮源分別為玉米蛋白粉、蛋白胨、玉米粉、豆粕、豆渣和豆餅,添加量均為0.8 g/L,通過實(shí)驗(yàn)確定合適的碳、氮源。培養(yǎng)基干料共8 g,調(diào)整碳氮源比例為7∶1、6∶2、5∶3、4∶4、3∶5、2∶6進(jìn)行實(shí)驗(yàn),接種量1%,28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,離心后取上清液測定脂肪酶活力,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.4 誘導(dǎo)物種類的篩選

待篩選誘導(dǎo)物分別為大豆油、橄欖油、玉米油,添加量為0.1 g/L,表面活性劑為tween80和SDS,其中tween80的體積分?jǐn)?shù)為0.1%,SDS的添加量為0.01 g/L,接種量1%,28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,離心后取上清液測定脂肪酶活力。

分別調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)物的體積分?jǐn)?shù)為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%,從而確定誘導(dǎo)物的最適添加量。

1.5 金屬離子對酶活力的影響

實(shí)驗(yàn)研究了0.1 g/L KCl、CaCl2、MgSO4、FeSO4對產(chǎn)酶的影響,對照組不添加金屬離子。在250 mL三角瓶中添加5 g麩皮、3 g豆粕、0.1 mL/L tween80,加入蒸餾水40 mL,121 ℃滅菌30 min,冷卻后加入經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌的0.5 g/L金屬離子溶液10 mL,接種量1%,28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)72 h,離心后取上清液測定脂肪酶活力,平行實(shí)驗(yàn)三次。

1.6 液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

通過單因素實(shí)驗(yàn)對影響好食脈孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,包括培養(yǎng)基初始pH(以0.1 mol/L的HCl或NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的初始pH分別為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0),接種量(液體種子的體積分?jǐn)?shù)為0.5%、1%、3%、5%、7%、10%、15%),培養(yǎng)溫度(23、28、33、38 ℃),搖床轉(zhuǎn)速(90、120、150、180、210 r/min)和發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、60、72、84、96 h),并且在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中使用最佳條件,平行實(shí)驗(yàn)三次。

利用正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)條件。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上選擇優(yōu)化因素和水平,具體見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 factors and levels of optimization study

1.7 脂肪酶活力測定

通過對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)方法測定脂肪酶的活性。在37 ℃條件下,將脂肪酶1 h催化p-NPP生成1 μg的對硝基苯酚(p-NP)定義為一個(gè)酶活力單位,以U/mL表示[16]。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2003和SPSS 11.5分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,并結(jié)合Duncan氏法做多重比較,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次,結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

通過對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPP)方法測定脂肪酶的活性。圖1為p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1 p-NP標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of p-NP

如圖1所示,標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2為0.9983,接近于1,可以用于計(jì)算脂肪酶的活力。

2.2 碳源、氮源對產(chǎn)酶的影響

2.2.1 碳源對產(chǎn)酶的影響 碳源是微生物細(xì)胞營養(yǎng)和能量的來源,在選擇碳源時(shí)要考慮其降解物對脂肪酶生物合成的阻遏和誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)選擇麩皮,馬鈴薯汁,玉米粉,葡萄糖和蔗糖,添加量均為0.8 g/L,結(jié)果見圖2。

圖2 碳源對產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of carbon sources on lipase production

如圖2所示,與麩皮作為碳源的結(jié)果相比,培養(yǎng)基中添加葡萄糖顯著影響脂肪酶的合成(p<0.05),酶的活力只有7 U/mL。Moftah O A等人在研究產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵油粕生產(chǎn)蛋白酶時(shí),也發(fā)現(xiàn)葡萄糖對產(chǎn)酶有明顯負(fù)面影響[3]。麩皮中含有豐富的纖維和淀粉,經(jīng)酶促水解后兩者皆可為好食脈孢菌菌體的生長及產(chǎn)酶提供碳元素。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,麩皮作為碳源對酶的生產(chǎn)最有利,脂肪酶活性為58.5 U/mL。

2.2.2 氮源對產(chǎn)酶的影響 氮源在酶的合成中起重要作用,氮源分為無機(jī)氮源和有機(jī)氮源。無機(jī)氮源常常是速效氮源,能夠使生物量快速增高,但是不利于酶的生產(chǎn)[3]。有機(jī)氮源可為細(xì)胞生產(chǎn)提供生長因子和氨基酸,這是細(xì)胞代謝和酶的合成所需要的。因此,本研究主要考察了有機(jī)氮源對脂肪酶生產(chǎn)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 氮源對產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on lipase production

玉米蛋白粉含62%～71%的蛋白質(zhì),但是由于溶解性差,限制了其應(yīng)用范圍[17]。采用微生物法或酶法可以改善玉米蛋白粉性質(zhì),增加溶解性及利用率[18]。從圖3結(jié)果可以看出,好食脈孢菌可以利用玉米蛋白粉為底物生產(chǎn)脂肪酶,但是產(chǎn)酶活力較低。豆粕和豆餅都為制油的副產(chǎn)物,含有約41%～42%的蛋白質(zhì),但是兩者蛋白質(zhì)的氨基酸組成上有差異[19-20],從圖3可以看出,豆粕適宜作為脂肪酶生產(chǎn)的氮源。玉米粕中含粗蛋白質(zhì)約18%～20%[21],豆渣蛋白質(zhì)含量約3.0%[22],蛋白質(zhì)含量都明顯低于豆粕,產(chǎn)酶活力也不高。

有機(jī)氮源可提高脂肪酶產(chǎn)量,可能是因?yàn)槠浜械牡鞍踪|(zhì)降解產(chǎn)生的短肽可作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑[23]。推測豆粕被菌體代謝產(chǎn)物降解產(chǎn)生的肽段更有利于好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶,所以選擇豆粕作為氮源。

2.2.3 碳氮源比例對產(chǎn)酶的影響 碳氮源比例對微生物的生長和產(chǎn)物的合成很重要,比例不當(dāng)則會(huì)使微生物的生長和產(chǎn)物的合成受到抑制,或者營養(yǎng)物質(zhì)不足減緩微生物生長和產(chǎn)物的合成。碳氮源比例對脂肪酶活力的影響結(jié)果見圖4。

圖4 麩皮與豆粕比例對產(chǎn)酶的影響Fig.4 Effect of the ratio of wheat bran and soybean meal on lipase production

如圖4所示,當(dāng)培養(yǎng)基中碳氮源比例為5∶3時(shí),即麩皮10%和豆粕6%時(shí)脂肪酶的活力最高。麩皮是培養(yǎng)微生物的良好碳源,能夠參與構(gòu)成氨基酸分子的碳骨架,為酶的合成提供充足的碳。豆粕中蛋白質(zhì)含量較高,可用于菌體合成核酸和蛋白質(zhì)等含氮元素的有機(jī)化合物。

2.3 誘導(dǎo)物種類和濃度對產(chǎn)酶的影響

微生物來源的脂肪酶是誘導(dǎo)酶,添加誘導(dǎo)物可以有效提高酶活力,油脂以及可以增強(qiáng)細(xì)胞膜通透性的表面活性劑常被用作脂肪酶誘導(dǎo)物[10,24]。誘導(dǎo)物對脂肪酶產(chǎn)量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5。

圖5 誘導(dǎo)物對產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of inducer on lipase production

tween 80可以影響細(xì)胞脂代謝、改變細(xì)胞膜的組成和結(jié)構(gòu)而促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和酶向細(xì)胞外的分泌[25]。在培養(yǎng)基中適量添加tween80有利于提高好食脈孢菌脂肪酶的活力(見圖5)。Christova N等人報(bào)道了表面活性劑能夠提高酵母細(xì)胞的通透性[24];Long等發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中tween80濃度的增高有利于提高粘質(zhì)沙雷氏菌脂肪酶活力[26]。本文的研究結(jié)果與報(bào)道相似，因此，選擇tween80做為產(chǎn)酶誘導(dǎo)物。

培養(yǎng)基中添加適量的tween80有利于提高產(chǎn)酶量,但是tween80過量添加可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂,菌體內(nèi)容物外溢而死亡,所以需要考察其合適的添加量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。

圖6 培養(yǎng)基中tween80添加量對產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of tween 80 concentration on lipase production

當(dāng)培養(yǎng)基中添加1.0%的tween80時(shí)好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶的活力最高(見圖6)。當(dāng)繼續(xù)增加tween80添加量時(shí)不能進(jìn)一步提高酶的活力,反而會(huì)引起酶活力下降,這是因?yàn)閠ween80濃度提高對菌體細(xì)胞膜產(chǎn)生較大損傷,因而抑制了生長代謝。所以,確定tween80的添加量為1.0%。

2.4 金屬離子對產(chǎn)酶的影響

金屬離子可作為酶的激活劑或參與物質(zhì)代謝,在微生物的代謝過程中具有重要作用。金屬離子對脂肪酶的影響結(jié)果見圖7。

圖7 金屬離子種類對產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of metal ion on lipase production

如圖7所示,與對照相比,培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的KCl或0.1 g/L的CaCl2對產(chǎn)酶有明顯促進(jìn)作用,其中0.1 g/L KCl的促進(jìn)作用更明顯，而0.1 g/L的MgSO4、FeSO4對產(chǎn)酶有一定的抑制作用。

2.5 培養(yǎng)條件對脂肪酶產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基初始pH影響微生物原生質(zhì)膜所帶的電荷以及某些營養(yǎng)物質(zhì)的分解和電離程度,從而影響微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。脂肪酶產(chǎn)量隨培養(yǎng)基初始pH的變化如圖8所示。培養(yǎng)基的初始pH對脂肪酶的活力影響較大,當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為6.0時(shí)對酶活力影響顯著(p<0.05),好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶活力最高;當(dāng)pH降低至5.5時(shí),酶活力比pH6.0下降了50%以上;當(dāng)pH超過6.0時(shí),菌絲體生長不旺盛,產(chǎn)酶能力同時(shí)也下降。

圖8 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of initial pH of the medium on lipase production

好食脈孢菌為好氧菌,接種量過大,會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)容器內(nèi)可利用氧被菌體快速消耗,使菌體在培養(yǎng)后期面臨乏氧而影響生長代謝;接種量過低會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)酶量降低,底物利用率降低。接種量對好食脈孢菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的影響情況見圖9。接種量1%時(shí)好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶活力最高,當(dāng)繼續(xù)增大接種量時(shí)不能進(jìn)一步提高產(chǎn)酶活力,降低接種量酶的活力也隨之降低,因此,選擇1%的接種量進(jìn)行下一步研究。

圖9 接種量對產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of inoculation amount on lipase production

圖10 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響Fig.10 Effect of culture temperature on lipase production

溫度主要通過影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性和生物大分子的活性影響微生物生命活動(dòng),當(dāng)溫度升高時(shí)生物體代謝速率和生長速率都提高,但是溫度過高會(huì)導(dǎo)致生物活性物質(zhì)發(fā)生變性,細(xì)胞功能下降,甚至死亡。因此,研究合適的培養(yǎng)溫度對好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶有重要的意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖10,溫度對脂肪酶的生產(chǎn)有顯著的影響(p<0.05),該菌株的最適產(chǎn)脂肪酶溫度為33 ℃,此時(shí)酶活力為332.67 U/mL,溫度繼續(xù)升高導(dǎo)致產(chǎn)酶活力下降,對菌體生長也存在負(fù)面影響。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 The result of analysis of variance

搖床轉(zhuǎn)速對脂肪酶產(chǎn)量的影響見圖11,當(dāng)搖床低轉(zhuǎn)速時(shí),酶活力下降,可能是因?yàn)槿苎趿拷档蛯?dǎo)致菌體代謝緩慢,產(chǎn)酶能力下降;提高搖床轉(zhuǎn)速時(shí),溶氧量雖然隨之提高,但是剪切力增加,使成熟菌絲橫隔間空泡的增大,導(dǎo)致部分菌絲體斷片無法生長,影響了產(chǎn)酶[27]。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時(shí),好食脈孢菌產(chǎn)脂肪酶活力最高,在此轉(zhuǎn)速時(shí),可能也較適宜tween80乳化誘導(dǎo)產(chǎn)酶。

圖11 搖床轉(zhuǎn)速對產(chǎn)酶的影響Fig.11 Effect of rotation rate on lipase production

培養(yǎng)時(shí)間對脂肪酶產(chǎn)量的影響見圖12。培養(yǎng)時(shí)間對脂肪酶的生產(chǎn)有顯著的影響(p<0.05),培養(yǎng)時(shí)間過短,菌體生長迅速,但是不利于產(chǎn)酶,脂肪酶合成量少;培養(yǎng)時(shí)間過長,培養(yǎng)基中產(chǎn)生的脂肪酶可能會(huì)被菌體分泌到胞外的蛋白酶降解,所以72 h為最佳的培養(yǎng)時(shí)間。

圖12 培養(yǎng)時(shí)間對產(chǎn)酶的影響Fig.12 Effect of the culture time on lipase production

2.6 正交實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析,確定培養(yǎng)基初始pH、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間的變化對酶活力影響較顯著,以這三個(gè)因素作為實(shí)驗(yàn)因子,采用L9(34)設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn),對好食脈孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)條件進(jìn)一步優(yōu)化。每個(gè)實(shí)驗(yàn)水平均重復(fù)3次,對應(yīng)的酶活力取3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值,結(jié)果見表2。

表2 L 9(34)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 The result of L 9(34)orthogonal experiment

由表2可知,根據(jù)其均值判斷其優(yōu)組合為A2B1C2,即初始pH6.0、培養(yǎng)溫度28 ℃、培養(yǎng)時(shí)間72 h。根據(jù)極差判斷影響產(chǎn)酶因素的主次順序依次為B>A>C,即培養(yǎng)溫度>初始pH>培養(yǎng)時(shí)間。

方差分析結(jié)果如表3所示,培養(yǎng)基初始pH和培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶影響顯著。

經(jīng)過發(fā)酵實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該工藝條件較穩(wěn)定。最終確定產(chǎn)酶條件為:250 mL三角瓶中裝有50 mL培養(yǎng)液,其中含有5 g麩皮、3 g豆粕、1% tween80、0.1 g/L的KCl,初始pH為6.0,接種量為1.0%,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,在28 ℃培養(yǎng)72 h后脂肪酶活力達(dá)到377.51 U/mL,較優(yōu)化前提高了約6倍。

3 結(jié)論

本文采用麩皮和豆粕這兩種農(nóng)產(chǎn)品加工下腳料作為培養(yǎng)基主要成分培養(yǎng)好食脈孢菌,利用液體發(fā)酵法生產(chǎn)脂肪酶,確定了好食脈孢菌液體發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件。優(yōu)化后的培養(yǎng)基由麩皮和豆粕組成,兩者比例為5∶3,培養(yǎng)基中添加1.0%的tween80以及0.1 g/L的KCl,初始pH為6.0,250 mL三角瓶裝50 mL培養(yǎng)液,接種量為1%,搖床轉(zhuǎn)速150 r/min,在28 ℃培養(yǎng)72 h后脂肪酶活力達(dá)到377.51 U/mL,較優(yōu)化前提高了約6倍。

通過該方法獲得的脂肪酶來源于安全菌株,具有較高的安全性;所使用的培養(yǎng)基原料不僅來源廣泛,價(jià)格低廉,而且為這些原有資源的開發(fā)利用提供了新的途徑,將取得較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

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Optimization of lipase production byNeurosporasitophilathrough liquid fermentation

DENG Yong-ping1,2,GUO Jian-hua1,2,AI Rui-bo3,MA Zhan-chun3,LIU Xiao-lan1,2,WANG Xiao-jie1,2

(1.College of Food and Biological Engineering,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China; 2.Key Laboratory of Processing Agricultural Products of Heilongjiang Province,Qiqihar 161006,China; 3.College of Science,Qiqihar University,Qiqihar 161006,China)

In this paper,using lipase activity as index,fermentation liquid medium composition and culture conditions for lipase production byNeurosporasitophilawere determined by single factor and orthogonal experiment. The results showed that the optimum conditions were as follows:the medium was composed of wheat bran and soybean meal,and the ratio of wheat bran and soybean meal was 5∶3,1.0% of tween 80 and 0.1 g/L of KCl were added to the medium,initial pH of the medium was 6.0,liquid medium volume was 50 mL in 250 mL triangle bottled,inoculation quantity was 1%,rotate speed was 150 r/min,culture time was 72 h and culture temperature was 28 ℃. Under the optimum conditions,lipase activity reached 377.51 U/mL which was improved by about 6 times than that before optimization. The lipase production fromNeurosporasitophilawas enhanced effectively by optimization.

Neurosporasitophila;lipase;liquid fermentation;optimization;fermentation conditions

2016-09-29

鄧永平(1978-)，女，碩士，副教授，研究方向：微生物學(xué)、酶學(xué)，E-mail：913913_monkey@163.com。

黑龍江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C201329)；齊齊哈爾大學(xué)青年教師科學(xué)技術(shù)類科研啟動(dòng)支持計(jì)劃項(xiàng)目(2014k-Z08)；齊齊哈爾市科學(xué)技術(shù)計(jì)劃項(xiàng)目(SFGG-201578)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)07-0135-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.07.000