劉衛(wèi)衛(wèi)，韓偉，黃國寧

(重慶市婦幼保健院 遺傳與生殖研究所，重慶 400013)

人工卵母細胞激活在ICSI受精失敗周期中的應(yīng)用

劉衛(wèi)衛(wèi)，韓偉，黃國寧*

(重慶市婦幼保健院 遺傳與生殖研究所，重慶 400013)

在輔助生殖技術(shù)領(lǐng)域，人工卵母細胞激活(AOA)是解決單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射(ICSI)低受精或完全未受精周期中精子缺陷所致卵母細胞激活失敗的重要措施。文獻報道AOA的方法包括機械刺激、電刺激和化學激活。但與傳統(tǒng)ICSI相比，ICSI 聯(lián)合AOA(ICSI-AOA)對ICSI 受精失敗周期的有效性和安全性尚難以評估。本文就AOA在ICSI受精失敗周期中的應(yīng)用，包括卵母細胞激活的機制、ICSI受精失敗原因、AOA的方法和AOA的有效性及安全性進行綜述，并探討AOA 在臨床應(yīng)用中存在的問題，以期更好地服務(wù)于臨床。

人工卵母細胞激活； 單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射； 精子缺陷； 受精失敗

In the field of assisted reproductive technology，artifical oocyte activation(AOA)is an important treatment method in ICSI cycle with previous low fertilization rate or total fertilization failure due to oocyte activation failure caused by sperm deficiency.Several methods of AOA including mechanical stimulation，electrical stimulation and chemical activation have been reported.However，it is difficult to assess the clinical efficacy and safety of ICSI with AOA compared with conventional ICSI in the couples of previous fertilization failure.The present article reviews the clinical practice of AOA in ICSI cycle with previous fertilization failure，the mechanism of oocyte activation，and the influent factors of ICSI fertilization failure，as well as AOA methods and the efficacy and safety of AOA，in order to explore the current problems of the clinical practice of AOA and better serve clinical application.

Keywords： Artificial oocyte activation； Intracytoplasmic sperm injection； Sperm deficiency； Fertilization failure

(JReprodMed2017，26(10)：1052-1056)

單精子卵胞漿內(nèi)顯微注射(ICSI)是解決男性不育的主要手段。自1992年第一例ICSI活胎分娩嬰兒出生以來，該技術(shù)得到廣泛的臨床應(yīng)用，使體外受精率提高到70%～80%[1-2]，但仍有1%～5%的完全或接近完全受精失敗[3-4]。導(dǎo)致ICSI受精失敗的原因很多，多數(shù)學者認為ICSI后受精失敗很大程度上歸因于卵母細胞激活失敗[5]。目前對ICSI 受精失敗的病例多采用人工卵母細胞激活(AOA)的方法。本文就AOA在ICSI受精失敗周期中的應(yīng)用，包括卵母細胞激活的機制、ICSI受精失敗原因、AOA的方法和AOA的有效性及安全性，做一綜述。并探討AOA 應(yīng)用存在的問題，以期更好地服務(wù)于臨床。

一、卵母細胞激活的機制

卵母細胞激活由精子誘導(dǎo)的Ca2+振蕩啟動，并伴隨許多有序的生物學事件，其功能是阻止多精受精、誘發(fā)精子進入胞質(zhì)后的雄原核轉(zhuǎn)化過程，促使卵母細胞脫離MII期阻滯，啟動卵母細胞進入分裂后期，繼而開始細胞周期有絲分裂，觸發(fā)合子基因組激活和胚胎發(fā)育事件。有學者研究發(fā)現(xiàn)，精子進入卵母細胞與卵黃膜融合后數(shù)分鐘Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存庫釋放入細胞內(nèi)，引起細胞內(nèi)Ca2+濃度的短暫升高，繼而，Ca2+振蕩持續(xù)存在于受精的整個過程，并隨著受精過程的進行振蕩幅度和頻率逐漸降低，直至原核形成時終止，表明Ca2+是誘發(fā)細胞核質(zhì)變化、受精和胚胎啟動的必要因素[2，5-6]。動物實驗?zāi)Ｐ惋@示正常的卵母細胞激活和胚胎發(fā)育不僅取決于細胞內(nèi)早期短暫的Ca2+濃度升高的扳機作用，很大程度上還取決于后續(xù)Ca2+振蕩的數(shù)量、頻率、幅度和持續(xù)時間的交互作用[7]。卵母細胞激活涉及兩步機制，即通過Ca2+振蕩功能啟動和維持細胞活化。第一步始于精卵質(zhì)膜融合點，為精子誘導(dǎo)的卵漿游離鈣濃度增加所必需的，然后呈波狀式蔓延整個卵母細胞。第二步以短暫Ca2+振蕩為特點，繼而改變卵母細胞內(nèi)部鈣儲存的功能型參數(shù)并支持后續(xù)一系列的Ca2+振蕩[8]。這種在卵母細胞激活階段的Ca2+振蕩特殊類型可能對后續(xù)胚胎發(fā)育產(chǎn)生長遠效應(yīng)，如基因表達、甲基化狀態(tài)等[9-10]?？梢?，Ca2+振蕩在卵母細胞激活和胚胎發(fā)育過程具有非常關(guān)鍵的作用。

卵母細胞激活過程是一個多因素參與的復(fù)雜過程。從卵母細胞角度來看，不能對精子誘導(dǎo)的激活產(chǎn)生反應(yīng)和不能將精子核去濃縮形成雄原核，均被稱為卵母細胞激活失敗，且激活失敗的原因包括精子因素和卵母細胞因素。文獻報道顯示精子核膜周圍的精子特異性磷脂酶C-zeta(PLC-z)缺陷可導(dǎo)致卵母細胞激活失敗[11-13]。精卵融合與精子PLC-z進入卵母細胞有關(guān)，PLC-z可催化1，4，5三磷酸肌醇(IP3)的合成，而IP3是Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的直接調(diào)節(jié)器。因此，精子PLC-z是誘導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+振蕩的重要因素。另外，卵母細胞線粒體功能異?；蛘呗涯讣毎速|(zhì)的不完全成熟狀態(tài)均可能導(dǎo)致卵母細胞激活缺陷[14-15]。

二、ICSI受精失敗原因

自1997年Rybouchkin等[16]首次報道ICSI-AOA獲得妊娠以來，越來越多的研究報道顯示，對前次常規(guī)ICSI未受精或低受精的患者可以采用ICSI-AOA治療[4]。但多數(shù)報道缺乏ICSI未受精或低受精的原因分析和診斷。在臨床治療和管理中，判定是精子因素還是卵母細胞因素導(dǎo)致的卵母細胞激活失敗是非常重要的。并不是所有的ICSI受精失敗周期都能夠通過AOA獲益，據(jù)報道存在精子相關(guān)激活缺陷的這部分周期可能從AOA中獲得“補救”[17]。鼠卵激活實驗(MOAT)(異質(zhì)性ICSI，即將人的精子注射到小鼠的卵母細胞中)是ICSI受精失敗周期的一種診斷方法[18]。根據(jù)MOAT可以初步診斷ICSI受精失敗的原因，若激活率≤20%，可診斷為精子因素導(dǎo)致激活失?。蝗艏せ盥省?5%，可排除精子因素導(dǎo)致的激活失敗；若激活率介于兩者之間，可診斷為存在精子因素和其他不明確的因素。Heindryckx等[18]報道AOA能夠改善精子因素導(dǎo)致ICSI受精失敗周期的臨床結(jié)局。因此，精子因素引起的卵母細胞激活失敗，可能是ICSI受精失敗實施AOA的主要指征。對前次ICSI受精失敗的周期，再次助孕前進行MOAT探求卵母細胞激活失敗的原因是必要的。但有一點需要考慮，在應(yīng)用MAOT的結(jié)果時，不能簡單地認為對小鼠卵母細胞的激活率等同于對人類卵母細胞的激活率。

由于MAOT實驗受到倫理和法律的限制，以及鼠卵在胚胎實驗室使用的不方便性，尋求一種簡便有效的診斷方法顯得尤為重要。大量證據(jù)顯示卵母細胞激活失敗可能是精子核膜周圍的精子特異性PLC-z缺陷導(dǎo)致。因此，采用特異性基因測序方法靶向檢測精子PLC-z編碼區(qū)域，并結(jié)合對精子標本的免疫熒光和免疫印跡檢測，可能為這類患者提供一種有效的診斷方法，同時，這種明確的精子因素導(dǎo)致的卵母細胞激活失敗，亦使重組PLC-z蛋白成為一種潛在的治療試劑[5，19]。

卵母細胞自身狀態(tài)在卵母細胞激活機制中同樣發(fā)揮著重要的作用[2，14-15，20]。卵母細胞核和細胞質(zhì)的不成熟狀態(tài)可能抑制卵母細胞對精子PLC-z激活的反應(yīng)，隨著卵母細胞逐步成熟至MII狀態(tài)，其對激活的反應(yīng)能力逐步增強。另外一些不常見的原因，比如精子DNA去凝集的缺陷、卵母細胞紡錘體的缺陷、卵母細胞質(zhì)量的降低、原核形成的異常和操作技術(shù)因素等[20]，亦可能導(dǎo)致卵母細胞的激活失敗。因此，對ICSI受精失敗周期的原因分析是極其復(fù)雜而又十分必要的。

三、AOA的方法

目前，在輔助生殖領(lǐng)域采用的AOA方法，與卵母細胞正常激活有所不同，多是人工誘導(dǎo)單一的Ca2+升高而無后續(xù)持續(xù)的Ca2+振蕩，即僅僅人工誘導(dǎo)Ca2+升高來啟動卵母細胞激活過程。AOA的方法主要有三種：機械激活、電激活和化學激活。

1.機械激活：在ICSI操作過程中，采用顯微注射針抽吸卵母細胞靠近胞膜的胞漿，然后將抽吸的胞漿連同精子一起注入卵母細胞中央，這種方法即AOA機械激活。Ebner等[21]研究報道，對前次ICSI受精失敗的患者再次助孕采用ICSI-AOA機械激活，可獲得滿意的受精率和臨床妊娠率，并提示采用這種激活方法的目的是聚集胞膜周圍胞漿富含的線粒體，因卵漿周圍區(qū)域的線粒體具有相對較高的膜電位和ATP代謝活性，可增加后續(xù)原核形成位點的能源。同時強調(diào)這種激活方法可能對某些卵母細胞相關(guān)因素所致卵母細胞激活失敗周期有效，在ICSI周期中常規(guī)使用這種方法并不能改善助孕結(jié)局。

2.電激活：外源性直流電引起卵母細胞膜蛋白的重排而形成胞膜孔道，細胞外的Ca2+通過孔道內(nèi)流進入胞漿，誘發(fā)細胞內(nèi)Ca2+濃度升高，這種方法即AOA電激活。Zhang等[22]報道，對常規(guī)ICSI后24 h受精失敗的卵母細胞隨機分三組：1)單次直流電脈沖刺激(1.36 kV/cm～1.50 kV/cm 維持40～60 μs)；2)三次直流電脈沖，每次時間間隔15～20 min；3)對照組(無電脈沖)，研究提示實施電刺激組(組1和組2)可以獲得正常受精和胚胎早期發(fā)育，且胞漿的激活程度與電脈沖的數(shù)量密切相關(guān)。Baltaci等[23]將僅一次常規(guī)ICSI助孕完全受精失敗患者的卵母細胞再次助孕時隨機分為兩組：(1)壓力電脈沖組(單次直流電脈沖，1.50 kV/cm 維持100 μs)；(2)對照組(無壓力電脈沖刺激)，研究發(fā)現(xiàn)壓力電脈沖刺激可顯著提高這部分患者卵母細胞的受精率和胚胎質(zhì)量。但是，出于對電激活操作的復(fù)雜性和安全性的考慮，目前，采用電激活進行AOA的研究報道越來越少見。

3.化學激活：化學激活是ICSI受精失敗周期中最常用的AOA方法。其中，最常用的化學試劑是鈣離子載體，比如卡西霉素(A23187)和離子霉素。鈣離子載體是一種脂溶性的分子，能夠通過卵母細胞膜轉(zhuǎn)運Ca2+，從而使細胞內(nèi)Ca2+濃度一過性升高。研究報道鈣離子載體的激活方法如下：常規(guī)ICSI后30 min，將卵母細胞置于鈣離子載體中(終濃度10 μmol/L，置于胚胎培養(yǎng)箱10 min，15 min或者30 min)激活[17，24-29]。有時，在ICSI操作中連同注射精子一起注射少量CaCl2，然后將ICSI后的卵母細胞置于鈣離子載體中激活[16]。氯化鍶(SrCl2)也是AOA經(jīng)常采用的化學激活試劑，該激活劑的特點與鈣離子載體有所不同，其誘發(fā)卵母細胞內(nèi)Ca2+振蕩的確切機制尚不明確。研究報道氯化鍶的激活方法如下：常規(guī)ICSI后30 min，將卵母細胞置于SrCl2中(終濃度10 μmol/L，置于胚胎培養(yǎng)箱60 min)激活[30-31]。以上幾種化學激活方法是文獻報道中最為常見的，除此之外，還有其他化學激活劑和激活方法的報道，比如，Liu等[32]報道采用7%無水乙醇作為激活劑，對體外培養(yǎng)成熟后ICSI的卵母細胞激活 6 min，指出這種激活方法可能對體外成熟卵母細胞的胚胎早期發(fā)育有益。

四、AOA的有效性和安全性

AOA最早應(yīng)用于圓頭精子癥患者。圓頭精子通常含有圓形或者形態(tài)異常的精子核，這種精子核內(nèi)常伴有大片區(qū)域的空泡且多伴有異常形態(tài)的中段和尾部。因這種精子的頂體蛋白酶活性缺乏或減少而導(dǎo)致卵母細胞激活障礙，進而致使ICSI未受精或者低受精[33]。文獻報道圓頭精子癥患者可以通過ICSI-AOA獲得妊娠[34]。另外，光學顯微鏡檢查精子和卵母細胞正常，大約1%～5%的患者ICSI出現(xiàn)未受精或低受精的結(jié)局。Chi等[35]對1例精液分析正常但ICSI助孕受精率低的男性患者的精子進行超微結(jié)構(gòu)和蛋白表達研究，發(fā)現(xiàn)精子核多空泡和蛋白表達異?？赡苁荌CSI 受精率低的主要原因。Montag等[26]報道采用ICSI-AOA可以顯著提高前次ICSI周期受精率低于30%的患者的受精率和臨床妊娠率。Sfontouris等[4]報道的系統(tǒng)評價顯示ICSI-AOA可以提高某些未受精或低受精患者ICSI助孕的受精率和胚胎質(zhì)量，但該系統(tǒng)評價中所納入的文獻多是個案報道，缺乏大樣本數(shù)據(jù)的文獻報道，而且缺乏ICSI-AOA與傳統(tǒng)ICSI出生兒對照研究。

ICSI-AOA的安全性一直是臨床胚胎工作者備受關(guān)注的問題。Kyono等[31]對前次ICSI受精失敗的9例患者再次ICSI采用氯化鍶(SrCl2)激活，報道5個健康兒出生。Takisawa等[36]報道通過鈣離子載體A23187或氯化鍶(SrCl2)激活獲得的10個出生兒的生長和健康參數(shù)與常規(guī)ICSI獲得的出生兒無明顯差異。Yoon等[27]回顧性分析185例前次ICSI完全未受精或低受精的患者，再次ICSI后采用鈣離子載體A23187化學激活，指出該激活方法可以提高不同精子來源(正常精子、少弱畸形精子和睪丸精子)患者的受精率和助孕結(jié)局，且經(jīng)過ICSI-AOA獲得的38個出生兒無出生缺陷發(fā)生。Vanden Meerschaut等[37]對21個通過ICSI-AOA獲得的3～10歲兒童的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育進行評估，包括智力、語言和社會交際等參數(shù)，認為ICSI-AOA獲得的孩子的這些參數(shù)均在正常范圍。最近Miller等[28]發(fā)表的一篇連續(xù)8年的較大樣本量的關(guān)于ICSI-AOA出生缺陷的回顧性研究，指出前次ICSI低受精患者實施鈣離子載體(ICSI-AOA)激活與實施常規(guī)ICSI助孕的出生缺陷比率及類型，在單胎分娩和雙胎分娩中均未增加。

五、小結(jié)

ICSI-AOA周期妊娠和分娩報道極其有限，AOA對ICSI受精失敗周期是否有效和安全尚缺乏足夠的證據(jù)。患者納入條件和AOA方法的不同，使得文獻報道的數(shù)據(jù)難以匯總。盡管這種“補救”的方式在某些臨床情況可能適用，現(xiàn)有文獻亦無實施ICSI-AOA增加助孕結(jié)局不利方面的報道，但是ICSI-AOA對卵母細胞增加的外界操作和刺激使卵母細胞質(zhì)量發(fā)生的巨大變化及其對安全性的影響是不可忽視的。因此，這種“補救”的方法，在患者充分知情的情況下，仍應(yīng)該謹慎采用。

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[編輯：辛玲]

ClinicalapplicationofartificialoocyteactivationinICSIcycleswithpreviousfertilizationfailure

LIUWei-wei，HANWei，HUANGGuo-ning*

ChongqingReproductiveandGeneticsInstitute，ChongqingObstetricsandGynecologyHospital，Chongqing400013

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.10.019

2017-04-07；

2017-05-05

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學科研項目(20142102)

劉衛(wèi)衛(wèi)，女，河南商丘人，助理研究員，生殖醫(yī)學專業(yè).(*

，Email：gnhuang217@sina.com)