劉 影,丁 祥,2,劉 露,閆香慧,錢 葉,侯怡鈴,*

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川南充 637009;2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,四川南充 637009)

松乳菇多糖對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的影響

劉 影1,丁 祥1,2,劉 露1,閆香慧1,錢 葉1,侯怡鈴1,*

(1.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川南充 637009;2.西華師范大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,四川南充 637009)

運(yùn)用基因芯片技術(shù)分析松乳菇多糖對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的影響及分子機(jī)制。結(jié)果表明,經(jīng)松乳菇多糖600 μg/mL處理48 h后,在人喉癌Hep-2細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)相關(guān)腫瘤差異基因共68個(gè),其中人喉癌Hep-2細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因下調(diào)倍數(shù)大于100倍的基因共8個(gè),下調(diào)50～100倍的基因共14個(gè),同時(shí)按基因轉(zhuǎn)錄水平將這些基因進(jìn)行了分類。運(yùn)用KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析技術(shù)分析相關(guān)基因通路,結(jié)果顯示松乳菇多糖主要抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞中的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在松乳菇多糖的刺激作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞的凋亡是多種基因共同作用的綜合結(jié)果。用篩選出的基因進(jìn)一步研究腫瘤凋亡的分子機(jī)制,對(duì)尋找潛在的抗腫瘤作用靶點(diǎn)具有重要生物學(xué)意義。

松乳菇多糖,人喉癌Hep-2細(xì)胞,基因芯片,凋亡

松乳菇(Lactariusdeliciosus(L.ex Fr.)Gray)為擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、紅菇科、乳菇屬的真菌,是一種純天然的珍稀的野生可食用菌類。松乳菇多數(shù)是植物外生菌根菌,主要分布于溫帶地區(qū)的松林地帶。松乳菇含有羧基有機(jī)酸、羥基酚類、多糖類、倍半萜烯類等多種生理活性物質(zhì),在生物醫(yī)藥行業(yè)和植物林業(yè)病蟲(chóng)害的生物防治方面有廣闊的應(yīng)用前景[1-6]。多糖又稱多聚糖,是由聚合度大于10的單糖通過(guò)糖苷鍵聚合脫水形成的極性復(fù)雜大分子,分子量大小一般為1～100 ku,是生命活動(dòng)中需要的四大基本物質(zhì)的一員,維持生命所需的多種生理功能。至今,從天然產(chǎn)物中分離出來(lái)的多糖類化合物己有300余種,其中,從藥用植物和食藥用真菌中提取出來(lái)的水溶性多糖最為重要,并已發(fā)現(xiàn)從很多藥用植物、食藥用真菌提取的糖以及糖綴合物具有很廣泛的藥理及生物活性。近20年來(lái),已有較多學(xué)術(shù)研究對(duì)多糖生物活性的免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化和抗輻射等方面進(jìn)行報(bào)道[7-8]。

在前期實(shí)驗(yàn)研究中,從食用真菌松乳菇(Lactariusdeliciosus(L.ex Fr.)Gray)中純化所得的水溶性的松乳菇多糖(LDG-A),運(yùn)用光譜學(xué)技術(shù)解析了其結(jié)構(gòu)(圖1),結(jié)果顯示其為一種結(jié)構(gòu)新穎的多糖(LDG-A)[9]。此多糖是由兩個(gè)單糖以糖苷鍵的方式組成的雜多糖,即α-L-甘露糖和α-D-木糖,以3∶1的比例混合組成,平均分子量約為11 ku,具有(1-6)α-L-甘露糖的骨架,2-O上連接一個(gè)→3)-α-D-木糖的側(cè)鏈,且松乳菇多糖(LDG-A)對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞顯示了較強(qiáng)的抑制作用,濃度為600 μg/mL時(shí),最高抑制率達(dá)到50.8%[10],但相關(guān)分子機(jī)制仍不清楚。

本文的主要目的是探究在LDG-A的刺激下,人喉癌Hep-2細(xì)胞腫瘤相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄的變化影響,以研究其抗腫瘤活性的機(jī)制,探尋潛在的抗腫瘤作用靶點(diǎn),為L(zhǎng)DG-A誘導(dǎo)人喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究提供一定的科學(xué)依據(jù)。

圖1 松乳菇多糖(LDG-A)的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of polysaccharide LDG-A

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LDG-A 本實(shí)驗(yàn)室前期分離純化;人喉癌Hep-2細(xì)胞系 川北醫(yī)學(xué)院;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640 gibco公司,LOT:1785905;胎牛血清 CLARK公司,Cat No:JC39761;青鏈霉素雙抗溶液Penicillin-Streptomycin gibco公司;mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒 楚天生物,Cat No:CTB101;實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒Real-Time PCR Master Mix 楚天生物,Cat No:CTB103;熒光定量PCR混合液SYBR Master Mix 楚天生物,Cat No:CTB103;楚天生物PCR 芯片 楚天生物芯片有限公司。

Real-time PCR 儀 購(gòu)于Bio-rad公司,No:CFX96。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將Hep-2細(xì)胞接種于含有熱滅活10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中,在濃度為5%的CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng),取在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞使其細(xì)胞濃度調(diào)整為5×104mL,細(xì)胞貼壁率至少達(dá)到80%后,加LDG-A處理細(xì)胞(終濃度控制為600 μg/mL),在37 ℃、5% CO2、飽和濕度下常規(guī)培養(yǎng)48 h。對(duì)照組除不加松乳菇多糖LDG-A外,其余操作相同。培養(yǎng)板上每組各設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.2 RNA抽提及RNA反轉(zhuǎn)錄 依次用細(xì)胞計(jì)數(shù)器從每個(gè)樣品中取出5×104個(gè)細(xì)胞,采用Unizol 法來(lái)抽提細(xì)胞總RNA,電泳后,結(jié)果顯示18S和28S RNA的條帶非常清晰,流程參照楚天生物mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行RNA 反轉(zhuǎn)錄具體操作。等反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)結(jié)束以后,用ddH2O將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋至100 μL備用。

1.2.3 PCR芯片Real-Time PCR檢測(cè) 取出熒光定量PCR混合液(SYBR Master Mix),使其充分融解,同時(shí)上下輕微顛倒使其混合均勻,稍稍短暫離心(5000 r/min)后放置在冰上備用。處理SYBR Master Mix的同時(shí)取出楚天生物PCR芯片,將其溫度調(diào)至室溫且短暫離心(5000 r/min)后待用。依照說(shuō)明書(shū)配制PCR的反應(yīng)液且充分混勻,精確仔細(xì)分取PCR反應(yīng)液20 μL加至96孔PCR芯片中,用熱封模封好,少許離心(5000 r/min),進(jìn)一步確保所有的試劑都在反應(yīng)管底部。PCR反應(yīng)程序循環(huán)條件為:預(yù)變性95 ℃ 5 min,變性95 ℃ 15 s,退火60 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 45 s,40個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析條件為:95 ℃×5 s,65 ℃×1 min,95 ℃×0 s,冷卻40 ℃×30 s。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 本研究采用經(jīng)典ΔΔCt法做相對(duì)定量。在這次實(shí)驗(yàn)中,ΔΔCT方程式為:ΔΔCT=(CT目標(biāo)樣本-CT參考樣本)-(CT目標(biāo)空白對(duì)照-參考空白對(duì)照)。ΔΔCT用于計(jì)算表達(dá)倍的變化。其計(jì)算公式如下:實(shí)驗(yàn)組目標(biāo)基因的表達(dá)水平/空白對(duì)照組目標(biāo)基因的表達(dá)水平=2(-ΔΔCT)。

圖2 LDG-A誘導(dǎo)人喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的相關(guān)腫瘤差異基因散點(diǎn)圖Fig.2 The differential gene expression of in Hep-2 cells treated by LDG-A

2 結(jié)果與分析

前期研究發(fā)現(xiàn),LDG-A對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞有較強(qiáng)的抑制作用。終濃度為600 μg/mL時(shí),LDG-A對(duì)人喉癌Hep-2細(xì)胞的最高抑制率達(dá)到50.8%。為探究LDG-A誘導(dǎo)人喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,使用基因芯片技術(shù)檢測(cè)分析了人喉癌Hep-2細(xì)胞中腫瘤相關(guān)的88個(gè)基因。

2.1 LDG-A誘導(dǎo)人喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的相關(guān)腫瘤差異基因散點(diǎn)圖

表1 LDG-A作用Hep-2細(xì)胞導(dǎo)致上調(diào)的差異表達(dá)基因

表2 LDG-A作用Hep-2細(xì)胞導(dǎo)致下調(diào)100倍以上的差異表達(dá)基因

表3 LDG-A作用Hep-2細(xì)胞導(dǎo)致下調(diào)50～100倍的差異表達(dá)基因

結(jié)果顯示,把實(shí)驗(yàn)組與空白組相比較,有明顯差異的基因共68個(gè),涉及細(xì)胞因子、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期等相關(guān)基因,其中5個(gè)基因表達(dá)上調(diào),63個(gè)基因表達(dá)下調(diào)(圖2)?；虮磉_(dá)下調(diào)100倍以上有8個(gè),50～100倍有14個(gè),50倍以下41個(gè)。

2.2 基因的分類

按基因表達(dá)水平將基因表達(dá)上調(diào)、下調(diào)100倍以上及50～100倍的基因進(jìn)行分類，具體結(jié)果見(jiàn)表1～表3。

2.3 LDG-A抑制表皮生長(zhǎng)因子受體家族基因的表達(dá)變化

表皮生長(zhǎng)因子受體EGFR(Epidermal growth factor receptor,簡(jiǎn)稱為EGFR、ErbB-1或HER1)是表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族成員之一。該家族包括HER1(erbB1,EGFR)、HER2(erbB2,NEU)、HER3(erbB3)及HER4(erbB4)。在細(xì)胞中HER家族有重要的調(diào)節(jié)作用。EGFR大部分分布于哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞等細(xì)胞表面,EGFR信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的生理過(guò)程有極為重要的作用[11]。在LDG-A的作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞中EGFR、E40OG、ERBB3都呈不同程度的下調(diào),其中E40OG下調(diào)76.30倍,EGFR下調(diào)273.09倍,提示LDG-A通過(guò)抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(HER)家族,抑制信號(hào)傳至胞核內(nèi),導(dǎo)致核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子無(wú)法磷酸化,抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄,最終抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

2.4 LDG-A抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)是近來(lái)發(fā)現(xiàn)TGF-β超家族的成員,其功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化。在松乳菇多糖的刺激作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞中TGFβ1下調(diào)了105.03倍,提示LDG-A通過(guò)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β,從而抑制腫瘤周圍基質(zhì)環(huán)境的改變,抑制上皮細(xì)胞間充質(zhì)的轉(zhuǎn)化,抑制血管新生,從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。[12]。

2.5 LDZ-A抑制髓樣分化因子MYD88的基因表達(dá)

髓樣分化因子(Myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)是Toll樣受體(Toll-likereceptor,TLR)信號(hào)通路中的一個(gè)關(guān)鍵接頭分子,在傳遞上游信息的過(guò)程中發(fā)揮重要作用,在疾病的發(fā)生發(fā)展中也起一定生理作用[13]。MyD88,一種胞質(zhì)可溶性蛋白質(zhì),為Toll/IL-lR家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族組員之一,在松乳菇多糖LDG-A的作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞中MyD88下調(diào)63.30倍,提示LDG-A通過(guò)抑MyD88蛋白,從而抑制調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)產(chǎn)生,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。

2.6 LDG-A影響Asp特異性半胱氨酸蛋白酶Casp家族的基因變化

細(xì)胞凋亡由Asp特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspartate-specific cysteinyl-proteinase,Caspase或Casp)家族介導(dǎo),活化Casp,引發(fā)酶級(jí)聯(lián)效應(yīng),最終使細(xì)胞內(nèi)的染色體DNA降解,隨后細(xì)胞膜解體,細(xì)胞破裂死亡,因此Asp特異性半胱氨酸蛋白酶又稱為死亡蛋白酶。研究發(fā)現(xiàn),Casp家族在細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)過(guò)程中,已經(jīng)有14種Casp(1-14)參與其中。Casp按功能分為啟動(dòng)子Casp(Casp-2,8,9,10)和效應(yīng)子Casp(Casp-3,6,7)。被激活的效應(yīng)子由啟動(dòng)子啟動(dòng)激活,效應(yīng)為:細(xì)胞凋亡。而啟動(dòng)子Casp則被特定的結(jié)合蛋白、其他Casp及本身激活,使凋亡信號(hào)與Casp結(jié)合,改變構(gòu)型,決定兩種基本凋亡途徑,即線粒體途徑和死亡受體途徑[15]。在LDG-A的作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞中CASP2下調(diào)57.94倍,提示LDG-A誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡并不依賴于線粒體途徑和死亡受體途徑兩種基本凋亡途徑。

2.7 LDG-A影響CD40L基因轉(zhuǎn)錄

白細(xì)胞分化呈遞的抗原40和其配體(CD40/CD40L)能提高腫瘤細(xì)胞的抗原遞呈能力,上調(diào)內(nèi)源腫瘤肽的表達(dá),從而提高腫瘤的免疫應(yīng)答[16-17]。在LDG-A的作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞中CD40LG下調(diào)87.88倍,提示LDG-A可影響腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答。

2.8 影響絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族的基因通路

MAPK屬于絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶。MAPK通路主要包括MAPK激酶激酶(MAP kinase kinase kinase,MKKK)、MAPK激酶(MAP kinase kinase,MKK)和MAPK依次被激活,一起調(diào)控著細(xì)胞的多種重要的細(xì)胞生理或病理過(guò)程[18-19]。在LDG-A的作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞中MAP3K1、MAP3K10、MAP3K11、MAP3K14、MAP3K5、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK9基因均呈現(xiàn)不同程度的下調(diào),其中MAP3K10,MAP3K14,MAPK3 分別下調(diào)83.90倍,183.46倍和67.02倍。KEGG通路分析顯示在松乳菇多糖的刺激作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞基因中的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道被抑制(圖3),提示松乳菇多糖(LDG-A)通過(guò)抑制MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖3 松乳菇多糖LDG-A影響人喉癌Hep-2細(xì)胞中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fig.3 MAPK signal transduction pathway in human laryngeal carcinoma Hep-2 cells was affected by the polysaccharide(LDG-A)注:長(zhǎng)方形標(biāo)記的基因?yàn)樯婕暗南抡{(diào)基因;圖4同。

2.9 影響PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的相關(guān)基因通路

PI3K家族中Ⅰ型PI3K被研究的最多,是被細(xì)胞表面受體所激活的蛋白Ⅰ型PI3K,在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中又被分為ⅠA和ⅠB兩個(gè)亞型,ⅠA從酪氨酸激酶連接受體開(kāi)始傳遞信號(hào),ⅠB 從G蛋白連接受體開(kāi)始傳遞信號(hào)。由催化亞單位p110和調(diào)節(jié)亞單位p85結(jié)合,構(gòu)型發(fā)生改變組成新的結(jié)構(gòu)ⅠA型PI3K,新的結(jié)構(gòu)具有類脂激酶和蛋白激酶的兩種活性的功能[20-22];PI3K被激活有兩種方式,一種方式是和具磷酸化酪氨酸殘基的生長(zhǎng)因子受體或連接蛋白相互作用,改變此聚體的構(gòu)象而被激活,另一種方式是由Ras蛋白和p110蛋白直接結(jié)合,PI3K被活化,結(jié)果產(chǎn)生第二信號(hào),即Akt蛋白,Akt蛋白和PDK1相互作用,由此促使PDK1磷酸化Akt蛋白的Ser308而使Akt的活化;活化的Akt通過(guò)磷酸化作用激活或抑制其下游靶蛋白Bad、Caspase9、NF-kB、FKHR、GSK-3、p21Cip1和p27Kip1等,以進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的多種細(xì)胞生理或病理過(guò)程[23]。在松乳菇多糖(LDG-A)的作用下,Hep-2細(xì)胞中JAK、PIK3CA,PIK3CG,PIK3R2,AKT1,AKT2,AKT3,APAF1均有不同程度下調(diào),其中AKT1,AKT2分別下調(diào)76.92倍和120.48倍。KEGG通路分析顯示在松乳菇多糖的刺激作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞基因中的PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通道被抑制(圖4),提示松乳菇多糖(LDG-A)通過(guò)抑制PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

圖4 LDG-A影響人喉癌Hep-2細(xì)胞中PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fig.4 PI3K-AKT signal transduction pathway in human laryngeal carcinoma Hep-2 cells affected by the polysaccharide(LDG-A)

3 結(jié)論

在LDG-A作用下,人喉癌Hep-2細(xì)胞增殖被抑制,部分細(xì)胞被誘導(dǎo)凋亡,這是一個(gè)多基因共同參與、協(xié)同作用的過(guò)程。其中,5個(gè)基因顯示上調(diào),63個(gè)基因顯示下調(diào),KEGG通路分析結(jié)果顯示LDG-A主要抑制人喉癌Hep-2細(xì)胞中的MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和PI3K-AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。比較LDG-A作用前后基因表達(dá)譜的改變,可以深入研究這些差異表達(dá)的基因及之間的聯(lián)系和相互的調(diào)控機(jī)制,為L(zhǎng)DG-A誘導(dǎo)人喉癌Hep-2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制的研究提供更多的科學(xué)依據(jù)。

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Effect ofLactariusdeliciosus(L. ex Fr.)Gray polysaccharides(LDG-A) on tumor associated genes in human laryngeal carcinoma Hep-2 cells

LIU Ying1,DING Xiang1,2,LIU Lu1,YAN Xiang-hui1,QIAN Ye1,HOU Yi-ling1,*

(1.Key Laboratory of Southwest China Wildlife Resources Conservation(Ministry of Education),College of Life Sciences,China West Normal University,Nanchong 637009,China;2.College of Environmental Science and Engineering,China West Normal University,Nanchong 637009,China)

The gene expression and molecular mechanism of cell apoptosis in human laryngeal carcinoma Hep-2 cells induced byLactariusdeliciosusGray polysaccharide(LDG-A)were investigated using genes chips. The results showed there were total 68 genes,which expressed differently treated with LDG-A. Among the 68 genes,8 of them were down-regulated 100 times,and 14 of them were down-regulated 50～100 times. At the same time,these genes were classified according to their transcription level. Using the KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway analysis technique to analyze the related gene pathway,the results showed that LDG-A mainly inhibited the MAPK signal pathway and PI3K-AKT signal pathway in Hep-2 cells. The apoptosis of human laryngeal carcinoma Hep-2 Cells was the combined result of interaction of multiple genes under the treatment of LDGA. Using these screened genes to further study the molecular mechanism of apoptosis of tumor had important biological significance in search for potential anticancer targets.

Lactariusdeliciosus(L. ex Fr.)Gray polysaccharide;human laryngeal carcinoma Hep-2 cells;gene chip;apoptosis

2016-08-29

劉影(1991-)，女，在讀碩士研究生，主要從事細(xì)胞生物學(xué)方面的研究，E-mail:827293725@qq.com。

*通訊作者:侯怡鈴(1983-)，女，博士，教授，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方面的研究，E-mail:starthlh@126.com。

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400016);四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(14CZ0016)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0174-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.025