張 瑤,崔堂兵,宋 妍

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006)

蠟狀芽孢桿菌CZ磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因的克隆表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

張 瑤,崔堂兵*,宋 妍

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院,廣東廣州 510006)

將蠟狀芽孢桿菌CZ中的磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(pmi)進(jìn)行克隆,并在大腸桿菌中進(jìn)行異源表達(dá)。將PCR擴(kuò)增得到的pmi基因與pET-22b(+)表達(dá)載體進(jìn)行連接,轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,構(gòu)建重組菌株BL21-pET22b(+)-pmi,并成功表達(dá)了重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶。結(jié)果顯示:克隆得到pmi基因序列全長(zhǎng)為948 bp,編碼315個(gè)氨基酸。通過(guò)鎳柱HisTrap HP親和層析法純化得到具有活性的重組酶,其蛋白分子大小約為40.8 ku。酶學(xué)性質(zhì)結(jié)果顯示:該酶的最適反應(yīng)溫度為35 ℃,在30～40 ℃酶活力相對(duì)穩(wěn)定;最適pH為7.0,在弱堿性條件下保存12 h后仍存有50%以上酶活力;不同低濃度的金屬離子Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+均對(duì)該酶表現(xiàn)出不同程度的激活作用,其中Mn2+對(duì)該酶激活作用最顯著,當(dāng)其濃度為1 mmol/L時(shí),激活作用最大,而Co2+對(duì)其有明顯的抑制作用。

磷酸甘露糖異構(gòu)酶(PMI),蠟狀芽孢桿菌,克隆表達(dá),酶學(xué)性質(zhì)

磷酸甘露糖異構(gòu)酶(phosphomannose isomerase,簡(jiǎn)稱(chēng):PMI,EC 5.3.1.8)是一種在生物體內(nèi)可逆催化果糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸之間相互轉(zhuǎn)化的金屬酶[1-2],在甘露糖代謝途徑中及GDP-甘露糖的生物合成中均起著重要的作用[3-4]。近年來(lái),有報(bào)道[5]稱(chēng)磷酸異構(gòu)酶不僅可以催化磷酸糖之間的異構(gòu)反應(yīng),也可以作用于單糖異構(gòu)化,表明磷酸糖可以代替自然界中不存在的異構(gòu)酶進(jìn)行糖異構(gòu)化作用,這些酶可以作為生物催化劑[6]來(lái)促進(jìn)和簡(jiǎn)化許多化學(xué)過(guò)程來(lái)生產(chǎn)自然界中含量極少的稀有單糖。

L-核糖[7]是極為昂貴的稀有糖類(lèi),是合成具有抗病毒活性的核苷類(lèi)化合物的潛在起始原料,在自然界并不存在。L-核糖[8]對(duì)抗腫瘤和病毒有良好的效果,并且對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用極小,顯示了強(qiáng)大的抗艾滋病、抗病毒中間體方面的潛能。L-核糖中間體與腺嘌呤等有機(jī)堿形成的核苷衍生物在癌癥、乙肝、丙肝等疾病的治療方面也具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值。近年來(lái),多種來(lái)源磷酸異構(gòu)酶[9-11]已成功應(yīng)用于生物轉(zhuǎn)化法制備L-核糖,但轉(zhuǎn)化效率并不高,而生物轉(zhuǎn)化關(guān)鍵性的一步就是磷酸甘露糖異構(gòu)酶的催化異構(gòu)作用[12]。目前,磷酸甘露糖異構(gòu)酶已成功地從細(xì)菌和真菌等中克隆并在相應(yīng)的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了表達(dá),如大腸桿菌(E.coli)[13]、人類(lèi)(H.sapiens)[14]、白色念球菌(C.albican)[15]、嗜熱脫氮地芽孢桿菌(G.thermodenitrificans)[16]等。已有報(bào)道來(lái)源嗜熱棲細(xì)菌(T.thermophilus)[17]、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)[18]的磷酸甘露糖異構(gòu)酶協(xié)同L-阿拉伯糖異構(gòu)酶等利用L-阿拉伯糖通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法得到L-核糖,而國(guó)內(nèi)幾乎還沒(méi)有來(lái)源于蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的克隆表達(dá)及有關(guān)酶學(xué)性質(zhì)報(bào)道。

本文研究?jī)?nèi)容是對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的蠟狀芽孢桿菌CZ中磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因進(jìn)行克隆,并在E.coliBL21(DE3)中異源表達(dá)。通過(guò)在重組質(zhì)粒中引入6×His-Tag標(biāo)簽,用鎳柱HisTrap HP親和層析純化重組酶,并進(jìn)一步研究其酶學(xué)性質(zhì),為其工業(yè)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蠟狀芽孢桿菌CZ菌株、大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌DH5α、質(zhì)粒pET22b(+) 本實(shí)驗(yàn)室保存;限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和SalI、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T載體及蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量、DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量、Prime START HS DNA聚合酶、細(xì)菌全基因組提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、DNA 純化試劑盒 TaKaRa公司;蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子 賽默飛公司,質(zhì)粒小量提取試劑盒 OMEGA公司;其他試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純;LB培養(yǎng)基、LBA培養(yǎng)基、藍(lán)白斑平板配制等 均按照TaKaRa商品目錄配制。

PCR儀 德國(guó)Biometra東勝創(chuàng)新生物技術(shù)科技有限公司;Eppendorf冷凍離心機(jī) Eppendorf公司;脫色搖床ZD-9556 常州華利達(dá)集團(tuán)有限公司;超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)JY92-IIN 美國(guó)SONICS;紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-2802SH 上海尤尼柯儀器有限公司;SpectraMax M5 酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices;DYY-8C 型電泳儀 北京市六一儀器廠DH1008;HisTrap HP、AKTApurifer 通用電氣(GE)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1pmi基因的克隆 以提取的蠟狀芽孢桿菌CZ菌株的全基因組為模板,根據(jù)已發(fā)表的蘇云金芽孢桿菌(BacillusthuringiensisHD1002,Genebank 登陸號(hào):CP009349)的磷酸甘露糖異構(gòu)酶的全長(zhǎng)基因序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR法擴(kuò)增CZ中pmi基因序列,引物兩端分別引入BamHI和SalI酶切位點(diǎn)。上游引物22bs:5′-CGCGGATCCGACTGAACCATTATTTTTT GCA-3′,下游引物22ba:5′-CGCGTCGACATATTTA CTTGAAACAATACAT-3′。PCR擴(kuò)增條件:98 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物泡電泳切膠回收目的片段。

1.2.2 大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建 將目的片段用BamHI和SalI雙酶切后切膠回收,再與雙酶切后切膠回收的pET22b(+)載體片段在16 ℃下連接過(guò)夜,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,涂布含氨芐青霉素抗性平板,37 ℃下培養(yǎng)過(guò)夜。挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提質(zhì)粒并送廣州艾基生物公司測(cè)序,含正確克隆序列的質(zhì)粒命名為pET22b(+)-pmi。

1.2.3 目的質(zhì)粒在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá) 將含有重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b(+)-pmi的E.coliBL21(DE3)單菌落接種于10 mL的LB液體管(含50 μg/mL的氨芐青霉素)中,37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)過(guò)夜,然后以1% 接種量接入50 mL的LB液體培養(yǎng)基(含50 μg/mL的氨芐青霉素)中,37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6時(shí),加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.1 mmol/L,在30 ℃下誘導(dǎo)6 h。12000 r/min下離心10 min收集菌體,保存于-80 ℃。

1.2.4 重組酶的純化及SDS-PAGE分析 粗酶液的制備:將離心收集的菌體用50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0)洗滌3次,然后按照50～100 mg/mL菌體濃度配成重懸液,冰上超聲破碎(5 s,間隔時(shí)間5 s,重復(fù)100次,功率400 W),然后4 ℃ 12000 r/min下離心20 min去除細(xì)胞碎片,收集的上清液即為粗酶液。

重組酶純化方法:將粗酶液經(jīng)過(guò)0.22 μm濾膜過(guò)濾后使用GE公司的鎳柱HisTrap HP進(jìn)行純化。純化按照操作手冊(cè)進(jìn)行,首先使用結(jié)合緩沖液Buffer A(50 mmol/L PBS緩沖液、20 mmoL咪唑、0.5 mol/L NaCl、pH7.4)平衡預(yù)裝柱,然后開(kāi)始上樣,當(dāng)紫外吸收開(kāi)始上升,同時(shí)離子濃度開(kāi)始下降時(shí),收集一管樣品穿過(guò)液,再用Buffer A洗去非特異性結(jié)合,接著用洗脫緩沖液Buffer B(50 mmol/L PBS緩沖液、500 mmol/L咪唑、0.5 mol/L NaCl、pH7.4)進(jìn)行梯度洗脫結(jié)合蛋白,每個(gè)梯度下觀察到出峰都進(jìn)行收集,最后采用Bradford法[19]進(jìn)行蛋白含量的測(cè)定,以牛血清蛋白BSA溶液作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

目的蛋白分子量的確定用標(biāo)準(zhǔn)SDS-PAGE蛋白電泳法[20],制備12%的分離膠和5%的濃縮膠,在80 V和120 V的電壓下進(jìn)行不連續(xù)垂直平板電泳,凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色。

1.2.5 重組酶活力測(cè)定 Dische等[21]早期提出的測(cè)定酮糖類(lèi)物質(zhì)的方法,即半胱氨酸鹽酸鹽-咔唑法,簡(jiǎn)稱(chēng)BK法,以此法為基本依據(jù)稍微改進(jìn)[22]用來(lái)測(cè)定重組酶pmi活力。BK法的原理是:依據(jù)酮糖物質(zhì)在硫酸溶液中與顯色劑咔唑反應(yīng),顏色會(huì)隨著酮糖含量不同而有差別。1 mL的酶反應(yīng)液[18]中分別加入10 mmol/L的L-核糖,1.5 U/mL重組酶,50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH7.0),在35 ℃下反應(yīng)20 min,再加入終濃度為200 mmol/L的HCl來(lái)終止反應(yīng),最后測(cè)定酶活力。

1.2.6 重組酶酶學(xué)性質(zhì)分析

1.2.6.1 最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性 將酶反應(yīng)液分別在20、25、30、35、40、45、50、60 ℃條件下測(cè)定重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶活力以確定最適反應(yīng)溫度。將酶液在反應(yīng)之前分別在30、35、40 ℃水浴中保溫孵育0.5、1.0、1.5、2.0 h,于最適溫度下測(cè)定經(jīng)過(guò)不同溫度孵育不同時(shí)間酶液的活力以確定酶液在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.2.6.2 最適反應(yīng)pH及pH的穩(wěn)定性 在最適反應(yīng)溫度條件下,將用于測(cè)定的底物pH分別調(diào)至5.0、6.0、7.0、7.6、8.0、9.0,測(cè)定不同pH條件下的重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶活力。然后將酶液反應(yīng)前分別在pH為6.0、7.0、8.0條件下孵育3、6、9、12 h以探究不同pH下的酶的穩(wěn)定性。

1.2.6.3 不同金屬離子及金屬離子的不同濃度對(duì)酶活力的影響 用最適pH的50 mmol/L Tris-HCl 緩沖液配制酶液,分別向酶液中加入終濃度為1 mmol/L的Ni2+、Co2+、Ca2+、Zn2+、Mn2+、Cu2+、Mg2+(以不加金屬離子為對(duì)照),在最適溫度下測(cè)定酶活力,探究不同金屬離子對(duì)酶活力的影響。在反應(yīng)體系加入濃度分別為0.5、1、2、3、4、5 mmol/L的金屬離子,探究最適金屬離子濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1pmi基因的擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建

以提取的蠟狀芽孢桿菌CZ全基因組作為模板,利用設(shè)計(jì)的引物22bs和22ba擴(kuò)增得到pmi目的基因全長(zhǎng),PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得到與預(yù)期大小相符的基因片段,大小約為1000 bp(圖1),該片段與已知的B.thuringiensis(GenBank:CP009349.1)的pmi全長(zhǎng)同源性較高達(dá)98%。鑒定結(jié)果說(shuō)明成功擴(kuò)增并克隆了pmi基因片段。

圖1 PCR產(chǎn)物pmi電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of pmigene PCR amplifiction注:M:DNA Marker;1:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

為了實(shí)現(xiàn)pmi基因在E.coliBL21(DE3)中的成功表達(dá),將擴(kuò)增出的pmi基因片段連接到表達(dá)載體pET-22b(+)上,構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-22b(+)-pmi。將菌液PCR驗(yàn)證初步正確的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒,用BamHI和SalI兩種限制性?xún)?nèi)切酶雙酶切驗(yàn)證重組表達(dá)質(zhì)粒pET-22b(+)-pmi,經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)(圖2)結(jié)果顯示,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液PCR驗(yàn)證結(jié)果與目的基因大小(948 bp)基本相符,用BamHI和SalI兩種限制性?xún)?nèi)切酶從表達(dá)載體pET-22b(+)-pmi切下的條帶與擴(kuò)增出的pmi基因片段及表達(dá)載體pET-22b(+)線性大小相符,說(shuō)明pmi基因已成功插入到載體pET-22b(+)中,重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖2 菌液驗(yàn)證及重組質(zhì)粒雙酶切電泳圖Fig.2 Electrophoresis results of the PCR of bacteria and the recombinant plasmid with double digestion 注:M:DNA Marker;1:陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子菌液PCR驗(yàn)證;2:質(zhì)粒pET-22b(+)經(jīng)BamHI和SalI雙酶切;3:重組質(zhì)粒PET-22b(+)-pmi經(jīng)BamHI和SalI雙酶切。

2.2 序列分析

將初步驗(yàn)證正確陽(yáng)性菌送測(cè)序,結(jié)果顯示克隆片段大小為948 bp,編碼315個(gè)氨基酸。經(jīng)Clustal Omeg在線軟件(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)進(jìn)行蛋白序列比對(duì),其與來(lái)源蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensisHD 1002)的序列同源性為97%,與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、肺炎鏈球菌(S.pneumoniae)、艾丁湖鹽漬芽孢桿菌(S.aidingensis)的同源性都高達(dá)到70%以上,它們都屬于cupin-like超級(jí)家族,序列比對(duì)結(jié)果如圖3所示。

2.3 重組酶的異源表達(dá)及分離純化

將重組質(zhì)粒pET22b(+)-pmi轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行目的基因誘導(dǎo)表達(dá),將表達(dá)后的細(xì)胞破碎液上清進(jìn)行SDS-PAGE分析。根據(jù)Protparam在線蛋白分析軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)蛋白分子量為36.1 ku,加上表達(dá)載體上6×His-Tag標(biāo)簽等序列,最后推測(cè)出表達(dá)出來(lái)的目的蛋白大小約為40.8 ku左右。如(圖4)所示,以空載質(zhì)粒為對(duì)照,在40.8 ku處出現(xiàn)特征條帶,且與目標(biāo)蛋白的理論值吻合,說(shuō)明目的基因在大腸桿菌宿主中成功實(shí)現(xiàn)了重組異源表達(dá)。

將粗酶液經(jīng)鎳柱HisTrap HP親和層析后,收集樣品穿過(guò)液和洗脫峰并進(jìn)行SDS-PAGE(圖5),得到一條特異性條帶,結(jié)果與預(yù)測(cè)蛋白分子量相符。這與來(lái)源大腸桿菌[13]、S.typhimurium[23]、T.thermophilus[17]的PMI蛋白分子量大小(依次分別為36、42.6、29.0 ku)有所差異,可能是由于來(lái)源不同導(dǎo)致同一種蛋白在其生物體內(nèi)具有不同的結(jié)構(gòu)特性,進(jìn)而分子量有所不同。

經(jīng)鎳柱HisTrap HP親和層析純化后,重組酶比酶活為6.18 U/mg,是純化前的4.26倍,回收率為37%,結(jié)果見(jiàn)表1。

此外,根據(jù)1.2.4所述方法,測(cè)得蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6所示,其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=5.3271X+0.0055,相關(guān)系數(shù)R2=0.9955,說(shuō)明在此范圍內(nèi)蛋白質(zhì)濃度與吸光值的線性關(guān)系良好。

2.4 重組酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

2.4.1 溫度對(duì)重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶的影響及重組酶的熱穩(wěn)定性 將純化后的重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶在不同溫度下測(cè)定酶活,結(jié)果圖7(A)顯示,該酶的最適作用溫度為35 ℃,在30～40 ℃范圍內(nèi)測(cè)定酶活,相對(duì)酶活在60%以上。另外,如圖7(B)所示,該酶在30、35、40 ℃保溫2 h,殘余酶活可保持在40%上。Yeom[16]等學(xué)者通過(guò)嗜熱脫氮地芽孢桿菌(Geobacillusthermodenitrificans)來(lái)源克隆得到的PMI最適反應(yīng)溫度為60～70 ℃。由陸春麗[22]用常溫微生物發(fā)酵得到的PMI在35～45 ℃范圍時(shí)PMI酶活力整體相對(duì)較高,當(dāng)溫度超過(guò)50 ℃時(shí),酶活力已經(jīng)降了一半,繼續(xù)升高溫度后酶活力急劇減小,PMI在30 ℃時(shí)穩(wěn)定性最好,與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。此外,Soo[18]研究來(lái)源B.subtilis的PMI也顯示其40 ℃時(shí)酶活力反應(yīng)最高。有些非嗜熱性芽孢桿菌如本文研究的B.cereus生存環(huán)境就是常溫,過(guò)高的溫度會(huì)破壞其體內(nèi)酶構(gòu)象,導(dǎo)致酶活力降低。

表1 重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶的純化

圖4 重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶的SDS-PAGE分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the recombinant phosphomannose isomerase注:M:低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn);1:誘導(dǎo)表達(dá)的重組酶;2:空質(zhì)粒pET-22b(+);3:未誘導(dǎo)的重組酶。

圖5 重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶純化后的SDS-PAGE分析Fig.5 SDS-PAGE analysis of the purified recombinant phosphomannose isomerase注:M:PageRulerTM Unstained Broad Range Protein Ladder;1、2:純化的重組酶;3:流穿液;4純化前的重組酶。

圖6 蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of protein concentration

圖7 溫度對(duì)重組酶活力的影響及其溫度穩(wěn)定性Fig.7 Effect of different temperature on activity of recombinant enzyme and its thermostability注:A:溫度對(duì)重組酶活力的影響;B:重組酶的溫度穩(wěn)定性。

2.4.2 pH對(duì)重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶的影響及重組酶的pH穩(wěn)定性 將純化后的重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶在不同pH下測(cè)定酶活,結(jié)果如圖8(A)所示,該酶最適作用pH為7.0,并且在pH9.0條件下的相對(duì)酶活約為40%。可見(jiàn),重組酶屬于中性偏弱堿性酶;該重組酶在不同pH條件下的穩(wěn)定性如圖8(B)所示,在pH6.0～8.0保存12 h,殘余酶活在50%以上,其中在pH為7.0時(shí)它的穩(wěn)定性最好。這與Yeom團(tuán)隊(duì)研究的來(lái)源G.thermodenitrificans[16]、T.thermodenitrificans[17]、B.subtilis[18]的PMI的最適pH為7.0一致,推測(cè)該酶普遍適應(yīng)中性條件下反應(yīng)。

圖8 pH對(duì)重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶活力的影響及酶的pH穩(wěn)定性Fig.8 Effect of different pH on activity of recombinant enzyme and its pH stability注:A:pH對(duì)酶活力的影響;B:酶的pH穩(wěn)定性。

2.4.3 金屬對(duì)重組磷酸甘露糖異構(gòu)酶的影響 金屬離子的添加,對(duì)單糖異構(gòu)化反應(yīng)的貢獻(xiàn)較大,因?yàn)槎r(jià)金屬離子對(duì)醛糖和酮糖異構(gòu)酶的空間結(jié)構(gòu)起到穩(wěn)定作用,更重要的是這些金屬離子可以結(jié)合的部位基本上是酶的活性中心[24],主要機(jī)理是作用于酮糖和醛糖的C2和C3羥基基團(tuán),進(jìn)而發(fā)生異構(gòu)。如圖9(A)所示,低濃度Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+等對(duì)PMI酶表現(xiàn)出不同程度的激活作用,Mn2+對(duì)重組PMI有較明顯的激活作用,而Co2+對(duì)重組PMI有較明顯的抑制作用。圖9(B)顯示,不同濃度Mn2+的對(duì)酶活力有不同的激活效果,其中濃度為1 mmol/L時(shí),酶活力最高。這結(jié)果與其他不同來(lái)源的PMI比較而言都是低濃度的金屬離子對(duì)酶活有較大促進(jìn)作用,當(dāng)離子濃度過(guò)高反而會(huì)抑制酶反應(yīng)；其次,不同的金屬離子對(duì)來(lái)源不同的PMI酶有不同的作用:如Co2+對(duì)本文來(lái)源的PMI有極大的抑制作用,卻對(duì)來(lái)源B.subtilis[18]、G.thermodenitrificans[12]的PMI的影響最大,是最有效的酶活促進(jìn)劑,提高酶活力分別為2.5、3.0倍左右。0.5 mmol/L的Cu2+對(duì)T.thermophilus[17]來(lái)源的PMI促進(jìn)作用最大達(dá)2.5倍。產(chǎn)生這些差異的原因可能是由于酶的活性中心不同導(dǎo)致的。

圖9 不同金屬離子對(duì)重組酶活力的影響及同一金屬的不同濃度對(duì)重組酶活的影響 Fig.9 Effect of different metal on activity of recombinant enzyme and the effect of different concentration with same metal on recombinant enzyme 注:A:不同金屬離子對(duì)酶活力的影響;B:不同濃度的Mn2+對(duì)酶活力的影響。

3 結(jié)論

成功克隆了本實(shí)驗(yàn)室保存的蠟狀芽孢桿菌CZ中的pmi編碼基因序列,全長(zhǎng)948 bp,與已知B.thuringiensis的pmi核酸序列同源性高達(dá)98%;成功構(gòu)建表達(dá)載體pET22b(+)-pmi,并獲得重組菌株E.coliBL21(DE3)-pET22b(+)-pmi,其在培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右加入0.1 mmol/L IPTG在30 ℃誘導(dǎo)6 h成功表達(dá)重組PMI蛋白。經(jīng)鎳柱HisTrap HP親和層析法純化后得到純化目的蛋白,分子量約為40.8 ku。活性特征鑒定表明,重組PMI最適反應(yīng)溫度為35 ℃,最適反應(yīng)pH為7.0,屬于中性酶,低濃度Ni2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+和Mg2+對(duì)其有不同程度激活作用,Mn2+對(duì)該酶激活作用較為明顯,當(dāng)Mn2+離子濃度為1 mmol/L時(shí),對(duì)酶活激活作用達(dá)到最大,而Co2+對(duì)該酶有較明顯的抑制作用。

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Gene cloning and expression of a phosphomannose isomerase fromBacilluscereusCZ and characterization of the recombinant enzyme

ZHANG Yao,CUI Tang-bing*,SONG Yan

(School of Biological Science and Bioengineering,South China University of Technology,Guangzhou 510006,China)

TheBacilluscereusCZ phosphomannose isomerase gene(pmi)were cloned and heterogeneously expressed inEscherichiacoli. Thepmigene which was amplified by using PCR was connected with pET-22b(+)expression vector,then the recombinant plasmid was transferred toE.coliBL21(DE3). The recombinant strain BL21-pET22b(+)-pmiwas constructed and successfully expressed recombinant enzyme. The results showed that pmigene(948 bp)was cloned and encoded 315 amino acids. The crude recombinant enzyme was purified by HisTrap HP Ni-affinity chromatography and the molecular mass of the purified recombinant enzyme was detected about 40.8 ku. The enzymatic characteristics analysis showed that the optimal temperature was estimated to be 35 ℃,and it retained relatively stable at 30～40 ℃. Meanwhile,the optimal pH of the recombinant enzyme was around 7.0,and relative enzyme activity was retained 50% in weak alkaline environment for 12 h. Various low concentrations of metal ion,such as Ni2+,Ca2+,Zn2+,Cu2+,Mg2+,could activate the recombinant enzyme in different degree. Mn2+had most obviously of activation with a concentration of 1 mmol/L,whereas Co2+had obviously inhibitory effect on the recombinant enzyme.

phosphomannose isomerase;Bacilluscereus;cloning and expression;enzymatic characteristics

2016-09-26

張瑤(1993-)，女，碩士研究生，研究方向：生物工程，E-mail：934952552@qq.com。

*通訊作者:崔堂兵(1967-)，男，博士，教授，研究方向：發(fā)酵工程、酶工程、生物制藥等，E-mail：fetbcui@scut.edu.cn。

廣東省自然科學(xué)基金(S2013010013162)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)06-0195-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.029