劉偉華,李 榮,姜子濤

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

響應(yīng)面法優(yōu)化微波輔助ESR-5樹脂固定化胰蛋白酶

劉偉華,李 榮,姜子濤*

(天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300134)

研究了ESR-5伯氨樹脂為固定化載體,微波輔助固定化胰蛋白酶的條件。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定了固定化胰蛋白酶的最佳條件是:微波溫度35 ℃、加酶量1050 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.53%、pH9.1,微波時(shí)間5 min,在此條件下制備的固定化胰蛋白酶的活力為390.77 U·g-1樹脂。相比傳統(tǒng)固定化方法需要幾個(gè)小時(shí),此固定化方法大大縮短了制備固定化酶的時(shí)間。制備的固定化胰蛋白酶在25～45 ℃的溫度范圍內(nèi)、在pH8.5～10的堿性范圍內(nèi)都較穩(wěn)定;重復(fù)使用11批次后,仍保留了86.7%的初始酶活力;在4 ℃儲(chǔ)藏5周后仍保留了63.7%的初始酶活力,具有較好的穩(wěn)定性。可見利用微波輔助固定化酶是一種值得嘗試的高效方法。

胰蛋白酶,固定化酶,微波輔助,ESR-5伯氨樹脂,響應(yīng)面法

胰蛋白酶是一種堿性蛋白酶,被廣泛用于食品業(yè)、制藥業(yè)、皮革業(yè)、現(xiàn)代生物技術(shù)等領(lǐng)域。但由于液相胰蛋白酶易自溶、解折疊,限制了它的大規(guī)模應(yīng)用。而酶固定化技術(shù)克服了這一不足,能夠使酶的穩(wěn)定性增加并可重復(fù)利用,并且Sun等[1]研究表明固定化胰蛋白酶相比液相胰蛋白酶能夠大大縮短酶解所需的時(shí)間,酶解效率更高。然而固定化酶過(guò)程往往需要幾個(gè)甚至十幾個(gè)小時(shí),比較費(fèi)時(shí)。能夠加速反應(yīng)的方式有很多,如高溫、超聲、微波等。常規(guī)的加熱升溫雖然可以加速反應(yīng)的進(jìn)行,但相比微波加熱所需的時(shí)間要長(zhǎng)很多,且容易造成酶的失活。而酶在超聲的作用下,其在極性的水溶液中穩(wěn)定性較差。近年來(lái),微波作為一種高效的輔助手段被廣泛地應(yīng)用到科學(xué)研究中,包括微波輔助合成反應(yīng)、微波輔助提取、微波輔助酶解等[2-11]。

微波加熱的原理是極性分子在交變電場(chǎng)中發(fā)生極化作用而產(chǎn)生分子熱運(yùn)動(dòng)及相鄰分子間摩擦,從而使電磁能轉(zhuǎn)變成熱能,能夠加速反應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間。由于蛋白質(zhì)和多肽是強(qiáng)極性物質(zhì),所以可以在蛋白質(zhì)和多肽參與的反應(yīng)中引入微波,改變反應(yīng)狀態(tài)。因此,一些國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)利用微波輔助制備固定化酶做了相關(guān)研究。例如在低溫下采用微波輻射技術(shù)將醛縮酶、脂肪酶、木瓜蛋白酶和青霉素?；D(zhuǎn)移酶固定化到功能化介孔泡沫硅(MCFS-NH2)載體上[12-15];Mihailovic等[16]利用微波輻射固定化脂肪酶于Eupergit(R)載體上;Van等[17]采用微波輻射固定化青霉素酰化酶、Chen等[18]在微波輻射條件下鹽溶制備固定化嗜熱菌蛋白酶,結(jié)果都表明微波輻射顯著地縮短了固定化時(shí)間,僅需幾分鐘,制備得到的固定化酶活力高于游離酶且穩(wěn)定性增強(qiáng)。另外還有利用微波輔助固定化漆酶和葡萄糖氧化酶[19]等,但對(duì)于利用微波輔助固定化胰蛋白酶尚未見報(bào)道。

樹脂具有機(jī)械強(qiáng)度高、酶載量大等優(yōu)點(diǎn),被廣泛用作固定化酶載體[20-21],而且以樹脂為載體制備的固定化酶在裝柱后可以進(jìn)行連續(xù)化生產(chǎn),如分解植物餅粕蛋白、魚畜蛋白制備功能肽,飲料澄清等。

本文選用ESR-5伯氨基樹脂為固定化載體,在微波輻射的條件下對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固定化,并采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了固定化胰蛋白酶的制備工藝,為采用微波固定化胰蛋白酶提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

胰蛋白酶(1∶250) 上海阿拉丁生化科技股份有限公司;ESR-5伯氨基樹脂 天津南開合成科技有限公司;50%戊二醛 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑 均為分析純。

FA1104N 型電子天平 上海精密儀器有限公司;Multi SYNTH微波合成儀 意大利Milestone公司;Alpha-1500紫外可見分光光度計(jì) 上海譜元儀器有限公司;水浴恒溫振蕩器 天津市歐諾儀器儀表有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 微波輔助固定化胰蛋白酶

1.2.1.1 樹脂的交聯(lián) 稱取ESR-5伯胺基樹脂5 g于錐形瓶中,加入K2HPO4-KH2PO4緩沖液(0.2 mol/L,pH=8.0)及不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛溶液,放入水浴恒溫振蕩器中振蕩2 h,使樹脂的伯胺基與戊二醛一端的醛基發(fā)生Schiff反應(yīng),而將戊二醛交聯(lián)到載體的表面。用去離子水洗去樹脂上殘留的未交聯(lián)的戊二醛,并將預(yù)處理過(guò)的樹脂濾干備用。

1.2.1.2 酶的固定化 稱取上述處理好的樹脂0.5 g于60 mL磨口燒瓶中,加入用不同pH的緩沖溶液配制的胰蛋白酶溶液10 mL,置于微波合成儀中,反應(yīng)一定時(shí)間后將其取出,用蒸餾水洗凈樹脂上未固定的胰蛋白酶(洗至洗滌液在280 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收),將樹脂濾干,即得固定化胰蛋白酶。

1.2.2 酶活力的測(cè)定方法 采用福林酚法[22]。在40 ℃、pH8.0的條件下,以1 min內(nèi)水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位,用U表示。相對(duì)酶活力以各組實(shí)驗(yàn)的最高酶活力為100%進(jìn)行折算。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn),考察各因素變量對(duì)固定化胰蛋白酶的酶活力的影響。

固定戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、微波溫度30 ℃、pH8、微波時(shí)間3 min,考察不同加酶量(600～1200 U)對(duì)固定化胰蛋白酶活力的影響;

固定加酶量1000 U、微波溫度30 ℃、pH8、微波時(shí)間3 min,考察不同戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)(0.1%～1.5%)對(duì)固定化胰蛋白酶活力的影響;

固定加酶量1000 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、pH8、微波時(shí)間3 min,考察不同微波溫度(15～45 ℃)對(duì)固定化胰蛋白酶活力的影響;

固定加酶量1000 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、微波溫度35 ℃、微波時(shí)間3 min,考察不同pH(7～10)對(duì)固定化胰蛋白酶活力的影響;

固定加酶量1000 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、pH9、考察不同微波時(shí)間(2.5～25.5 min)對(duì)固定化胰蛋白酶活力的影響。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,通過(guò)方差分析選取主要的影響因素并采用Box-Behnken的中心組合原理,設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案,對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析。響應(yīng)面的因素編碼及變量水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面因素編碼及水平表

1.2.5 固定化胰蛋白酶的特性研究

1.2.5.1 溫度穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶分別在25、35、45、55、65 ℃不同溫度的水浴中放置3 h后測(cè)定其酶活力。

1.2.5.2 酸堿穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶分別置于pH為6、7、8、9、10的緩沖液中在室溫下放置3 h后測(cè)定固定化酶的活力。

1.2.5.3 重復(fù)使用性 按照1.2.2的方法,重復(fù)使用固定化的胰蛋白酶,并測(cè)定使用完1次、3次、5次、7次、9次、11次后的固定化酶的活力,每次使用完將固定化酶用緩沖液清洗干凈并將其置于新的底物中繼續(xù)反應(yīng)。

1.2.5.4 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶置于4 ℃冰箱密封保存,每隔一周測(cè)定其活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件處理單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,采用Design-Expert 8.0.5進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分別測(cè)定了不同加酶量、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)、微波溫度、pH及固定化時(shí)間條件下固載的固定化胰蛋白酶的活力,結(jié)果見圖1～圖5。

如圖1所示,隨著酶添加量的增加,酶活力增大,當(dāng)加酶量大于1000 U后固定化胰蛋白酶的活力不再增大,這是因?yàn)檩d體上交聯(lián)的醛基是一定的,過(guò)多的酶分子在載體表面聚集會(huì)產(chǎn)生空間位阻,影響蛋白的最佳構(gòu)象狀態(tài)。

圖1 加酶量對(duì)固定化胰蛋白酶相對(duì)活力的影響Fig.1 Effect of dosage of trypsin on relative activity of immobilized trypsin

如圖2所示,當(dāng)戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%時(shí),固定化胰蛋白酶的活力較大。因?yàn)楫?dāng)戊二醛濃度較低時(shí),可與伯氨基樹脂交聯(lián)的醛基較少,固定化的胰蛋白酶少,因此單位質(zhì)量的固定化酶活力較低;而戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí),載體上的活性氨基充分發(fā)生交聯(lián)反應(yīng),固載的酶量大。但是由于在固定化酶體系中,催化反應(yīng)屬于擴(kuò)散控制,密集的排列會(huì)引起較大的立體障礙和擴(kuò)散阻力,且造成酶的活性中心相互競(jìng)爭(zhēng)底物,導(dǎo)致酶不能與底物有效地接觸,從而影響酶的活力[23]。另外,戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高,載體上的氨基與戊二醛發(fā)生分子內(nèi)或分子間交聯(lián),會(huì)導(dǎo)致載體與酶的結(jié)合能力降低[24]。

圖2 戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化胰蛋白酶相對(duì)活力的影響Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on relative activity of immobilized trypsin

圖3 微波溫度對(duì)固定化胰蛋白酶相對(duì)活力的影響Fig.3 Effect of microwave temperature on relative activity of immobilized trypsin

本實(shí)驗(yàn)所用的微波合成儀的工作原理是自動(dòng)選擇適當(dāng)?shù)墓β室赃_(dá)到并維持所設(shè)定的溫度,在35 ℃時(shí)固定化酶活力較高,一方面是因?yàn)樵摐囟冉咏鹊鞍酌傅淖钸m溫度,另一方面可能是在此溫度下所需的微波功率較為適宜。

圖4 pH對(duì)固定化胰蛋白酶相對(duì)活力的影響Fig.4 Effect of pH on relative activity of immobilized trypsin

圖5 固定化時(shí)間對(duì)固定化胰蛋白酶相對(duì)活力的影響Fig.5 Effect of immobilization time on relative activity of immobilized trypsin

固定化酶的載體本身會(huì)改變酶活性位點(diǎn)周圍的pH,因?yàn)檩d體可以誘導(dǎo)溶液中分子與載體間的靜電平衡和疏水相互作用,這些相互作用可以改變酶反應(yīng)時(shí)的微環(huán)境[25]。pH9是制備的固定化胰蛋白酶的較適pH,此時(shí)固定化胰蛋白酶的活力較大。

隨著固定化反應(yīng)時(shí)間的增加固定化胰蛋白酶的活力先增大后減小,這是因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的微波輻射會(huì)破壞酶的分子結(jié)構(gòu)降低酶活力[26],固定化時(shí)間為5 min時(shí)固定化胰蛋白酶的活力較大。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化固定化胰蛋白酶條件

通過(guò)SPSS處理單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),確定影響固定化酶活力的各因素的大小關(guān)系為:加酶量>pH>微波溫度>戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)>時(shí)間。其中微波時(shí)間對(duì)固定化酶活力影響的顯著性遠(yuǎn)小于其他因素,故選取加酶量、pH、微波溫度、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果

2.3 二次回歸方程擬合和方差分析

利用Design-Expert 8.0.5對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合,得到以酶活力y為響應(yīng)值,對(duì)自變量加酶量A、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)B、溫度C和pH D四個(gè)因素的回歸方程為:

y=-6131.5716+52.2402A+206.8580B+68.3739C+1039.5778D-0.3199AB+0.3738AC+0.6250AD-0.0222BC+5.5556BD+1.0200CD-1.6812A2-234.7531B2-1.2335C2-59.9250D2

由表3的數(shù)據(jù)可知,模型的p值<0.0001,說(shuō)明模型變量與四個(gè)自變量之間的線性關(guān)系極其顯著。失擬項(xiàng)p=0.1067>0.05,不顯著。對(duì)回歸方程各項(xiàng)的方差分析結(jié)果表明,方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)及交互項(xiàng)AC的p值均<0.01,是極顯著的,交互項(xiàng)CD(p<0.05)是顯著的,而交互項(xiàng)AB、AD、BC、BD是不顯著的。各因素對(duì)固定化酶活力的影響依次為:加酶量>pH>微波溫度>戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù),與SPSS分析結(jié)果一致。

加酶量與微波溫度及微波溫度與pH對(duì)固定化酶活力交互影響的三維空間曲面圖見圖6～圖7。

圖6 加酶量和微波溫度對(duì)固定化酶活力交互影響響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface graph of added trypsin amount and microwave temperature vs immobilized enzyme activity

圖7 微波溫度和pH對(duì)固定化酶活力交互影響響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface graph of microwave temperature and pH vs immobilized enzyme activity

加酶量A與微波溫度C這兩個(gè)因素對(duì)固定化酶活力的交互影響是極顯著的,從圖6可以看出,隨著加酶量及微波溫度的增加,固定化酶的活力先升高之后又下降,A、C對(duì)固定化酶交互作用的最大值在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平范圍內(nèi),且加酶量對(duì)固定化酶活力的影響比微波溫度更加顯著。微波溫度C與pH D這兩個(gè)因素對(duì)固定化酶活力的交互影響是顯著的,從圖7可以看出,C、D對(duì)固定化酶交互作用的最大值在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平的范圍內(nèi),且pH對(duì)固定化酶的影響比微波溫度更加顯著。

2.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

調(diào)整后的回歸模型預(yù)測(cè)固定化酶的最佳工藝條件為:加酶量1050 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.53%、微波溫度34.65 ℃、pH9.10,微波時(shí)間5 min,在此條件下酶活力的預(yù)測(cè)值為389.48 U·g-1樹脂?？紤]到實(shí)驗(yàn)的可操作性,修正最佳工藝條件為,加酶量1050 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.53%、微波溫度35 ℃、pH9.1,微波時(shí)間5 min。在此條件下進(jìn)行三次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),固定化胰蛋白酶的活力為390.77 U·g-1樹脂,相對(duì)誤差為0.33%,與預(yù)測(cè)值接近。

表3 回歸方程的方差分析

2.5 固定化胰蛋白酶的特性

2.5.1 溫度穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶分別在25、35、45、55、65 ℃不同溫度的水浴中放置3 h后測(cè)定其酶活力,并換算出不同溫度的水浴處理后的固定化酶的相對(duì)酶活力,結(jié)果如圖8所示。

圖8 固定化胰蛋白酶的溫度穩(wěn)定性Fig.8 Temperature stability of immobilized trypsin

由圖8可知,固定化胰蛋白酶在25～45 ℃時(shí)比較穩(wěn)定,當(dāng)溫度高于55 ℃固定化胰蛋白酶的活力迅速降低。

2.5.2 酸堿穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶分別置于pH為6、7、8、9、10的緩沖液中在室溫下放置3 h,以最高酶活力為100%,換算出各pH條件下的相對(duì)酶活力,結(jié)果如圖9所示。

圖9 固定化胰蛋白酶的酸堿穩(wěn)定性Fig.9 pH stability of immobilized trypsin

由于固定化后胰蛋白酶的分子構(gòu)象發(fā)生變化,固定化胰蛋白酶在pH為9的緩沖液中最為穩(wěn)定,酶活力最高,在pH10的緩沖液中活力次之,較為穩(wěn)定。所以此固定化胰蛋白酶適合在堿性條件下進(jìn)行酶解反應(yīng)。

2.5.3 重復(fù)使用性 按照1.2.2的方法,重復(fù)使用固定化的胰蛋白酶,并測(cè)定使用完1次、3次、5次、7次、9次、11次后的固定化酶的活力,每次使用完將固定化酶用緩沖液清洗干凈并將其置于新的底物中繼續(xù)反應(yīng)。以第一次的酶活力為100%,換算出不同使用次數(shù)后固定化酶的相對(duì)酶活力,結(jié)果如圖10所示。

圖10 固定化胰蛋白酶的重復(fù)使用性Fig.10 Reusability of immobilized trypsin

制備的固定化胰蛋白酶可以反復(fù)多次使用,重復(fù)使用11次后,仍保留了86.7%的初始酶活力,具有較好的操作穩(wěn)定性。

2.5.4 儲(chǔ)藏穩(wěn)定性 將固定化胰蛋白酶置于4 ℃冰箱密封保存,每隔一周測(cè)定其活力,以最初酶活力為100%,換算出保存了不同時(shí)間的固定化酶的活力,結(jié)果如圖11所示。

圖11 固定化胰蛋白酶的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性Fig.11 Storage stability of immobilized trypsin

固定化胰蛋白酶在前兩周的活力幾乎保持不變,隨著儲(chǔ)藏時(shí)間的延長(zhǎng)酶活力發(fā)生不同程度的下降,儲(chǔ)藏3周后酶活力下降幅度較大,隨后下降幅度減小,不過(guò)在儲(chǔ)藏5周后仍保留了63.7%的初始酶活力。

3 結(jié)論

在微波輔助的條件下,以ESR-5伯氨樹脂為固定化載體制備出固定化胰蛋白酶。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確定了在加酶量1050 U、戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.53%、pH9.1、微波溫度35 ℃及微波時(shí)間5 min的最佳條件下制備得到的固定化胰蛋白酶活力為390.77 U·g-1樹脂。此固定化胰蛋白酶在25～45 ℃的溫度范圍內(nèi)、在pH8.5～10的堿性范圍內(nèi)都較穩(wěn)定;重復(fù)使用11批次后,仍保留了86.7%的初始酶活力;在4 ℃儲(chǔ)藏5周后仍保留了63.7%的初始酶活力,制備的固定化胰蛋白酶具有一定的穩(wěn)定性,拓寬了胰蛋白酶的使用范圍。這也證明,微波作為一種高效的輔助方法用來(lái)固定化酶是可行的。

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Optimization of microwave-assisted immobilization of trypsin on ESR-5 resin using response surface methodology

LIU Wei-hua,LI Rong,JIANG Zi-tao*

(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology,College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce,Tianjin 300134,China)

With ESR-5 amino resin as immobilization carrier,the condition of microwave-assisted immobilization of trypsin was studied. Through single factor experiments and response surface methodology(RSM),the optimum conditions for immobilization were determined as follows:microwave temperature 35 ℃,addition of trypsin 1050 U,glutaraldehyde concentration 0.53%,pH9.1 and microwave time 5 min. On this condition,the activity of the immobilized trypsin was 390.77 U per gram resin. Compared with the traditional immobilization method needed a few hours,this method greatly shortened the time of preparation of immobilized trypsin. The immobilized trypsin had good stabilities. In 25～45 ℃ temperature range and in the range of pH8.5～10,the immobilized trypsin was stable. After reused for 11 batches and 5 weeks storage at 4 ℃,it respectively retained 86.7% and 63.7% of its initial activity. Thus,using microwave to immobilize enzyme is a worth trying and efficient method.

trypsin;immobilized enzyme;microwave-assisted;ESR-5 amino resin;RSM

2016-06-28

劉偉華(1990-),女,碩士研究生,研究方向:食品添加劑，E-mail:1059492293@qq.com。

*通訊作者:姜子濤(1956-),教授,博士,研究方向:食品添加劑，E-mail:ztjiang@tjcu.edu.cn。

天津市自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(12JCZDJC34100)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)06-0217-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.06.033