王禮閃， 薛艷潔， 房沙沙， 劉 曉

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

8種經(jīng)濟(jì)鮑COⅠ基因全序列比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

王禮閃， 薛艷潔， 房沙沙， 劉 曉

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院， 寧波 315211)

為了研究不同地理種群的8種鮑的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，以期為鮑屬的種間鑒定與鮑的遺傳育種提供分子生物學(xué)依據(jù)，以8種不同的鮑為實(shí)驗(yàn)材料。利用PCR擴(kuò)增技術(shù)得到8條COⅠ基因全序列，10條其他鮑種的COⅠ基因全序列來(lái)源于GenBank。對(duì)18條的COⅠ基因全序列的比對(duì)分析表明，COⅠ基因的全序列共1542 bp，編碼513個(gè)氨基酸；A+T的含量大于G+C的含量；在1542個(gè)堿基位點(diǎn)中存在526個(gè)變異位點(diǎn)，變異率為34.11%，氨基酸的變異率為7.8%。從遺傳距離的分析中發(fā)現(xiàn)，同種鮑的遺傳距離小于0.010；不同的鮑種之間的平均遺傳距離在0.159～0.196之間；構(gòu)建的遺傳進(jìn)化樹(shù)分析得出：鮑的遺傳進(jìn)化受到地理分布的影響，但是不同地理種群的鮑之間并不存在明顯的地理分布差異，其中美洲分布的紅鮑和綠鮑與亞洲分布的皺紋盤(pán)鮑親緣關(guān)系較近。

鮑；COⅠ基因；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

鮑是隸屬于軟體動(dòng)物門(mén)(Mollusca)腹足綱(Gastropoda)原始腹足目(Archaeogastropoda)鮑科(Haliotidae)鮑屬(Haliotis)的一種具有極高食用和藥用價(jià)值的貝類(lèi)。全世界的鮑有100種左右，主要經(jīng)濟(jì)種類(lèi)有20種，我國(guó)沿海自然分布有8種鮑，其中主要經(jīng)濟(jì)種有皺紋盤(pán)鮑、雜色鮑和九孔鮑[1]。我國(guó)的鮑養(yǎng)殖業(yè)排名世界第一，但隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，種質(zhì)資源的衰退嚴(yán)重影響了我國(guó)鮑的養(yǎng)殖業(yè)。為豐富我國(guó)鮑的種質(zhì)資源和養(yǎng)殖品種，研究者相繼從美國(guó)、日本和澳大利亞引進(jìn)了紅鮑、綠鮑、盤(pán)鮑、西氏鮑和綠唇鮑等[2-4]，其中從日本引進(jìn)的盤(pán)鮑成為了我國(guó)的重要養(yǎng)殖種，而從美國(guó)和澳洲的引種不理想[1]。

線粒體DNA作為分子標(biāo)記的一種，在軟體動(dòng)物門(mén)的系統(tǒng)發(fā)生和物種鑒定中已得到廣泛應(yīng)用[5-6]。COⅠ(細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ)為線粒體DNA的13個(gè)編碼基因之一，因其適中的遺傳進(jìn)化速度和較強(qiáng)的種間辨析能力成了研究鮑系統(tǒng)進(jìn)化及種間鑒定的重要選擇，并得到證明[7]。以往的研究主要以通用引物擴(kuò)增COⅠ基因部分片段來(lái)分析鮑的遺傳進(jìn)化關(guān)系和進(jìn)行種間鑒定[8-9]。本研究通過(guò)COⅠ基因完整序列研究了分布于澳洲、美洲和亞洲不同地區(qū)的8種重要經(jīng)濟(jì)鮑的序列特征和遺傳進(jìn)化關(guān)系，以期為鮑屬物種的鑒定及主要養(yǎng)殖鮑的遺傳背景提供可靠的分子生物學(xué)依據(jù)，以促進(jìn)我國(guó)鮑養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)所用材料共8種鮑(由中國(guó)科學(xué)院海洋研究所劉曉老師提供)：羊鮑(Haliotis.ovina)、綠唇鮑(Haliotis.laevigata)、黑唇鮑(Haliotis.rubra)、黑足鮑(Haliotis.iris)、紅鮑(Haliotis.rufescens)、綠鮑(Haliotis.fulgens)、耳鮑(Haliotis.asinina)和西氏鮑(Haliotis.sieboldii)，用75%的酒精固定保存樣本。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

DNA的提取使用OMEGA的DNA提取試劑盒(E.Z.N.A Tissue DNA Kit)。并按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.2.2 PCR擴(kuò)增

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室獲得的相關(guān)序列設(shè)計(jì)引物，信息見(jiàn)表1。

PCR反應(yīng)體系60 μL：DNA模板3 μL、正反向引物各1.5 μL、10×PCR BufferⅡ 6 μL、dNTP 9.6 μL、TaKaRa LA Taq酶0.6 μL、ddH2O 37.8 μL。過(guò)程：94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s，50℃～57℃(根據(jù)引物設(shè)定)退火1 min，72℃延伸3 min(根據(jù)擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度設(shè)定)，35個(gè)循環(huán); 72℃10 min。

表1 引物信息及樣品采集地

1.2.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳(圖1)檢測(cè)并切膠回收(選用OMEGA的試劑盒：E.Z.N.A. Gel Extraction Kit)，然后送上海華大基因有限公司測(cè)序。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用SeqMan和Chromas軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行核對(duì)、剪切和拼接，通過(guò)ORF finder找出拼接結(jié)果中的COⅠ基因全序列，然后用得到的COⅠ基因全序列通過(guò)BLAST比對(duì)、查找并下載10條其他鮑種的COⅠ基因全序列。應(yīng)用MEGA 5.05比對(duì)18條COⅠ全序列，并分析其堿基組成、變異位點(diǎn)、編碼氨基酸，然后計(jì)算遺傳距離和構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果分析

2．1 堿基組成及變異分析

用擴(kuò)增得到的COⅠ基因全序列通過(guò)BLAST比對(duì)，在GenBank中下載相關(guān)鮑種的10條COⅠ基因全序列，共18條，每條COⅠ基因全序列所對(duì)應(yīng)的種類(lèi)、注冊(cè)號(hào)和各堿基含量如表2所示。

圖1 PCR電泳圖

分析發(fā)現(xiàn)，COⅠ基因全長(zhǎng)為1542 bp，其中堿基A/T/C/G在各種間的總體含量浮動(dòng)不大，分別在26.72%～28.60%、27.43%～29.70%、25.23%～27.24%和16.47%～18.03%之間，A+T的含量在54.80%～57.98%之間，A+T含量大于C+G含量。圖2為各種鮑A+T含量的條形圖，從圖中可以看出分布于澳洲的黑足鮑、綠唇鮑和黑唇鮑中的A+T含量明顯小于其他地理群體中鮑的A+T含量。COⅠ全基因共有514個(gè)密碼子，編碼513個(gè)氨基酸，第514個(gè)密碼子為終止密碼子，起始和終止密碼子分別為ATG和TAA。在514個(gè)密碼子的每個(gè)密碼子中第2個(gè)堿基的T/C/A/G的含量較穩(wěn)定，而第3個(gè)堿基G的含量在10%以下。在1542 bp的序列中，存在變異位點(diǎn)526個(gè)，總變異率為34.11%；簡(jiǎn)約性信息位點(diǎn)469個(gè)，單變異信息位點(diǎn)57個(gè)。包含轉(zhuǎn)換147個(gè)，顛換78個(gè)，轉(zhuǎn)換/顛換比率(R)為1.9，轉(zhuǎn)換與顛換多發(fā)生在每個(gè)密碼子的第3個(gè)堿基上。而其編碼的513個(gè)氨基酸中存在變異位點(diǎn)為40個(gè)，氨基酸的變異率為7.80%，遠(yuǎn)低于核苷酸的變異率。

圖2各鮑A+T含量

2.2 遺傳距離的分析

基于COⅠ基因全序列計(jì)算各種鮑兩兩之間的遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表3。同種鮑即黑唇鮑(7、10)、綠唇鮑(8、9)、皺紋盤(pán)鮑(11、12、13)和雜色鮑(17、18)的遺傳距離較小，分別為0.005、0.003、0.002～0.010和0.008。羊鮑、耳鮑、雜色鮑、黑足鮑、疣鮑(除去其3種之間)、西氏鮑(除去與皺紋盤(pán)鮑之間)、皺紋盤(pán)鮑(除去與西氏鮑之間)、紅鮑、綠鮑、綠唇鮑和黑唇鮑分別與其他鮑種的平均遺傳距離為：0.186、0.183、0.196、0.183、0,184、0.181、0.181、0.159、0.166、0.172和0.169，范圍在0.159～0.196之間。

圖3 基于COⅠ基因序列構(gòu)建的鮑的NJ樹(shù)

種類(lèi)T(U)CAGA+TTotal/bp注冊(cè)號(hào)▲羊鮑29.5126.0727.6916.7357.201542.0KX233877▲耳鮑28.1527.1128.2716.4756.421542.0KX233870▲西氏鮑29.3825.2928.6016.7357.981542.0KX233876▲綠鮑27.8926.7228.6016.8056.491542.0KX233873▲紅鮑28.7925.8127.8917.5156.681542.0KX233875▲黑足鮑28.4727.1726.9817.3855.451542.0KX233872▲黑唇鮑28.0227.1726.8517.9654.861542.0KX233871▲綠唇鮑27.5027.1727.3018.0354.801542.0KX233874綠唇鮑127.4327.1127.5017.9654.931542.0KJ472483.1黑唇鮑127.9527.2426.8517.9654.801542.0AY588938.1皺紋盤(pán)鮑129.4425.2328.4716.8657.911542.0EU595789.1皺紋盤(pán)鮑229.4425.2328.2717.0657.721542.0KF724723.1皺紋盤(pán)鮑329.4425.2328.2717.0657.721542.0JF748793.1疣鮑129.6426.3927.0416.9356.681542.0FJ599667.1疣鮑229.5126.3327.3016.8656.811542.0FJ605486.1疣鮑329.7026.2626.7217.3256.421542.0FJ605488.1雜色鮑129.3125.3627.7617.5757.071542.0HQ832672.1雜色鮑229.1825.4228.0817.3257.261542.0HQ832673.1Avg.28.8226.2427.6917.2556.511542.0

表3 各鮑間的遺傳距離(K2-P模型)

2.3 系統(tǒng)演化分析

以三角帆蚌(Hyriopsiscumingii)為外群，根據(jù)COⅠ全序列構(gòu)建NJ遺傳進(jìn)化樹(shù)(圖3)。從圖3可以看出，各鮑與外群分開(kāi)并聚為一支。羊鮑和耳鮑分別單獨(dú)一支；而美洲的紅鮑、綠鮑與亞洲的西氏鮑、皺紋盤(pán)鮑遺傳關(guān)系較近，先聚在一起，后再與新西蘭的黑足鮑聚為一支；澳洲的綠唇鮑和黑唇鮑遺傳關(guān)系比較近；雜色鮑與其他鮑種的遺傳關(guān)系都比較遠(yuǎn)；歐洲的疣鮑聚為一支。

3 討論

鮑屬的種類(lèi)較多，形態(tài)較為接近，以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分析來(lái)鑒定鮑屬種類(lèi)較難。辛一[7]通過(guò)測(cè)定皺紋盤(pán)鮑線粒體COⅠ、COⅡ和CYTB的完整序列，并結(jié)合雜色鮑、疣鮑和黑唇鮑的線粒體基因信息，分析了COⅠ、COⅡ和CYTB在鮑屬物種鑒定中的適用性，得出這3個(gè)基因都適用于鮑屬物種的鑒定，因COⅠ信息相對(duì)較多，故用COⅠ進(jìn)行鮑屬物種的鑒定更為方便。本研究通過(guò)對(duì)18條COⅠ基因全序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)鮑的COⅠ基因全長(zhǎng)為1542 bp，其長(zhǎng)度在不同鮑中非常保守，共編碼513個(gè)氨基酸，其核苷酸的變異率遠(yuǎn)高于氨基酸的變異率，這和簡(jiǎn)并密碼子的存在有關(guān)，另外核苷酸的突變主要發(fā)生在每個(gè)密碼子的第3位上并且突變位點(diǎn)的分布較分散。從圖2可得到分布于澳洲的鮑種的A+T含量較其他地理種群要小。從遺傳距離上看，同種間的遺傳距離極小，小于0.010，不同種的遺傳距離在0.159～0.196之間。其中歐洲的3種疣鮑被認(rèn)為同一物種的不同亞種[10]，其遺傳距離在0.021～0.028之間；西氏鮑與皺紋盤(pán)鮑的遺傳距離在0.022～0.025之間，與歐洲的3種疣鮑間遺傳距離接近，達(dá)不到種間的分化要求。應(yīng)用同工酶[11-14]、微衛(wèi)星[15]、RAPD[16-17]、18S[18]、16S[19-21]和COⅠ[8-9]部分序列分析鮑的遺傳多樣性和遺傳進(jìn)化關(guān)系也越來(lái)越多，這些技術(shù)在研究遺傳距離及遺傳進(jìn)化關(guān)系方面與本研究有一定差別。

鮑的遺傳背景離不開(kāi)其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從本研究的結(jié)果可以看出分布于美洲的紅鮑、綠鮑和分布于亞洲的皺紋盤(pán)鮑、雜色鮑、耳鮑、羊鮑之間并沒(méi)有表現(xiàn)出地理隔離所造成的遺傳差異特征，另外紅鮑與皺紋盤(pán)鮑間的遺傳進(jìn)化關(guān)系比紅鮑和綠鮑間更近，皺紋盤(pán)鮑與紅鮑、綠鮑的遺傳差異比皺紋盤(pán)鮑與同分布于亞洲的雜色鮑、耳鮑、羊鮑的遺傳差異小。由此可看出：鮑的進(jìn)化雖然受到地理?xiàng)l件的影響，但不同鮑種的物種分化并不存在明顯的地理分布差異，且美洲分布的紅鮑和綠鮑與在亞洲分布的皺紋盤(pán)鮑遺傳進(jìn)化關(guān)系較近。

由于不同的技術(shù)分析鮑的遺傳進(jìn)化關(guān)系的結(jié)果之間存在一定的差別，故其相關(guān)研究需要加深并綜合起來(lái)分析。隨著幾種鮑的線粒體DNA 編碼區(qū)序列的公布[8,22-24]，為鮑的遺傳背景研究提供了方便。我國(guó)在世界上雖然是排名第一的養(yǎng)鮑大國(guó)，但我國(guó)的鮑養(yǎng)殖業(yè)同樣面臨大量的問(wèn)題和嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。本研究通過(guò)COⅠ全序列研究不同地理種群鮑種間的DNA序列差異和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，旨在為鮑屬物種的鑒定和我國(guó)鮑的養(yǎng)殖提供可靠的分子生物學(xué)依據(jù)，以促進(jìn)我國(guó)鮑的養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

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Comparison of CO I gene complete sequence and phylogenetic analysis in eight kinds of economic abalone

WANG Li-shan, XUE Yan-jie, FANG Sha-sha, LIU Xiao

(College of Marine, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

In order to study the phylogenetic relationships of eight species of abalone in different geographical populations, and to provide molecular biological basis for the identification of the species and the genetic breeding of abalone, this study used 8 kinds of abalone as the experimental materials. The whole sequences of 8 CO I genes were obtained by PCR amplification technique, the other 10 were found from GenBank. Through comparative analysis, it was found that the total length of CO I gene was 1542 bp, which encoded 513 amino acids, and the content of A + T was more than G + C. There were 526 mutation sites, and the mutation rate was 34.11%, while the variation rate of amino acid was 7.8%. From the analysis of genetic distance, it was found that the genetic distance of the same species was less than 0.010. The average genetic distance among different species of abalone was between 0.159-0.196. The phylogenetic tree was constructed to get the following conclusions. Abalone genetic evolution was affected by the influence of geographical distribution, but there was no obvious geographical distribution characteristic between different abalone; andHaliotisrufescensandHaliotisfulgens, which were distributed in the Americas, had a close relationship withHaliotisdiscushannaidistributing in Asia.

abalone; CO I gene; phylogenetic tree

2016-05-23；

2016-06-08

貝類(lèi)遺傳育種研究(D01304134900)

王禮閃，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖，E-mail: wlsyanjiusheng@163.com

劉 曉，研究員，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗a(chǎn)養(yǎng)殖，E-mail: liuxiao@nbu.edu.cn

Q78；S917.4

A

2095-1736(2017)02-0036-04

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.036