張大鵬， 李躍民， 栗 楠， 邱小燕， 楊 波， 肖 雄

(西南大學(xué) 動物科技學(xué)院， 重慶 400715)

廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)體系優(yōu)化

張大鵬， 李躍民， 栗 楠， 邱小燕， 楊 波， 肖 雄

(西南大學(xué) 動物科技學(xué)院， 重慶 400715)

通過比較6種方法和5個部位分離成纖維細胞的效率，旨在優(yōu)化廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞的分離培養(yǎng)體系。結(jié)果表明：1)采用酶消化法Ⅰ所得成纖維細胞的密度顯著高于其他處理組(P<0.05)，其死亡率與方法Ⅳ處理組之間差異不顯著(P>0.05)，但顯著低于其余處理組(P<0.05)；2)冷凍保存10 d后復(fù)蘇的耳部皮膚組織，經(jīng)方法Ⅰ酶消化后所得成纖維細胞的密度和存活率均分別極顯著低于新鮮組織方法Ⅰ處理組(P<0.01)；3)組織塊培養(yǎng)4 d后即可從其邊緣長出成纖維細胞，再經(jīng)過8 d培養(yǎng)，細胞匯合率可達100%；4)耳部皮膚組織所獲成纖維細胞的密度顯著高于其他部位處理組(P<0.05)，而且貼壁生長效果良好；5)所得耳部皮膚成纖維細胞可傳至10代以上，其中第3代和第4代生長最為迅速；6)生長曲線顯示第3代耳部皮膚成纖維細胞呈典型的“S形”生長。因此，宜選用先加0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化30 min，再用0.2%膠原蛋白酶消化30 min的方法分離廣西巴馬小型豬的耳部皮膚成纖維細胞。

廣西巴馬小型豬；皮膚成纖維細胞；酶消化法；組織塊培養(yǎng)法

豬在解剖結(jié)構(gòu)、生理特征、營養(yǎng)代謝、疾病發(fā)生機理等方面與人類頗為相似，在生命科學(xué)領(lǐng)域中具有重要的研究和應(yīng)用價值。小型豬作為異種移植的供體具有諸多優(yōu)點，既能提供充足的供體器官、組織和細胞，又可克服靈長類動物帶來的倫理道德、烈性病毒傳染病等問題，還可作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)人類的重要蛋白，有望取代實驗猴、犬而成為被大量使用的新型大型實驗動物[1]。廣西巴馬小型豬因具有體型小、兩頭烏毛色整齊、繁殖性能好、遺傳性穩(wěn)定、生物學(xué)特性明確等特點而成為適于實驗應(yīng)用的小型豬品系[2]?？寺?、轉(zhuǎn)基因、干細胞和重編程等的發(fā)展為小型豬的開發(fā)應(yīng)用提供了技術(shù)支持，皮膚成纖維細胞因來源充足、取材方便、便于保存、增殖能力強等優(yōu)點，現(xiàn)已成為良好的供體細胞，而細胞的分離、培養(yǎng)和保存直接影響這些技術(shù)的效率，因此，本研究探討了廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞的分離及培養(yǎng)體系，旨在提高其分離效率和培養(yǎng)質(zhì)量，為借助生物學(xué)技術(shù)推動小型豬的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡廣西巴馬小型豬，購自重慶鑫宜居生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 耳部皮膚成纖維細胞的分離和原代培養(yǎng)

采用頸動脈放血法處死小型豬，剪取耳朵，經(jīng)生理鹽水反復(fù)沖洗、手術(shù)刀片刮除被毛和再次清洗后，浸入75%酒精內(nèi)消毒1 min，立即置入PBS內(nèi)充分清洗，采用眼科剪于無菌平皿內(nèi)取其耳部皮膚組織，稱重后裝于青霉素瓶內(nèi)(0.1g組織/瓶)，將組織剪碎至1 mm3大小，然后按照表1的不同方法處理。經(jīng)反復(fù)吹打和300目細胞篩過濾后，收集濾液轉(zhuǎn)入10 mL離心管內(nèi)，1000 r/min離心5 min，棄上清后，加入2 mL DMEM培養(yǎng)液(高糖DMEM 840 mL + 胎牛血清150 mL + 非必需氨基酸10 mL + 碳酸氫鈉3.7 g+丙酮酸鈉0.11 g+青霉素0.0313 g+鏈霉素0.0643 g)重懸細胞，細胞計數(shù)計算密度，0.4%臺盼藍染色統(tǒng)計細胞死亡率，調(diào)整細胞密度為5×105個/mL，37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3 不同部位皮膚成纖維細胞的分離和原代培養(yǎng)

充分清洗已處死的小型豬體表后，采用手術(shù)刀片刮除耳部、腿部、腹部、背部和尾部的被毛，剪取適量不同部位的皮膚組織塊，于75%酒精內(nèi)消毒1 min，經(jīng)PBS充分清洗后，剪取每個部位組織樣品0.1g，置于青霉素瓶內(nèi)，將其剪碎至1 mm3大小。采用1.2試驗中所得最佳處理方法分離細胞，最后加入2 mL DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，計算細胞密度和存活率，以5×105個/mL的細胞密度于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.4 傳代培養(yǎng)

原代培養(yǎng)的細胞，每24 h半量換液1次，待細胞匯合率達到85%～90%時進行傳代培養(yǎng)。即吸棄培養(yǎng)液后PBS清洗2次，加入0.125%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化細胞，待絕大部分細胞變圓后，立即加入等量DMEM培養(yǎng)液終止消化。收集細胞液至10 mL離心管內(nèi)，1000 r/min離心5 min，棄上清后，加入2 mL DMEM培養(yǎng)液，以5×105個/mL的密度分裝入培養(yǎng)瓶中，于37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進行傳代培養(yǎng)。長梭形貼壁生長細胞即為成纖維細胞。

表1 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞原代分離培養(yǎng)的不同處理方法

Ⅰ：0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化30 min + 0.2%膠原蛋白酶消化30 min；Ⅱ：0.2%膠原蛋白酶消化30 min + 0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化30 min；Ⅲ：0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化60 min；Ⅳ：0.125%胰蛋白酶+0.02% EDTA消化60 min；Ⅴ：組織塊經(jīng)冷凍保存、復(fù)蘇后進行分離；Ⅵ：組織塊培養(yǎng)法

1.5 生長曲線的繪制

待成纖維細胞傳代至生長旺盛期時，按5×104個/mL的密度接種于12孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入1 mL細胞懸液后進行培養(yǎng)。每24 h消化細胞并加入1 mL DMEM培養(yǎng)液重懸細胞，0.4%臺盼藍染色統(tǒng)計活細胞數(shù)量，連續(xù)統(tǒng)計12 d，繪制生長曲線圖。

1.6 冷凍保存與復(fù)蘇

傳代純化的細胞經(jīng)離心和棄除上清液后，加入1.5 mL細胞凍存液(DMEM+20%胎牛血清+10%二甲基亞砜)，制成細胞重懸液，移入1.8 mL的冷凍管中。4℃冰箱預(yù)冷30 min、-20℃冰箱冷凍2 h、液氮上方預(yù)冷過夜后浸入液氮中進行冷凍保存。細胞復(fù)蘇時，取出凍存管并迅速置于40℃水浴鍋內(nèi)使其快速解凍，然后離心、重懸細胞，調(diào)整密度后體外培養(yǎng)。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

成纖維細胞的密度和死亡率數(shù)據(jù)采用“平均值±標準差”的形式表示，采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶消化方法對廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞分離效率的影響

由圖1可知，方法Ⅰ所得成纖維細胞的密度顯著高于其他各處理組(P<0.05)；方法Ⅱ所得細胞密度顯著高于方法Ⅲ(P<0.05)；方法Ⅳ與方法Ⅴ所得細胞密度均明顯低于其余各處理組(P<0.05)。如圖2所示，方法Ⅰ分離所得細胞的死亡率與方法Ⅳ差異不顯著(P>0.05)，但均顯著低于其他各處理組(P<0.05)。因此，宜選用方法Ⅰ分離廣西巴馬小型豬的耳部皮膚成纖維細胞，這些細胞可快速貼壁，培養(yǎng)2 d后匯合率可達50%，5 d后達到100%(見圖3)；冷凍保存耳部皮膚組織塊經(jīng)解凍復(fù)蘇、方法Ⅰ消化后所得原代成纖維細胞的生長速度變慢，培養(yǎng)2 d后細胞匯合率僅有5%左右，培養(yǎng)5 d可達到50%(見圖4)。

圖1 不同方法分離所得廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的細胞密度

圖2 不同分離方法對廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞死亡率的影響

圖3 采用方法Ⅰ分離所得廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞原代培養(yǎng)的貼壁生長情況

A: 分離所得原代細胞；B: 培養(yǎng)2 d后；C:培養(yǎng)5 d后

圖4 冷凍保存和解凍復(fù)蘇后的廣西巴馬小型豬耳部皮膚組織塊經(jīng)方法Ⅰ分離所得成纖維細胞原代培養(yǎng)的貼壁情況

A: 分離所得原代細胞；B:培養(yǎng)2 d后；C:培養(yǎng)5 d后

2.2 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的組織塊培養(yǎng)

經(jīng)組織塊培養(yǎng)后，第4天可見從組織塊周圍長出成纖維細胞(見圖5-A)，此后，于第6天時去除組織塊，細胞可進一步擴增(見圖5-B)，但由于細胞基數(shù)小，生長較緩慢，待細胞生長至匯合率達培養(yǎng)瓶底100%時需要12 d左右的時間(見圖5-C)，因此，相對于酶消化法而言，該方法耗時較長。

圖5 組織塊培養(yǎng)法所得廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的生長情況

A: 第4天；B: 第6天；C: 第12天

2.3 不同部位組織對廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞分離效率的影響

采集廣西巴馬小型豬5個不同部位(耳部、腿部、腹部、背部和尾部)的皮膚組織，應(yīng)用方法Ⅰ分離皮膚成纖維細胞。由圖6可知，耳部皮膚組織所獲成纖維細胞的密度顯著高于其他部位處理組(P<0.05)，而且細胞貼壁生長效果良好(見圖7)；因此，宜選用耳部皮膚組織分離成纖維細胞。

2.4 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的傳代培養(yǎng)

廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞可傳至10代以上，其中第3代和第4代成纖維細胞生長最為迅速，呈旋渦狀生長；第8代細胞的生長活力開始下降，生長速度變緩；第10代細胞很多貼壁后形態(tài)畸變，呈星型分叉；細胞傳至第12代時，貼壁生長變得非常遲緩(約24 h后才可貼壁)，且貼壁后容易脫落浮起(見圖8)。

圖7 廣西巴馬小型豬不同部位皮膚組織成纖維細胞原代培養(yǎng)貼壁情況

Fig 7 The adherent growth of primary skin fibroblasts from different parts of Guangxi Bama mini-pig

A、a：耳部；B、b：腿部；C、c：腹部；D、d：背部；E、e：尾部

圖8 不同傳代次數(shù)的廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的貼壁生長情況

A: 第2代；B: 第3代；C: 第4代；D: 第8代；E:第10代；F:第12代

2.5 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的解凍復(fù)蘇培養(yǎng)

第3代廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞經(jīng)解凍復(fù)蘇后，細胞生長速度較冷凍保存前略為遲緩，經(jīng)過5 d培養(yǎng)其匯合率才可達到75%(見圖9)，但通過再次傳代培養(yǎng)后，細胞活力即可得到恢復(fù)。

2.6 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞生長曲線的繪制

由圖10可知，第3代廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞呈典型的“S形”生長，即第0～3天內(nèi)細胞處于生長沉默期，增殖緩慢；第3～8天內(nèi)細胞呈對數(shù)生長；第8～10天細胞進入生長平臺期；第10天后細胞貼壁能力下降，呈負增長。

圖9 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞冷凍復(fù)蘇后的生長情況

A：耳皮膚成纖維細胞復(fù)蘇后；B：耳皮膚成纖維細胞培養(yǎng)5 d后

圖10 廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞的生長曲線

3 討論與結(jié)論

廣西巴馬小型豬是一種原產(chǎn)于廣西巴馬縣的小型豬品種，經(jīng)以基礎(chǔ)群內(nèi)閉鎖純繁選育及半同胞為主的近交方式選育而成，其微型體型、生長緩慢、獨特毛色、早熟多產(chǎn)、遺傳特性穩(wěn)定等特點使之非常適于實驗動物化，可用于異種器官移植、疾病模型(如腫瘤、心腦血管疾病、糖尿病、皮膚燒傷、遺傳病、營養(yǎng)代謝病等)構(gòu)建、新藥安全性評價、生物反應(yīng)器、生產(chǎn)性狀改良、肉品生產(chǎn)、伴侶動物等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因、核移植、干細胞、體細胞重編程等技術(shù)也開始應(yīng)用于該新型實驗動物，皮膚成纖維細胞是這些技術(shù)的常用供體細胞，鑒于廣西巴馬小型豬皮膚組織的特點以及不同部位存在的差異，本研究比較了6種方法和5個部位分離皮膚成纖維細胞的效率，從而優(yōu)化了其分離培養(yǎng)體系，為采用新興技術(shù)研究廣西巴馬小型豬提供充足的靶細胞，同時也為其他品種豬成纖維細胞的分離培養(yǎng)提供參考。

本研究比較了5種酶消化法分離廣西巴馬小型豬皮膚成纖維細胞的效率，結(jié)果表明采用方法Ⅰ所得細胞密度顯著高于其他各處理組，且細胞死亡率較低。這與楊素芳等[3]的研究結(jié)果類似。基于豬皮膚組織的特點，單獨使用胰蛋白酶處理，因無法消化結(jié)締組織形成的纖維狀黏稠團，致使已分離的細胞包裹和吸附其內(nèi)，無法分散，如再加入膠原蛋白酶，則可“打散”纖維狀黏稠團，釋放細胞，提高成纖維細胞的分離效率；如若調(diào)換兩種酶的加入順序，則未分離的細胞致使膠原蛋白酶消化其間的結(jié)締組織不完全，使得胰蛋白酶消化分離出的有些細胞又網(wǎng)絡(luò)其中，降低細胞分離效率；細胞篩過濾之前適當降低酶消化細胞懸液的濃度也有利于獲得更多的細胞；酶作用時間越長對細胞的損傷越大。

廣西巴馬小型豬耳部皮膚組織塊經(jīng)冷凍保存、解凍復(fù)蘇后采用方法Ⅰ分離成纖維細胞，所獲細胞密度及存活率均顯著低于凍存前組織。這可能與凍存過程中大量處于組織塊內(nèi)部的細胞無法與冷凍保護劑充分接觸，從而形成很多胞內(nèi)冰晶，造成細胞損傷；以及組織塊中的很多膠原組織在凍存中產(chǎn)生凝聚，致使胰蛋白酶和膠原蛋白酶難以從中消化出細胞等有關(guān)。因此，在組織塊冷凍保存時，逐級遞減冷凍溫度[4-5]以及選取適宜的組織塊大小[6]均有利于提高細胞的分離效率。目前已有不少經(jīng)組織冷凍保存后成功使其重新恢復(fù)功能的研究[7-8]，該方法在許多珍貴動物組織、器官的保存以及細胞研究等方面具有重要意義。

采用組織塊培養(yǎng)法獲取原代成纖維細胞時，細胞生長周期較酶消化法長，這主要是由于組織塊中成纖維細胞堆積緊密，以及大量膠原組織的存在，致使內(nèi)部細胞無法向四周擴增所致；此外，還與所選動物的日齡和取材部位[9]等有關(guān)，通常幼齡動物組織塊長出細胞的速度快于成年動物組織[10-12]。

由于機體各部位中的組織成分以及細胞種類和含量不同，故所獲成纖維細胞也存在差異性[9,13]。相比較廣西巴馬小型豬的耳部、腹部和腿部，尾部和背部的皮膚組織質(zhì)地較硬，剪碎及消化過程較為困難，降低分離效率；腹部和腿部雖容易獲取細胞，但在分離所得細胞中有很多雜細胞(如上皮細胞)，從而影響原代成纖維細胞的貼壁和生長；耳部皮膚組織相對較薄、柔軟、皮下組織少，易于剪碎和酶消化，采用先胰蛋白酶后膠原蛋白酶的消化方法可以獲取較高的原代細胞密度，經(jīng)傳代培養(yǎng)前反復(fù)使用D-PBS清洗培養(yǎng)瓶內(nèi)的貼壁細胞，可以將絕大部分雜細胞去除，至第3代時，成纖維細胞呈現(xiàn)出均一的長梭形貼壁生長。第3代成纖維細胞的生長曲線與趙彥玲等[14]和楊素芳等[3]的結(jié)果類似。

因此，宜采用先經(jīng)0.25%胰蛋白酶+0.04% EDTA消化30 min，再用0.2%膠原蛋白酶消化30 min的方法分離廣西巴馬小型豬耳部皮膚成纖維細胞，其傳代培養(yǎng)及冷凍保存效果良好，呈典型的“S”型生長。

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Isolation and culture of skin fibroblasts in Guangxi Bama mini-pig

ZHANG Da-peng， LI Yue-min， LI Nan， QIU Xiao-yan， YANG Bo， XIAO Xiong

(College of Animal Science and Technology, Southwest University, Chongqing 400715, China)

In order to screen appropriate methods for the isolation and culture of the skin fibroblasts from Guangxi Bama mini-pig, five enzyme digestion methods and a tissue culture method were compared in the isolation of fibroblasts of skins from different parts of mini-pig including ear, leg, abdomen, back, and tail . The results indicated that the density of fibroblasts isolated with enzyme digestion methodⅠwas significantly higher than that in other treatment groups (P<0.05), and there was no significant difference in the cell death rates between fibroblasts from the shin treated with enzyme digestion methodⅠand that with enzyme digestion method Ⅳ (P>0.05), but the cell death rates in those two treatment groups were significantly lower than that in other groups, respectively (P<0.05). Fibroblast could be isolated from the thawed ear shin tissues after frozen for 10 days with enzyme digestion methodⅠ, but the density of fibroblasts and their survival rate were significantly lower than that from the fresh ear shin tissues with the same method (p<0.01). The cell confluency rate of fibroblasts would not reach to about 100% until being cultured for 12 days. Compared to other parts of mini-pig, ear skin was more suitable to isolate the fibroblasts, because the density of fibroblasts isolated from ear skin tissues was significantly higher than that from other parts of mini-pig (P<0.05), and the attachment and growth of those fibroblasts were very well. Ear skin fibroblasts were able be passaged up to more than passage 10, but the viability of cells at passage 3 to 4 was higher than that of cells at other passage. The cell growth curve of ear skin fibroblasts at passage 3 was a typical "S" shape. Therefore, it is better to isolate the fibroblasts from the ear skin of Guangxi Bama mini-pig with the digestion of 0.25% trypsase and 0.04% EDTA for 30 min, follow by 0.2% collagenase for 30 min.

Guangxi Bama mini-pig； skin fibroblasts； enzyme digestion method； tissue culture method

2016-04-29；

2016-05-12

國家自然科學(xué)基金項目(31572488)；重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計劃項目(cstc2013jcyjA10110)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費項目(XDJK2014C022)；西南大學(xué)博士基金項目(SWU13002)

張大鵬，碩士研究生，主要從事動物胚胎工程和臨床獸醫(yī)學(xué)方面的研究，E-mail：522672133@qq.com

肖 雄，博士，副教授，主要從事動物胚胎工程、細胞生物學(xué)和獸醫(yī)產(chǎn)科學(xué)方面的研究，E-mail: y1982@swu.edu.cn

Q813.1;S828

B

2095-1736(2017)02-0099-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.02.099