陳俊浩，陸 洋，倪燕婕，張智俊，鐘雅萍，鮑晶晶，羅淑萍

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 浙江 臨安 311300；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052）

菠蘿EST資源的SSR信息分析與開(kāi)發(fā)

陳俊浩1，陸 洋1，倪燕婕1，張智俊1，鐘雅萍1，鮑晶晶1，羅淑萍2

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 浙江 臨安 311300；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，新疆 烏魯木齊830052）

表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序列（EST-SSRs）存在于表達(dá)序列標(biāo)簽中，是一種最常用的新型微衛(wèi)星標(biāo)記。它可以被嵌入到功能基因序列中，有效并高效地提供更多的相關(guān)信息。通過(guò)對(duì)已公開(kāi)的5 659條菠蘿Ananas comosus的表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs）進(jìn)行電子篩選，獲得了617條含有簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）的菠蘿EST。平均7.39 kb EST序列中含有1個(gè)SSR，其中二核苷酸，三核苷酸和六核苷酸是SSR的主要重復(fù)類(lèi)型，分別占SSR總數(shù)的42.61%，29.25%和20.13%。所有重復(fù)類(lèi)型中重復(fù)次數(shù)最少的是四核苷酸序列（3.46%）。AG/TC是二核苷酸中的優(yōu)勢(shì)單元。根據(jù)搜索出的EST序列，共設(shè)計(jì)出30對(duì)物，其中27對(duì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物具有多態(tài)性。本次實(shí)驗(yàn)中開(kāi)發(fā)的EST-SSR標(biāo)記是迄今為止有關(guān)于菠蘿的第1次大規(guī)模SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)。研究結(jié)果為利用EST-SSR分子標(biāo)記進(jìn)行菠蘿連鎖圖譜構(gòu)建，數(shù)量基因定位，種質(zhì)資源遺傳多樣性，親緣關(guān)系研究和指紋圖譜構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。圖2表4參24

分子生物學(xué)；菠蘿；表達(dá)序列標(biāo)簽；簡(jiǎn)單重復(fù)序列

菠蘿Ananas comosus原產(chǎn)巴西，為熱帶多年生草本植物，16世紀(jì)時(shí)傳入中國(guó)，有70多個(gè)品種，嶺南四大名果之一。菠蘿含有大量的果糖，葡萄糖，維生素A，維生素B，維生素C，磷，檸檬酸和蛋白酶等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。其果味甘性溫，具有解暑止渴、消食止瀉之功，為夏令醫(yī)食兼優(yōu)的時(shí)令佳果。另外，菠蘿皮中富含菠蘿酶，有豐富的藥用價(jià)值，長(zhǎng)期食用菠蘿皮，心腦血管，糖尿病發(fā)病率顯著降低，并有一定的抗癌效果。近年來(lái)分子生物學(xué)的發(fā)展以及各種分子標(biāo)記技術(shù)不斷出現(xiàn)，使得植物遺傳分析研究得以迅速發(fā)展，其中以簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）標(biāo)記在植物遺傳研究上應(yīng)用最為廣泛。隨著測(cè)序技術(shù)成本的降低，GenBank中大量的植物表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）數(shù)據(jù)為SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)提供了新的途徑。EST-SSR除具一般SSR分子標(biāo)記特點(diǎn)外，還有信息量大，通用性好，開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快捷、成本低等［1］的特殊優(yōu)勢(shì)。目前，許多作物［2－5］已開(kāi)發(fā)大量的EST-SSR，并應(yīng)用于遺傳作圖、遺傳多樣性等［6］研究上，但在菠蘿栽培種上至今尚未見(jiàn)從EST中開(kāi)發(fā)SSR的相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)現(xiàn)有菠蘿EST中SSR信息進(jìn)行全面分析，以明確菠蘿EST-SSR發(fā)生頻率和特點(diǎn)，為進(jìn)一步建立EST-SSR標(biāo)記并探索其在菠蘿研究中的遺傳作圖、育種材料評(píng)價(jià)、品種鑒定等的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集菠蘿品種 ‘巴厘’Ananas comosus ‘Comte de Paris’的幼嫩葉片于－20℃保存。

1.2 菠蘿EST的獲得及EST-SSR序列查找

從美國(guó)生物技術(shù)中心（NCBI）的植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/PLANTS/ PlantList.html）共搜索到5 659條菠蘿的EST序列。應(yīng)用Websat（http://wsmartins.net/websat/）在線程序搜索EST-SSR。搜索的標(biāo)準(zhǔn)為：二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)分別大于或等于9，6，5，4和3。

1.3 EST-SSR引物設(shè)計(jì)

利用Primer Premier 3.0在線程序?qū)Π蠸SR的EST設(shè)計(jì)引物，引物設(shè)計(jì)的原則為EST序列長(zhǎng)度大于100 bp，SSR序列的開(kāi)始和結(jié)束位置分別距5′和3′端不少于20 bp。引物設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為：引物長(zhǎng)18～27 bp，最適為22 bp；引物退火溫度Tm值57～60℃，上游與下游引物的Tm值相差 ±1℃；PCR預(yù)期產(chǎn)物長(zhǎng)100～400 bp；盡量避免引物二聚體，發(fā)夾結(jié)構(gòu)和錯(cuò)配等。按重復(fù)類(lèi)型的比例挑選30對(duì)引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 EST數(shù)據(jù)冗余分析

利用VecScreen（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen）及RepeatMasker（http://www.repeatmasker.org）去除載體污染和重復(fù)序列，對(duì)于那些能設(shè)計(jì)出引物的EST序列，最后通過(guò)Tm值和引物序列比對(duì)進(jìn)一步刪除冗余序列。

1.5 DNA提取

采用改良十六烷基三甲基溴化銨法（CTAB）［7］提取菠蘿的基因組DNA。

1.6 PCR擴(kuò)增、電泳檢測(cè)

PCR反應(yīng)體系（25 μL）：10×緩沖液 2.5 μL，鎂離子（Mg2+）（25.0 mmol·L－1）1.5 μL，dNTP（10.0 mmol·L－1）0.5 μL，引物（100.0 μmol·L－1）1.0 μL，Taq酶（5.0×16.67 nkat）0.2 μL，模板DNA（20.0 mg·L－1）3.0 μL。

反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，51℃退火40 s，72℃延伸50 s，38個(gè)循環(huán)，72℃終延伸7 min，8℃保存。

PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離檢測(cè)，120 V電壓電泳1.5 h后，采用銀染法染色，BIO-RAD Gel Doc2000凝膠成像系統(tǒng)中成像。

1.7 SSR位點(diǎn)的功能分析

對(duì)篩選出的SSR提取其所在的基因序列，翻譯成蛋白質(zhì)序列后，利用Blastp比對(duì)，提取相似性最高的序列注釋信息，作為SSR靶向基因的功能注釋?zhuān)?duì)SSR位點(diǎn)的注釋信息進(jìn)行分類(lèi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菠蘿EST-SSR的頻率和分布密度

在5 659條EST序列中，經(jīng)過(guò)篩選共發(fā)現(xiàn)SSR序列636個(gè)，占整個(gè)EST數(shù)據(jù)庫(kù)的11.24%，表明菠蘿中的EST-SSR十分豐富。經(jīng)計(jì)算去除冗余后的菠蘿EST序列總長(zhǎng)約為4.7×106bp，菠蘿SSR分布密度為平均7.39 kb EST就存在1條SSR（表1），并且不同重復(fù)類(lèi)型的平均距離有明顯差異，EST-SSR出現(xiàn)頻率越高其平均距離則越小。菠蘿EST-SSR中含有二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)的序列分別占EST數(shù)據(jù)庫(kù)中發(fā)現(xiàn)SSR序列總數(shù)的42.61%（271/636），29.25%（186/636），3.46%（22/636），4.56%（29/636），20.13%（128/636）（表1），說(shuō)明菠蘿EST-SSR的優(yōu)勢(shì)重復(fù)單元為二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸，三者共占EST-SSR總數(shù)的91.99%。其中二核苷酸重復(fù)的出現(xiàn)頻率（42.61%）明顯高于其他類(lèi)型，三核苷酸（29.25%）和六核苷酸（20.13%）重復(fù)的出現(xiàn)頻率也相對(duì)較高。重復(fù)類(lèi)型為四核苷酸、五核苷酸的重復(fù)所占的比例比較小，只占總SSR的8.02%。

表1 菠蘿中EST-SSR的數(shù)量、比例、出現(xiàn)頻率與平均距離Table 1 Number,Proportion,frequency and mean distance of EST-SSR in pineapple

2.2 菠蘿EST-SSR的重復(fù)類(lèi)型特點(diǎn)

全部菠蘿的EST-SSR中共搜索出174種重復(fù)基元，其中二核苷酸重復(fù)基元有10種，三核苷酸重復(fù)基元有48種，四核苷酸重復(fù)基元有15種，五核苷酸重復(fù)基元有21種，六核苷酸重復(fù)基元有80種（表2）。在二核苷酸重復(fù)基元中AG/TC和GA/CT出現(xiàn)頻率最高，在總的SSR中所占比例為23.27%（148/ 636）和15.88%（101/636）。而三核苷酸的重復(fù)基元中AGA/TCT，AGC/TCG，CAG/GTC，CTC/GAG，CTG/GAC，CTT/GAA的出現(xiàn)次數(shù)在10以上，并且其中重復(fù)次數(shù)最大的AGC/TCG也僅為總SSR的4.09%（26/ 636）（表3）。統(tǒng)計(jì)顯示三核苷酸的基元種類(lèi)相對(duì)來(lái)說(shuō)較多，比較分散。六核苷酸的SSR在總的EST中有128條，但六核苷酸的重復(fù)基元種類(lèi)有80種，其中60種重復(fù)基元出現(xiàn)1次，其余20種重復(fù)基元出現(xiàn)次數(shù)在1次以上，在六核苷酸重復(fù)基元中CCTCCG出現(xiàn)7次，發(fā)生頻率僅占總SSR的1.10%?？傮w而言六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)雖然多，但每種基元類(lèi)型出現(xiàn)的頻率卻不高。而四核苷酸和五核苷酸的重復(fù)基元不僅在數(shù)量上很少，而且基元分布較平均，未出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)基元。

表2 菠蘿EST-SSR的重復(fù)基元Table 2 Repeat motif of EST-SSRs in pineapple

菠蘿的EST-SSR基元長(zhǎng)度分布情況見(jiàn)圖1。由于搜索標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格，將一些兀余序列剔除（特別是一些本身序列較短或者是數(shù)據(jù)庫(kù)重復(fù)登錄的序列）。因此，EST-SSR的分布不是連續(xù)的。菠蘿的EST-SSR基元長(zhǎng)度分布主要集中在18～36 bp，其中18 bp在總的分布中尤為突出，共有194條，占總數(shù)的30.50%。從整體趨勢(shì)來(lái)看，EST-SSR的數(shù)量是隨著基元長(zhǎng)度的增長(zhǎng)而減少的。TEMNYKH等［8］研究發(fā)現(xiàn)，SSR基元長(zhǎng)度在12 bp以下時(shí)為低多態(tài)性，長(zhǎng)度在12～20 bp的SSR為中等多態(tài)性，長(zhǎng)度大于或等于20 bp時(shí)為高多態(tài)性。依據(jù)以上標(biāo)準(zhǔn)，41.67%菠蘿的EST-SSR為中等多態(tài)性，58.33%菠蘿的EST-SSR則為高多態(tài)性。

圖1 菠蘿EST-SSR基元長(zhǎng)度分布Figure 1 The distribute of motif length of pineapple EST-SSR

表3 菠蘿EST-SSR三核苷酸不同重復(fù)基元的重復(fù)數(shù)量Table 3 Number of SSR loci in trinucleotide repeats across the entire pineapple ESTs

2.3 EST-SSR引物篩選

根據(jù)所統(tǒng)計(jì)的SSR位點(diǎn)的EST序列信息，共設(shè)計(jì)了636對(duì)引物，從中根據(jù)二、三、四、五、六核苷酸在總SSR中所占比例選取30對(duì)引物，其中包含3條重疊的SSR所對(duì)應(yīng)的引物，對(duì)菠蘿的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中篩選出27對(duì)引物能擴(kuò)增出清晰的，大小與預(yù)期片段相近的2～7條帶，占擴(kuò)增引物的90%，引物篩選結(jié)果見(jiàn)圖2。篩選出的27對(duì)引物的詳細(xì)信息見(jiàn)表4。該實(shí)驗(yàn)說(shuō)明利用菠蘿EST序列開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記是高效且可行的。

圖2 菠蘿30對(duì)EST-SSR引物擴(kuò)增結(jié)果Figure 2 Amplification results by 30 EST-SSR primers of pineapple

2.4 EST-SSR靶向基因的功能分析

值得關(guān)注的是，EST-SSR使無(wú)功能的分子標(biāo)記開(kāi)始逐步向可以揭示有基因功能的分子標(biāo)記發(fā)展［9］，篩選出來(lái)的菠蘿27對(duì)引物所對(duì)應(yīng)的EST，概念性翻譯后經(jīng)BLASTp分析，其中有11條為未知蛋白的mRNA序列，7條為還未發(fā)現(xiàn)的序列，其余9條EST的功能注釋中有水分脅迫誘導(dǎo)蛋白，甲酰轉(zhuǎn)移酶，衰老相關(guān)蛋白，脫水-應(yīng)答蛋白PD22前體，30S核糖體蛋白質(zhì)S9，核糖體蛋白L11類(lèi)似物，新生多肽相關(guān)復(fù)雜α鏈，質(zhì)膜H+-ATP酶，pop3肽，抑制蛋白以及菠蘿成熟果實(shí)cDNA，新生多肽相關(guān)復(fù)合物α鏈。

表4 菠蘿EST-SSR引物篩選信息Table 4 Information of Pineapple EST-SSR primer screening

表4 （續(xù)）Table 4 Continued

3 討論

利用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP），限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP），隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD）和簡(jiǎn)單重復(fù)間序列（ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)研究菠蘿遺傳多樣性已有文獻(xiàn)報(bào)道［10－14］。在菠蘿栽培種上至今尚未見(jiàn)從EST中開(kāi)發(fā)SSR的相關(guān)報(bào)道。隨著近年來(lái)NCBI中EST數(shù)據(jù)庫(kù)的完善，EST-SSR作為新一代分子標(biāo)記展現(xiàn)了廣闊的前景。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)菠蘿5 659條EST進(jìn)行SSR篩選，共發(fā)現(xiàn)636個(gè)SSR，分布于617條EST中，SSR占整個(gè)EST的11.24%，高于水稻Oryza sativa（4.70%）［15］，甘蔗Saccharum（2.90%）［5］，普通小麥Triticum aestivum（5.40%）［16］，辣椒Capsicum annuum（2.97%）［17］，白樺Betula platyphylla（10.20%）［18］，亞麻L(zhǎng)inum usitatissimum（2.73%）［19］，花生Arachis hypogaea（7.80%）［20］，香蕉Musa nana（5.30%）［21］，西瓜Citrullus vulgaris（6.89%）［2］，甜瓜Cucumis melo（8.36%）［22］，香菇Lentinus edodes（2.96%）［4］，略低于橡膠Hevea brasiliensis（11.42%）［1］，核桃Juglans regia（10.75%）［23］，獼猴桃Actinidia（14.08%）［24］。上述差異的原因，一是EST數(shù)據(jù)庫(kù)中不同物種間基因的差異導(dǎo)致SSR分布的差異；二是SSR檢索的軟件和標(biāo)準(zhǔn)不同導(dǎo)致最終篩選結(jié)果的差異。本研究所得菠蘿的EST中，二、三、六核苷酸是主導(dǎo)類(lèi)型，分別占SSR總數(shù)的42.61%，29.25%，20.13%。菠蘿二核苷酸重復(fù)中AG/TC是比較常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)基元類(lèi)型，在亞麻［19］、甜瓜［22］、蘋(píng)果［3］、花生［20］中也都存在這一規(guī)律；而三核苷酸的重復(fù)基元比較分散，優(yōu)勢(shì)基元AGC/TCG僅占三核苷酸重復(fù)類(lèi)型的13.98%，六核苷酸SSR在總的EST中有128條，而六核苷酸的重復(fù)基元有80種，種類(lèi)雖豐富，數(shù)量卻不多。

本研究共設(shè)計(jì)了636對(duì)菠蘿EST-SSR引物，合成的30對(duì)引物中有27對(duì)引物有良好的擴(kuò)增結(jié)果，可以預(yù)見(jiàn)對(duì)剩余引物的篩選有較高成功率地保證。菠蘿EST-SSR出現(xiàn)頻率高，而且類(lèi)型豐富，可為今后鳳梨科Bromeliaceae植物分類(lèi)、遺傳作圖、遺傳多樣性分析、功能基因定位等方面研究奠定良好基礎(chǔ)。

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Development of novel EST-SSR markers in pineapple（Ananas comosus）by data mining from public EST sequences

CHEN Junhao1,LU Yang1,NI Yanjie1,ZHANG Zhijun1,ZHONG Yaping1,BAO Jingjing1,LUO Shuping2
（1.The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A&F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China;2.College of Agriculture,Xinjiang Agricultural University,Urumqi 830052,Xinjiang,China）

Expressed sequence tags （ESTs）are used for microsatellite development.EST derived from simple sequence repeats （EST-SSRs）,one of the most common new microsatellite markers,are more likely to be embedded in functional gene sequences,to be less costly and time effective,and may provide more information.In the present study,analysis of 5 659 publicly available expressed sequence tags of pineapple（Ananas comosus）was conducted with the Webstat online program.Results of 636 （SSRs）,identified electronically in 617 ESTs, showed that the average density was one SSR per 7.39 kb of ESTs screened.Dinucleotide （42.61%）,trinucleotide（29.25%）,and hexanucleotide（20.13%）repeats were the dominant types among the obtained motifs. The least frequent was tetranucleotide repeats （3.46%）.TC/AG was most abundant in the dinucleotide motif. Of the 30 functional pairs,27 primer pairs showed polymorphisms by polymerase chain reaction（PCR）amplifications.Thus,the EST-SSRs developed here with the first large-scale development of SSR markers in pineapple have the potential to be used for development of genetic and physical maps,quantitative trait loci mapping, genetic diversity studies,association mapping,and finger printing cultivars.［Ch,2 fig.4 ref.24 ref.］

molecular biology；Ananas comosus;ESTs;SSR

S664.1；Q781

A

2095-0756（2017）02-0332-08

10.11833/j.issn.2095-0756.2017.02.018

2016-03-16；

2016-05-07

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（LY14C160009）

陳俊浩，從事生物科學(xué)研究。E-mail：hans_chan001@163.com。通信作者：張智俊，副教授，博士，從事生物技術(shù)與種質(zhì)創(chuàng)新研究。E-mail：397942805@qq.com