孫福財(cái)，劉雪婷，蔡志斌，張金華

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔綜合科，浙江 溫州 325027）

慢病毒介導(dǎo)microRNA-214在成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化過程中的作用

孫福財(cái)1，劉雪婷1，蔡志斌2，張金華1

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 口腔科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院 口腔綜合科，浙江 溫州 325027）

目的:構(gòu)建microRNA-214沉默慢病毒載體并研究其在成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化過程中的作用。方法:常規(guī)條件下培養(yǎng)成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，并對(duì)其進(jìn)行礦化誘導(dǎo)，檢測牙骨質(zhì)分化及礦化相關(guān)標(biāo)記物的變化。隨后，構(gòu)建microRNA-214沉默慢病毒載體并感染成牙骨質(zhì)細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察其感染效率，并用茜素紅和Von kossa染色檢測不同組成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化能力，最后檢測不同組之間牙骨質(zhì)分化標(biāo)志物的變化。結(jié)果: Real-time PCR結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP mRNA的相對(duì)表達(dá)量逐漸增加。空白組、陰性對(duì)照組和microRNA-214沉默載體組感染成牙骨質(zhì)細(xì)胞系比率達(dá)到90%以上。相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，microRNA-214沉默組microRNA-214的表達(dá)量顯著下降，這表明microRNA-214沉默載體很好地發(fā)揮了沉默功能。相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，microRNA-214沉默組能顯著提高成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖速率。成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化程度的檢測發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，microRNA-214沉默組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，形態(tài)變大。同時(shí)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表達(dá)量在microRNA-214沉默組中均顯著增加。結(jié)論:microRNA-214沉默能夠促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化。

microRNA-214；慢病毒屬；牙骨質(zhì)；細(xì)胞分化；牙再礦化

牙周病是人群中最廣泛流行的慢性感染性疾病。根據(jù)世界衛(wèi)生組織口腔健康流行病學(xué)調(diào)查，成年人中約80%患有不同程度的牙周疾病，并已威脅到各個(gè)年齡人群，是成年人失牙的首要原因[1]。牙周病對(duì)人類的健康危害如此之大，是因?yàn)樗鼤?huì)引起牙齦和牙周膜膠原纖維進(jìn)行性溶解破壞以及牙骨質(zhì)和牙槽骨的吸收缺陷。牙周再生治療的目的就是重建牙周組織。但牙周再生非常困難，是行內(nèi)公認(rèn)的難題，目前世界各國的口腔科研工作者都致力于開發(fā)有效促進(jìn)牙周再生的治療手段[2]。實(shí)際上，牙周組織再生的關(guān)鍵步驟就是牙周連接纖維重新附著于病變的根面上，研究表明，成功的牙骨質(zhì)再生是牙周組織再生中至關(guān)重要的一環(huán)[3]。

利用組織工程的方法達(dá)到成功的牙周組織再生是目前最為可行并具有可預(yù)見性的辦法，在牙周組織的再生中起重要作用。成功的牙周組織工程要求具備如下條件:合適的干細(xì)胞或前體細(xì)胞形成牙周組織，細(xì)胞接種到理想的支架材料，合適的因子來介導(dǎo)細(xì)胞的多功能分化[4-5]。microRNA-214是一種具有骨改建作用的重要調(diào)節(jié)因子，研究表明其可以通過Atf4來抑制成骨細(xì)胞活性并減少其礦化的能力，這提示microRNA-214可能可以作為一種較為合適的調(diào)節(jié)因子參與到牙周組織工程中來促進(jìn)牙骨質(zhì)的再生[6]，然而microRNA-214在牙骨質(zhì)分化及礦化中的作用目前缺少相關(guān)研究。相對(duì)于脂質(zhì)體、聚乙烯亞胺（polyethylenimine，PEI）和腺病毒轉(zhuǎn)染，慢病毒載體轉(zhuǎn)染具有包裝周期短和長期穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點(diǎn)，因此我們將慢病毒作為microRNA-214轉(zhuǎn)染的載體，研究其對(duì)成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的影響[7]。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及主要材料 成牙骨質(zhì)細(xì)胞系購于美國ATCC細(xì)胞庫；10%胎牛血清購于美國Gibco公司；β-甘油磷酸鈉購于美國Sigma公司；microRNA-214沉默慢病毒載體購于上海吉瑪基因化學(xué)技術(shù)有限公司；細(xì)胞增殖速率測定試劑盒CCK8購于日本同仁公司；茜素紅試劑盒和Von kossa試劑盒購于美國Sigma公司；胰酶、DMEM高糖培養(yǎng)基購于美國Hyclone公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、Runt相關(guān)基因2（Runtrelated transcription factor 2，Runx2）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）、一型膠原（Collagen I，Colla）、核衣殼蛋白（capsule associated protein，CAP）和內(nèi)參基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）的Real-time反應(yīng)序列均由北京天一輝遠(yuǎn)公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組:采用含有10%胎牛血清和2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)成牙本質(zhì)細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)分為3組:空白組為在感染空載體的同時(shí)置于正常的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；陰性對(duì)照組為在感染含有無義序列的病毒上清的同時(shí)，置于正常的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)；microRNA-214沉默組為在感染microRNA-214沉默慢病毒載體的同時(shí)，置于正常的細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為平衡各組的病毒梯度，分組前采用慢病毒滴度測定試劑盒測量了病毒滴度。成牙骨質(zhì)向誘導(dǎo)的方法為:在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中加入5 mmol/L β-甘油磷酸鈉作為其成牙骨質(zhì)向分化的誘導(dǎo)劑[8]。

1.2.2 慢病毒感染及鑒定:取對(duì)數(shù)生長期的成牙骨質(zhì)細(xì)胞，加入含有microRNA-214和陰性對(duì)照組的慢病毒載體上清，感染24 h后，分別用倒置熒光顯微鏡檢測平均熒光強(qiáng)度。

1.2.3 細(xì)胞增殖速率測定:取病毒感染后對(duì)數(shù)生長期的成牙骨質(zhì)細(xì)胞，分別用細(xì)胞速率測定試劑盒CCK8測定不同組細(xì)胞的增殖速率。

1.2.4 茜素紅和Von kossa染色:分別將空白組、陰性對(duì)照組和microRNA-214沉默組病毒上清感染成牙骨質(zhì)細(xì)胞后，利用成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)成牙骨質(zhì)之后，分別采用0.2%的茜素紅試劑盒和5% Von kossa染色試劑盒檢測成牙骨質(zhì)細(xì)胞形成礦化結(jié)節(jié)的能力。

1.2.5 Real-time PCR檢測:分別提取空白組、陰性對(duì)照組和microRNA-214沉默組3組成牙骨質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)14 d后的總RNA，反轉(zhuǎn)成cDNA后，分別檢測Runx2、BSP、ALP、OCN、Col1a和CAP基因的表達(dá)水平，并測定誘導(dǎo)14 d后microRNA-214表達(dá)情況。1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，多個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化誘導(dǎo) Real-time PCR的結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP的表達(dá)水平逐漸上升（P＜0.05），表明成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化誘導(dǎo)成功。同期檢測了microRNA-214的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)microRNA-214的表達(dá)量隨著時(shí)間的推移逐漸下降（P＜0.05），見表2。

2.2 microRNA-214沉默慢病毒轉(zhuǎn)染 倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白組、陰性對(duì)照組和microRNA-214沉默組均很好地感染上了成牙骨質(zhì)細(xì)胞系，通過計(jì)數(shù)熒光視野和白場視野的細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)感染比率達(dá)到了90%以上，表明3組質(zhì)粒均能順利地轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞（見圖1）。同時(shí)，我們檢測了microRNA-214的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)在空白組和陰性對(duì)照組均有較多的microRNA-214的表達(dá)量，而在microRNA-214沉默組，其表達(dá)量顯著下降（P＜0.05），這表明microRNA-214沉默載體很好地發(fā)揮了沉默功能（見圖2）。進(jìn)一步檢測了3組不同的病毒感染成牙骨質(zhì)細(xì)胞后成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖速率，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，microRNA-214沉默組能夠顯著提高成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖速率（見圖2）。

表1 成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化誘導(dǎo)過程中Runx2、Bsp、Alp、Ocn、Colla、CAP和microRNA-214的表達(dá)量變化（n=6，±s）

表1 成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化誘導(dǎo)過程中Runx2、Bsp、Alp、Ocn、Colla、CAP和microRNA-214的表達(dá)量變化（n=6，±s）

圖1 慢病毒感染成牙骨質(zhì)細(xì)胞的熒光圖（×20）

圖2 3組microRNA-214的相對(duì)表達(dá)量和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖量

2.3 microRNA-214沉默載體能夠促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化及礦化 采用茜素紅染色和Von kossa染色來檢測成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的程度，并采用檢測成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化標(biāo)志物的方式來檢測其分化程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在空白組和陰性對(duì)照組中，形成了數(shù)量相當(dāng)?shù)牡V化結(jié)節(jié)，2組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而在microRNA-214沉默組中，發(fā)現(xiàn)了礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，形態(tài)變大，見圖3。同時(shí)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表達(dá)量在microRNA-214沉默組中均顯著增加（P＜0.05），見圖4。這些都表明了microRNA-214沉默能夠顯著地促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化和礦化。

圖3 茜素紅和Von kossa染色檢測成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的程度（×20）

圖4 成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、BSP、Runx2、Col1a、OCN和CAP的mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

牙周炎是一種非常常見的感染性疾病，極易導(dǎo)致牙齒的缺失。目前大家一直嘗試用各種再生性手術(shù)、組織工程方法、局部使用重組生長因子等方法促進(jìn)牙周組織再生，特別是牙周膜和牙槽骨的再生，往往忽略了根面的牙骨質(zhì)的再生。到目前為止還沒有一種方法能夠達(dá)到重建新的牙骨質(zhì)、牙周膜和牙槽骨[9]。研究表明成功的牙骨質(zhì)再生是牙周組織再生的金標(biāo)準(zhǔn)[10]。因此，如何利用組織工程的方法重建功能性的牙骨質(zhì)具有十分重要的臨床意義。

microRNA-214是一種重要的血管生成信號(hào)調(diào)節(jié)因子，在缺氧環(huán)境下，上調(diào)microRNA-214可以促進(jìn)血管重構(gòu)[11]。此外，microRNA-214還是十分關(guān)鍵的骨改建調(diào)節(jié)因子，其可以通過直接靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子Atf4來抑制成骨細(xì)胞的分化和基質(zhì)礦化。

本研究發(fā)現(xiàn)microRNA-214可以有效地提高成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖速率，Real-time PCR的結(jié)果顯示，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長，成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP的mRNA相對(duì)表達(dá)量逐漸增加。李瑤等[12]和童曉潔等[13]研究表明，ALP、Runx2、BSP、OCN、Col1a和CAP是在成骨細(xì)胞分化及牙齒的發(fā)育過程中起著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子，牙齒及骨組織中的特異性基質(zhì)蛋白在轉(zhuǎn)錄水平均受其調(diào)控?？瞻捉M、陰性對(duì)照組和microRNA-214沉默組感染成牙骨質(zhì)細(xì)胞系比率達(dá)到90%以上。相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，microRNA-214沉默組microRNA-214的表達(dá)量顯著下降，這表明microRNA-214沉默載體很好地發(fā)揮了沉默功能。成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化的程度檢測發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于空白組和陰性對(duì)照組，microRNA-214沉默組礦化結(jié)節(jié)數(shù)量增多，形態(tài)變大。楊楠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，microRNA-21的靶基因負(fù)向調(diào)控人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，在骨形成過程發(fā)揮著重要作用，與本文研究結(jié)果相似，microRNA能夠促進(jìn)骨質(zhì)細(xì)胞礦化。同時(shí)，成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化的標(biāo)志物ALP、Runx2、OCN、Col1a、BSP和CAP的表達(dá)量在microRNA-214沉默組中均顯著增加。這表明，microRNA-214影響成牙骨質(zhì)細(xì)胞分化及礦化的機(jī)制可能與其在骨改建中的機(jī)制相同，即通過結(jié)合Atf4的mRNA，抑制Atf4的表達(dá)，從而抑制了成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化及礦化。李春雷等[15]研究發(fā)現(xiàn)，在人牙周膜細(xì)胞骨向分化中microRNA101可能通過抑制PLAP-1而促進(jìn)其成骨分化能力，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，microRNA-214沉默可以顯著促進(jìn)成牙骨質(zhì)細(xì)胞的增殖、分化、礦化，可能作為一個(gè)潛在的靶點(diǎn)應(yīng)用于牙周組織工程。

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（本文編輯：賈建敏）

The functional role of microRNA-214 in the differentiation and mineralization of cementoblasts

SUN Fucai1, LIU Xueting1, CAI Zhibin2, ZHANG Jinhua1.
1.Department of Stomatology, the First Aff liated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325015; 2.Department of General Dentistry, the Aff liated Stomatological Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To construct a silencing plasmid of microRNA-214 and study the functional role of microRNA-214 in the differentiation and mineralization of cementoblasts.Methods:The cementoblasts was cultured in normal condition and expression level of the cementoblastic markers was test during the differentiation and mineralization induction period. Silencing lentiviral vector of microRNA-214 was constructed and then transfected into mouse cementoblasts (OCCM-30 cell lines). Fluorescence microscope was used to detect transfection ability and silencing effects of the construct. Alizarin Red and Von kossa staining was used to test the mineralization ability of cementoblasts. Real-time PCR was used to demonstrate the differentiation ability of cementoblasts.Results:Real-time PCR results showed that the relative expression of cementoblast differentiation marker ALP, Runx2, BSP, OCN, Col1a and CAP mRNA increased gradually as time goes on. The blank group, negative control group and microRNA-214 group infection ratio of silent carrier reached more than 90% cementum cells. Compared with blank group and negative control group, the expression of microRNA-214 in the microRNA-214 silencing group decreased 5 times. The results showed that the microRNA-214 silencing vector played a good role in silence. Compared with blank group and negative control group, microRNA-214 silencing group could signif -cantly increase the proliferation rate of cementoblasts. Compared with blank group and negative control group, microRNA-214 silencing group, the number of mineralized nodules increased and the morphology becamed larger. Cementoblast differentiation markers ALP, Runx2, OCN, Col1a, BSP and CAP expression were significantly increased in microRNA-214 silencing group in silence.Conclusion:The research demonstrats that silencing lentiviral vector of MicroRNA-214 can promote the differentiation and mineralization ability of cementoblasts.

microRNA-214; lentivirus; dental cementum; cell differentiation; tooth remineralization

R780.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.007

2016-07-24

孫福財(cái)（1976-），男，浙江溫州人，主治醫(yī)師，碩士。