凌人，凌今，2，陳仲華，劉丹丹，趙宏圻，柯友濤

（1.金華廣福醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321000；2.復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203）

14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關(guān)系

凌人1，凌今1，2，陳仲華1，劉丹丹1，趙宏圻1，柯友濤1

（1.金華廣福醫(yī)院 病理科，浙江 金華 321000；2.復(fù)旦大學(xué) 藥學(xué)院，上海 201203）

目的:探討14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關(guān)系。方法:采用免疫組織化學(xué)S-P法對80例雌激素受體陽性乳腺癌組織中14-3-3 zeta蛋白表達進行檢測，根據(jù)14-3-3 zeta蛋白表達情況將患者分組，結(jié)合每組生存情況評價14-3-3 zeta蛋白過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的關(guān)系。結(jié)果:癌組織中14-3-3 zeta蛋白表達總陽性率為96.25%（77/80），其中強陽性占51.25%（41/80），中等陽性占23.75%（19/80），弱陽性占21.25%（17/80）。14-3-3 zeta蛋白過表達與臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)性。隨訪結(jié)果顯示，14-3-3 zeta蛋白過表達組患者在應(yīng)用他莫昔芬治療后更容易復(fù)發(fā)，生存期明顯較短。細(xì)胞實驗表明，提高乳腺癌細(xì)胞中14-3-3 zeta蛋白表達可以增強其對他莫昔芬的耐藥性，反之，抑制14-3-3 zeta蛋白表達可有效提高他莫昔芬治療的敏感性。結(jié)論:14-3-3 zeta蛋白可以作為他莫昔芬治療乳腺癌耐藥評估的生物標(biāo)記物，檢測乳腺癌組織內(nèi)14-3-3 zeta蛋白表達可以用于評估他莫昔芬治療乳腺癌的療效。

乳腺腫瘤；14-3-3 zeta；免疫組織化學(xué)法；他莫昔芬；細(xì)胞凋亡

臨床上對于雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性的乳腺癌患者常針對性地選用ER拮抗劑（如他莫昔芬）進行內(nèi)分泌治療。然而，內(nèi)分泌治療的有效率僅50%～60%[1-2]。內(nèi)分泌治療無效的患者往往會因首次治療失敗而錯過最佳治療時機，生存質(zhì)量和生存時間大打折扣。因此，尋求一種新的生物標(biāo)記物結(jié)合ER表達來更加準(zhǔn)確地評估乳腺癌內(nèi)分泌治療的有效性顯得格外重要。

14-3-3 zeta蛋白是一種細(xì)胞信號轉(zhuǎn)錄蛋白，通過結(jié)合磷酸絲氨酸蛋白介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測14-3-3 zeta蛋白在80例激素依賴型乳腺癌組織中的表達，探討其過表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的相關(guān)性，并通過改變?nèi)橄侔㎝CF-7細(xì)胞株的14-3-3 zeta蛋白表達進一步驗證該蛋白表達與他莫昔芬治療乳腺癌耐藥的相關(guān)性，旨在為臨床更加合理地制定診療方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集我院2006至2014年間經(jīng)手術(shù)治療的乳腺癌患者80例作為研究對象，并對其臨床和病理資料進行整理和分析。納入標(biāo)準(zhǔn):①原發(fā)性乳腺癌；②術(shù)前未經(jīng)過任何抗腫瘤治療；③經(jīng)過2位以上病理科醫(yī)師確診；④免疫組織化學(xué)重新檢測ER表達為陽性（染色細(xì)胞比率大于10%）；⑤使用內(nèi)分泌治療作為首次治療方案；⑥病例及隨訪記錄完整。研究對象均為女性，平均年齡46±8歲（38～62歲），參照2015年St.Gallen國際乳腺癌大會共識:術(shù)后Luminal A型通常僅需內(nèi)分泌治療，Luminnal B型全部患者均需內(nèi)分泌治療，大多數(shù)要輔助化療，對有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且直徑在5 cm以上患者予以放療。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色:所有標(biāo)本均經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，HE染色。另取切片，采用免疫組織化學(xué)S-P法，鼠抗人14-3-3 zeta單克隆抗體作為一抗，1：100稀釋，參照說明書設(shè)置染色程序，并由Leica Bond-Max全自動免疫組織化學(xué)染色儀完成。一抗和二抗購自美國Abcam公司，抗體稀釋工作液、DAB顯色試劑盒購自Leica公司。每批染色均設(shè)有陽性對照、陰性對照，對照切片出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的同批染色切片方可進一步讀判。14-3-3 zeta蛋白陽性染色為棕黃色顆粒，主要位于胞漿。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果判定根據(jù)其著色強度×腫瘤細(xì)胞陽性率:染色深，且染色細(xì)胞比率超過50%者為強陽性染色（+++）；染色強度中等，且染色細(xì)胞比率25%～50%者為陽性染色（++）；染色較淺，且染色細(xì)胞比率10%～25%者為弱陽性染色（+）；定位處沒有染色，或者染色細(xì)胞比率＜10%者為陰性染色（-）。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):乳腺癌MCF-7細(xì)胞株采用含10%胎牛血清和雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染:將重組質(zhì)粒DNA經(jīng)大腸桿菌Ecoli DH5α在含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中增殖，提純。細(xì)胞在轉(zhuǎn)染前鋪板，使其在轉(zhuǎn)染時密度為90%～95%時，使用50 μL無血清RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋1.0 μg DNA。使用50 μL RPMI 1640培養(yǎng)基稀釋3 μL Lipofectamine 2000試劑（購于Invitrogen公司）?；旌仙鲜雠渲玫?種試液，直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔用2 mL PBS清洗1遍，再用1 mL RPMI 1640清洗2遍，加入不含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞內(nèi)增強綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的表達情況，采用細(xì)胞計數(shù)法評價轉(zhuǎn)染效率。每孔取3個不同的視野分別計數(shù)細(xì)胞總數(shù)和有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)。轉(zhuǎn)染效率=（發(fā)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

1.2.4 RNA干擾:14-3-3 zeta RNA干擾雙鏈siRNA合成序列:14-3-3 zeta特異性序列為5’-AAAGUUCUU GAUCCCCAAUGC-3’，對照序列為5’-CAGUCGCGUUUGCG ACUGG-3’。細(xì)胞鋪板生長至1×106后，使用Lipofectamine Plus試劑盒與100 nmol/L的siRNA按照說明書操作進行轉(zhuǎn)染。

1.2.5 TUNEL凋亡檢測:PBS清洗細(xì)胞2次，隨后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30～60 min。用PBS清洗細(xì)胞，加入含0.1% Triton X-100的PBS冰浴孵育2 min。按末端轉(zhuǎn)移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT）與熒光標(biāo)記液1：24比例配置TUNEL檢測液，每個樣品加入50 μL，37 ℃避光孵育60 min，用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡450 nm波長下觀察，綠色熒光為TUNEL染色陽性細(xì)胞。對隨機5個視野下的細(xì)胞總數(shù)和陽性細(xì)胞進行計數(shù)，并計算陽性率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS18.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 14-3-3 zeta表達為胞漿著色，鏡下呈均勻一致的棕黃色顆粒（見圖1），總陽性率為96.25%（77/80），其中強陽性占51.25%（41/80），中等陽性占23.75%（19/80），弱陽性占21.25%（17/80），陰性占3.75%（3/80）。

2.2 生存分析 根據(jù)14-3-3 zeta表達強弱將80例患者分為2組，分別記錄其96個月內(nèi)乳腺復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、死亡的不良事件發(fā)生情況。14-3-3 zeta高表達組共41例患者，觀察期內(nèi)發(fā)生不良事件10例，發(fā)生率為24.4%（10/41）；14-3-3 zeta低或中表達組共39例患者，觀察期內(nèi)發(fā)生不良事件2例，發(fā)生率為5.1%（2/39）。統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)顯示，14-3-3 zeta高表達組患者發(fā)生不良事件概率顯著高于14-3-3 zeta低表達組患者（χ2=24.4，P＜0.05）。見圖2。

圖1 乳腺癌組織中14-3-3 zeta蛋白免疫組織化學(xué)染色圖（×200）

圖2 14-3-3 zeta過表達與患者內(nèi)分泌治療后無進展生存期的生存曲線圖

2.3 14-3-3 zeta表達與臨床病理因素的相關(guān)性 通過對14-3-3 zeta表達情況與患者各臨床病理因素的統(tǒng)計學(xué)分析得出:14-3-3 zeta的表達與患者年齡、患側(cè)、病理分級、腫瘤大小、脈管累及、神經(jīng)累及、Ki67、Her2過表達型均無相關(guān)性（P＞0.05），見表1。

2.4 細(xì)胞藥敏結(jié)果 通過對MCF-7細(xì)胞進行轉(zhuǎn)染，14-3-3 zeta表達水平明顯提高（P＜0.05）（見圖3A）。對于未轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染14-3-3 zeta基因的MCF-7細(xì)胞分別進行他莫昔芬處理72 h。檢測其凋亡水平發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染14-3-3 zeta基因后MCF-7細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見圖3B）。未轉(zhuǎn)染14-3-3 zeta基因的MCF-7細(xì)胞經(jīng)他莫昔芬處理后凋亡顯著增加（見圖4A），轉(zhuǎn)染14-3-3 zeta基因的MCF-7細(xì)胞經(jīng)他莫昔芬處理后細(xì)胞凋亡不明顯（見圖4B）。隨后，采用合成的siRNA對于MCF-7細(xì)胞進行處理，下調(diào)14-3-3 zeta基因表達至原表達量的50%（P＜0.05）（見圖5A），再用他莫昔芬處理細(xì)胞，結(jié)果顯示下調(diào)14-3-3 zeta表達量后細(xì)胞凋亡顯著增高（見圖5B）。未干擾14-3-3 zeta基因表達的MCF-7細(xì)胞經(jīng)他莫昔芬處理后凋亡較少（見圖6A），干擾下調(diào)14-3-3 zeta基因表達的MCF-7細(xì)胞經(jīng)他莫昔芬處理后細(xì)胞凋亡顯著增加（見圖6B）。

表1 14-3-3 zeta表達與臨床因素相關(guān)性

3 討論

乳腺癌細(xì)胞會特異性地表達ER、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor rece-ptor-2，HER2）、Ki-67等多種蛋白[3-4]。以上述這些蛋白作為生物標(biāo)記物，根據(jù)其表達情況可將乳腺癌分為Luminal A型、Luminal B型、Her2型和基底樣型等4種分子分型。其中，針對ER陽性的Luminal型乳腺癌患者，內(nèi)分泌治療是首選治療措施。

他莫昔芬是乳腺癌內(nèi)分泌治療的代表性藥物，它是一種雌二醇競爭性拮抗劑，能與乳腺細(xì)胞的雌激素受體結(jié)合，不刺激轉(zhuǎn)錄或作用微弱[5]。理論上來說，他莫昔芬作為一種ER拮抗劑對ER陽性患者均具有療效[6]。然而，由于乳腺癌遺傳異質(zhì)性基因的存在，激活ER并非唯一的或主要的促進乳腺癌細(xì)胞增殖的途徑[7]。這使得應(yīng)用內(nèi)分泌治療中，有40%～50%的ER陽性患者對內(nèi)分泌治療藥物發(fā)生耐藥，致使后續(xù)的針對性治療變得更為困難[8]。

14-3-3蛋白家族具有高度保守的氨基酸序列，幾乎存在于一切真核生物體內(nèi)[9]。14-3-3蛋白在人體中存在有7種亞型，其中14-3-3 zeta基因位于2號染色體p25.1區(qū)段，含有6個外顯子，表達的14-3-3 zeta蛋白含有245個氨基酸。14-3-3 zeta蛋白缺乏內(nèi)源性酶活性，主要功能是通過形成二聚體或異質(zhì)二聚體對目標(biāo)蛋白的絲氨酸/蘇氨酸位點進行磷酸化而實現(xiàn)的。14-3-3 zeta可以磷酸化MEKK1的調(diào)控結(jié)構(gòu)區(qū)域，抑制caspase-3對MEKK1 N端調(diào)控結(jié)構(gòu)域的作用，阻礙凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[10-11]。14-3-3 zeta還可以通過對BCL2-associated agonist of cell death（Bad）蛋白Ser136磷酸化阻礙其由細(xì)胞漿轉(zhuǎn)運到線粒體，進而發(fā)揮抗凋亡的作用。反之，當(dāng)細(xì)胞分裂周期蛋白2（cell division cycle protein 2，CDC2）磷酸化Bad的Ser128后，14-3-3 zeta則無法磷酸化Bad的Ser136，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究[12-14]發(fā)現(xiàn)，14-3-3 zeta蛋白通過作用于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進多種惡性腫瘤細(xì)胞的增殖或抑制細(xì)胞凋亡。

圖3 轉(zhuǎn)染14-3-3 zeta前后MCF-7細(xì)胞對他莫昔芬處理的藥敏結(jié)果

圖4 14-3-3 zeta轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞前后他莫昔芬處理的TUNEL染色圖（×400）

圖5 干擾14-3-3 zeta前后MCF-7細(xì)胞對他莫昔芬處理的藥敏結(jié)果

圖6 干擾MCF-7細(xì)胞內(nèi)14-3-3 zeta表達前后他莫昔芬處理的TUNEL染色圖（×400）

14-3-3蛋白表達異?？赡芷茐恼＜?xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致腫瘤和其他疾病的發(fā)生。比如14-3-3δ是一種腫瘤抑制基因，其表達缺失常見于乳腺癌中。反之，其他14-3-3蛋白在多種癌癥中常表現(xiàn)為高表達，其臨床生物學(xué)意義目前已有所發(fā)現(xiàn)[15]。DANES等[16]研究表明，乳腺癌早期會發(fā)生14-3-3 zeta過表達，其促進人乳腺上皮細(xì)胞化生。在約40%晚期乳腺癌患者中會發(fā)生14-3-3 zeta高表達，這些患者往往會復(fù)發(fā)，且生存時間明顯縮短[17]。在這些復(fù)發(fā)的乳腺癌患者中，僅有小于30%的乳腺癌患者Her2表達陽性，而約有40%的患者14-3-3 zeta表達強陽性。因此，14-3-3 zeta作為一種不良預(yù)后的生物標(biāo)記物會更加準(zhǔn)確。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)[11]，14-3-3 zeta在乳腺癌組織中顯著高表達，統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)其與臨床病理因素?zé)o明顯相關(guān)，推測其與腫瘤分化、進展無直接聯(lián)系；ER陽性組患者癌組織內(nèi)14-3-3 zeta蛋白表達顯著高于ER陰性組，提示14-3-3 zeta在乳腺癌中的上調(diào)可能受到激素影響，其高表達可能與內(nèi)分泌治療療效之間存在相關(guān)性。本研究對使用他莫昔芬治療的乳腺癌患者癌組織中的14-3-3 zeta蛋白進行檢測，對照其生存情況發(fā)現(xiàn)，癌組織中14-3-3 zeta高表達組的患者復(fù)發(fā)率較14-3-3 zeta低表達組顯著升高。在8年隨訪期里，14-3-3 zeta高表達組中患者的無進展生存率較14-3-3 zeta低表達組低約15%，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，14-3-3 zeta的表達與患者臨床資料均不相關(guān)，屬于他莫昔芬耐藥的獨立相關(guān)因素。本研究數(shù)據(jù)表明，提高乳腺癌細(xì)胞中14-3-3 zeta的表達可以增強腫瘤細(xì)胞對他莫昔芬的耐藥性，而降低14-3-3 zeta的表達則有效提高他莫昔芬的敏感性，本研究結(jié)果與臨床觀察結(jié)果相符。

綜上所述，14-3-3 zeta蛋白高表達促進了乳腺癌細(xì)胞對內(nèi)分泌治療的耐受，下調(diào)該基因表達能顯著增強細(xì)胞凋亡，提高內(nèi)分泌治療靈敏度。臨床上觀察，14-3-3 zeta蛋白高表達還預(yù)示乳腺癌患者較短的生存期。因此，14-3-3 zeta蛋白高表達可以作為乳腺癌內(nèi)分泌治療的生物標(biāo)記物，檢測乳腺癌組織內(nèi)14-3-3 zeta蛋白表達可準(zhǔn)確評估患者預(yù)后。

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（本文編輯：吳昔昔）

The relationship between 14-3-3 zeta protein over-expression and tamoxifen resistance in breast cancer

LING Ren1, LING Jin1,2, CHEN Zhonghua1, LIU Dandan1, ZHAO Hongqi1, KE Youtao1.
1.Department of Pathology, Jinhua Guangfu Hospital, Jinhua, 321000; 2.School of Pharmacy, Fudan University, Shanghai, 201203

Objective:To investigate the relationship between 14-3-3 zeta protein over-expression and tamoxifen resistance in breast cancer.Methods:The 14-3-3 zeta protein expression was detected in the cancerous tissues of 80 breast patients using immunohistochemistry. Based on the follow-up visits, survival status in both high and low 14-3-3 zeta expression groups were analyzed.Results:The total positive ratio of 14-3-3 zeta protein expression in subjects was 96.25% (77/80). Among the total positive ratio, the strong positive ratio, moderate positive ratio and weakly positive ratio were 51.25% (41/80), 23.75% (19/80) and 21.25% (17/80), respectively. The 14-3-3 zeta protein over-expression was related to clinical pathological features. According to the follow-up results, the patients in 14-3-3 zeta high expression group would cause the relapse easily for a short survival time. The results of vitro experiment indicated that the Tamoxifen resistance was enhanced after increasing the expression of 14-3-3 zeta protein. Conversely, the down-regulation of 14-3-3 zeta protein expression would reduce the tamoxifen resistance.Conclusion:As a biomarker of tamoxifen resistance, 14-3-3 zeta protein can be used for evaluating therapeutic eff cacy by detecting its expression in breast cancer tissue.

breast neoplasms; 14-3-3 zeta; immunohistochemistry; tamoxifen; cell apoptosis

R361.2

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.008

2016-09-21

金華市科技計劃項目（2014-3-088）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計劃項目（2015KYB419）。

凌人（1957-），女，安徽合肥人，副主任醫(yī)師。