來(lái)麗華，葛 建（1.杭州市中醫(yī)院廣興堂國(guó)醫(yī)館中藥房，杭州 310007；2.中國(guó)計(jì)量大學(xué)藥學(xué)系，杭州310018）

葡萄籽原花青素對(duì)膽汁酸鹽在結(jié)腸腺細(xì)胞Caco-2中轉(zhuǎn)運(yùn)的影響Δ

來(lái)麗華1＊，葛 建2#（1.杭州市中醫(yī)院廣興堂國(guó)醫(yī)館中藥房，杭州 310007；2.中國(guó)計(jì)量大學(xué)藥學(xué)系，杭州310018）

目的：研究葡萄籽原花青素（GSP）對(duì)甘氨膽酸鈉（GA）和牛磺膽酸鈉（TA）在結(jié)腸腺細(xì)胞Caco-2中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。方法：利用Caco-2細(xì)胞模型，采用反相-高效液相色譜法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中GA和TA的含量。試驗(yàn)分為GSP組、GA組、TA組、GSP+ GA組和GSP+TA組，分別檢測(cè)0、2、4、8 h從Transwell小室頂端（AP）側(cè)透過(guò)Caco-2細(xì)胞向基底端（BL）側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)GA和TA的透過(guò)量。結(jié)果：GA和TA檢測(cè)濃度的線性范圍均為0.05～1.2 mmol/L（R2＝0.999 9）。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GA組和TA組BL側(cè)GA和TA的透過(guò)量急劇增加；而加入GSP后，BL側(cè)GA和TA的透過(guò)量明顯較少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論：GSP對(duì)GA和TA在Caco-2細(xì)胞中的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)具有抑制作用。

葡萄籽原花青素；結(jié)腸腺細(xì)胞Caco-2；?；悄懰徕c；甘氨膽酸鈉；跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)

原花色素是廣泛存在于多種植物中，具有C6-C3-C6基本構(gòu)架的一類多酚化合物的總稱，其中原花青素報(bào)道最多，分布最為廣泛。國(guó)內(nèi)外研究表明，原花青素具有抗氧化、清除自由基、抗菌、抗癌以及保護(hù)肝和心腦血管系統(tǒng)等作用[1-3]。近年來(lái)，關(guān)于葡萄籽原花青素（GSP）在調(diào)控心腦血管系統(tǒng)功能方面的報(bào)道較多，尤其是GSP對(duì)機(jī)體脂質(zhì)代謝過(guò)程改善方面的報(bào)道最多[4]。然而，關(guān)于GSP調(diào)控脂質(zhì)代謝的分子機(jī)制研究報(bào)道較少。

膽汁酸是在肝中由膽固醇合成的物質(zhì)，與甘氨酸或牛磺酸結(jié)合生成甘氨膽酸鈉（GA）或?；悄懰徕c（TA）分泌入十二指腸，膽汁酸鹽可在盲腸末端被重吸收進(jìn)入腸肝循環(huán)，以保持膽汁酸鹽的動(dòng)態(tài)平衡[5]。有研究表明，部分水果、蔬菜或茶葉中某些組分可結(jié)合膽汁酸鹽，使其排出體外，阻止膽汁酸鹽的重吸收，可促進(jìn)血漿及肝中膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸，從而降低膽固醇的含量，起到降血脂的效果[6-7]。

筆者前期研究表明，兒茶素類天然多酚化合物能顯著吸附膽汁酸鹽，從而抑制腸道脂質(zhì)吸收，起到調(diào)控血脂代謝功能[8]。而GSP為兒茶素的天然聚合物，同樣能顯著吸附或結(jié)合膽汁酸鹽。本文主要研究GSP對(duì)膽汁酸鹽GA和TA在結(jié)腸腺細(xì)胞Caco-2中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，旨在揭示其在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝方面的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器

LC-20ATvp高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)和Prominence SPD-20A紫外檢測(cè)器（日本Shimaduz公司）；CB53 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder公司）；24孔培養(yǎng)板用Transwell小室（美國(guó)Corning公司）；TS100-F倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 藥品與試劑

GSP原料藥（寧波禾普生物科技有限公司，批號(hào)：20101012，純度：＞95%）；TA標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：C1319058，純度：95%）和GA標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：D1303029，純度：98%）均購(gòu)于杭州邦易化工有限公司；苯酚紅（批號(hào)：P110947，純度：＞99%）和二甲基亞砜（批號(hào)：D103281，純度：＞99.9%）均購(gòu)于上海阿拉丁有限公司。

1.3 細(xì)胞與培養(yǎng)液

結(jié)腸腺細(xì)胞Caco-2購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞典藏中心，用DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液（含1%非必需氨基酸、1% L-谷氨酰胺、100 u/mL青霉素、100 u/mL鏈霉素和10%胎牛血清）培養(yǎng)，使用前以一次性過(guò)濾頭除菌后密封，備用。

2 方法

2.1 GA和TA的含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件 將文獻(xiàn)[9]方法略作修改，以反相（RT）-HPLC法測(cè)定GA和TA的含量。色譜柱：Thermal BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.6%磷酸二氫鉀（65∶35，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：205 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 方法學(xué)考察 用空白培養(yǎng)基分別制備濃度為1.2、0.6、0.3、0.15、0.1、0.05 mmol/L的TA和GA的混合溶液，其中TA和GA濃度相同。另稱取5 g三氯乙酸，加入50 mL水，制備成10%三氯乙酸溶液。分別取TA和GA的混合溶液0.1 mL，置于1.5 mL離心管中，加0.1 mL的培養(yǎng)基，再加入0.2 mL10%三氯乙酸溶液，12 000 r/min（離心半徑5 cm）離心2 min。取上清進(jìn)樣測(cè)定GA和TA的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法制備分別含GA和TA 0.05、0.15、0.6 mmol/L的質(zhì)控樣品，進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)5次，以質(zhì)控樣品中GA和TA峰面積與其直接溶于流動(dòng)相后測(cè)得的峰面積的比值計(jì)算GA和TA的回收率。每日測(cè)定質(zhì)控樣品5次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定5 d考察日間精密度。

2.2 苯酚紅的含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 將文獻(xiàn)[10]方法略作修改，以RTHPLC法測(cè)定苯酚紅的含量。色譜柱：Thermal BDS C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水-磷酸（55∶45∶0.2，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察 取500 mg苯酚紅溶于1 L水中制備成500 mg/L苯酚紅溶液。將500 mg/L苯酚紅溶液倍比稀釋成125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.91、1.95 mg/L的溶液，進(jìn)樣測(cè)定苯酚紅的峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按上述方法制備含苯酚紅1.95、7.80、31.25 mg/L的質(zhì)控溶液，進(jìn)樣分析，每個(gè)濃度重復(fù)5次，以質(zhì)控溶液中苯酚紅的峰面積與其直接溶于流動(dòng)相后測(cè)得的峰面積的比值計(jì)算苯酚紅的回收率。每日測(cè)定質(zhì)控溶液5次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定5 d考察日間精密度。

2.3 Caco-2細(xì)胞的培養(yǎng)

將Caco-2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃下培養(yǎng)，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。待細(xì)胞長(zhǎng)至滿壁后分裝于新的培養(yǎng)瓶傳代，直至培養(yǎng)足量的細(xì)胞用于試驗(yàn)所需為止。將多余細(xì)胞保存在凍存管中，于液氮罐中凍存，備用。

2.4 Caco-2細(xì)胞的鋪板

取出無(wú)菌Trans-well小室中24孔培養(yǎng)板的中間部位并做好標(biāo)記。取出長(zhǎng)勢(shì)良好的Caco-2細(xì)胞，消毒后棄原培養(yǎng)基，加適量消化液，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，待細(xì)胞輪廓清晰時(shí)棄去消化液，加適量新鮮培養(yǎng)液，吹打瓶壁，將細(xì)胞吹打至培養(yǎng)液中，混勻。每個(gè)小室加400 μL含細(xì)胞的培養(yǎng)液，其余孔加400 μL磷酸鹽緩沖液（PBS）作為空白對(duì)照，培養(yǎng)2 h。

2.5 Caco-2細(xì)胞緊密度的測(cè)定

取出“2.4”項(xiàng)下鋪板培養(yǎng)后的Caco-2細(xì)胞，消毒后加入4.5 mg/mL的苯酚紅溶液200 μL，置于已標(biāo)記的2個(gè)Transwell小室頂端（AP）側(cè)，小室基底端（BL）側(cè)加入100 μL空白培養(yǎng)液。2 h后，分別從小室的AP、BL側(cè)各取100 μL培養(yǎng)液，測(cè)定其中苯酚紅濃度。根據(jù)AP側(cè)和BL側(cè)苯酚紅濃度的比值，評(píng)價(jià)細(xì)胞緊密度。

2.6 分組和透過(guò)量的測(cè)定

試驗(yàn)分為GSP組、GA組、TA組、GSP+GA組和GSP+TA組。將GSP制備成2 mg/mL的溶液，GA、TA制成0.24 mmol/L的溶液，按分組將GSP溶液和GA、TA溶液加入Transwell小室AP側(cè)，使GSP最終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，GA、TA濃度均為0.12 mmol/L。分別于0、2、4、8 h后吸取BL側(cè)100 μL培養(yǎng)液于已標(biāo)記離心管中，同時(shí)補(bǔ)充等量空白培養(yǎng)液，測(cè)定培養(yǎng)液中GA、TA的含量。試驗(yàn)重復(fù)6次。

3 結(jié)果

3.1 GA、TA測(cè)定的方法學(xué)考察結(jié)果

以GA、TA濃度（c）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為GA：A＝631 408c+1 747.8（R2＝0.999 9），TA：A＝381 762c－1 278.5（R2＝0.999 9），線性范圍均為0.05～1.20 mmol/L。0.05、0.15、0.6 mmol/L濃度下GA的回收率分別為（98.2±4.2）%、（98.7± 2.5）%、（99.4±2.3）%（n＝3），日內(nèi)RSD分別為3.26%、2.53%、2.31%（n＝5），日間RSD分別為2.37%、2.06%、1.62%（n＝5）；TA的回收率分別為（98.6±3.6）%、（98.5±1.2）%、（99.9±1.4）%（n＝3），日內(nèi)RSD分別為3.65%、1.22%、1.40%（n＝5），日間RSD分別為1.97%、1.29%、1.12%（n＝5）。

3.2 苯酚紅測(cè)定的方法學(xué)考察結(jié)果

以苯酚紅質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)、峰面積（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為A＝20 280c+451.66（R2＝0.999 6），線性范圍為1.95～125 mg/L。苯酚紅在1.95、7.80、31.25 mg/L質(zhì)量濃度下回收率分別為（98.7± 2.2）%、（99.8±2.5）%、（100.1±1.7）%（n＝3），日內(nèi)RSD分別為2.23%、2.51%、1.69%（n＝5），日間RSD分別為1.17%、1.67%、2.29%（n＝5）。

3.3 Caco-2細(xì)胞緊密度

Caco-2細(xì)胞緊密度測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 Caco-2細(xì)胞緊密度測(cè)定結(jié)果Tab 1 Determination results of Caco-2 cell compactness

由表1可知，僅有約3%的苯酚紅能通過(guò)Caco-2細(xì)胞的間隙，說(shuō)明Caco-2細(xì)胞緊密度較高。

3.4 GA和TA的透過(guò)量

各組GA和TA的透過(guò)量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 各組GA和TA的透過(guò)量測(cè)定結(jié)果（s，n＝6）Tab 2 Determination results of transport volume of GAand TAin each group（s，n＝6）

表2 各組GA和TA的透過(guò)量測(cè)定結(jié)果（s，n＝6）Tab 2 Determination results of transport volume of GAand TAin each group（s，n＝6）

注：與GA組比較，＊P＜0.01；與TA組比較，#P＜0.01Note：vs.GAgroup，＊P＜0.01；vs.TAgroup，#P＜0.01

時(shí)間，GSP+TA組0 0.001 1±0.000 26#0.001 9±0.000 31#0.35±0.052#h0 2 4 8 GA，μmol GSP組TA，μmol GSP組0 0 0 0 GA組0 2.20±0.11 18.01±2.81 31.00±1.52 GSP+GA組0 0.15±0.01＊0.32±0.03＊1.90±0.36＊0 0 0 0 TA組0 3.61±0.49 16.00±2.40 47.01±5.81

由表2可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，GA和TA的透過(guò)量均有所增加，但是GSP+GA組細(xì)胞的GA透過(guò)量明顯低于GA組（P＜0.01），GSP+TA組細(xì)胞的TA透過(guò)量明顯低于TA組（P＜0.01）。

4 討論

本研究結(jié)果表明，GSP能顯著抑制GA和TA透過(guò)Caco-2細(xì)胞。其原因可能是GSP與膽汁酸鹽發(fā)生了吸附結(jié)合作用，造成膽汁酸鹽的理化性質(zhì)發(fā)生改變。膽汁酸鹽的細(xì)胞跨膜方式為自由擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)，其中以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)為主，而GSP與膽汁酸鹽的氫鍵吸附改變了膽汁酸鹽的空間位阻效應(yīng)，因此阻礙了其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，從而降低了膽汁酸鹽通過(guò)細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)能力[11]。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，GSP對(duì)TA透過(guò)Caco-2細(xì)胞的抑制作用強(qiáng)于GA，這可能是GSP羥基對(duì)TA的氫鍵作用強(qiáng)于GA所致。

本研究中GSP可能通過(guò)與GA和TA吸附結(jié)合，從而顯著抑制了膽汁酸鹽的小腸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，阻斷其腸道重吸收，促進(jìn)了膽汁酸鹽的排泄或降解。由此發(fā)現(xiàn)，一方面GSP可抑制腸道脂質(zhì)吸收，另一方面GSP又促進(jìn)了血液中膽固醇向膽汁酸鹽轉(zhuǎn)化，起到雙重降血脂作用。

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Effects of Grape Seed Proanthocyanidin on the Transport of Bile Salts in Colon Glandular Cell Caco-2

LAI Lihua1，GE Jian2（1.Dept.of TCM，Guangxingtang Traditional Chinese Medicine，Hangzhou Hospital of TCM，Hangzhou 310007，China；2.Dept.of Pharmacy，China Jiliang University，Hangzhou 310018，China）

OBJECTIVE：To study the effects of grape seed proanthocyanidin（GSP）on the transmembrane transport of sodium glycocholate（GA）and sodium taurocholate（TA）in colon glandular cell Caco-2.METHODS：Caco-2 model was used，and RP-HPLC was conducted to determine the contents of GA and TA in cell culture medium.The test was divided into GSP group，GA group，TA group，GSP+GA group and GSP+TA group，the transport volumes of transporting GA and TA from Transwell apical（AP）side to basolateral（BL）side by Caco-2 cell at 0，2，4，8 h were detected，respectively.RESULTS：The linear ranges of GA and TA were 0.05-1.2 mmol/L（R2＝0.999 9）.With the time passing，transport volumes of GA and TA in BL site in GA group and TA group were sharply increased；while the transport volumes were obviously decreased after adding GSP，with statistical significance（P＜0.01）.CONCLUSIONS：GSP has inhibitory effect on the transmembrane transport of GA and TA in Caco-2 cell.

Grape seed proanthocyanidin；Colon glandular cell caco-2；Sodium glycocholate；Sodium taurocholate；Transmembrane transportation

R361+.3；R932

A

1001-0408（2017）10-1323-03

2016-06-16

2016-08-28）

（編輯：鄒麗娟）

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.31100499）

＊中藥師。研究方向：中草藥活性。電話：0571-87881603。E-mail：xskathy@163.com

#通信作者：副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：天然藥物。電話：0571-86835702。E-mail：gejian16888@163.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.07