［KH－*D］武軍元，黃忠武，康強(qiáng)，姚禮文

(1．塔里木大學(xué)，新疆阿拉爾843300;2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300;3．新疆庫(kù)車縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆庫(kù)車842000;4．阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇843000;5．新疆阿瓦提縣畜禽改良站，新疆阿瓦提843200)

新疆油雞H9N2亞型禽流感病毒PB1基因的克隆與序列分析

［KH－*3D］武軍元1，2，黃忠武3，康強(qiáng)4，姚禮文5

(1．塔里木大學(xué)，新疆阿拉爾843300;2．新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆阿拉爾843300;3．新疆庫(kù)車縣動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，新疆庫(kù)車842000;4．阿克蘇地區(qū)動(dòng)物疫病控制診斷中心，新疆阿克蘇843000;5．新疆阿瓦提縣畜禽改良站，新疆阿瓦提843200)

為了闡明新疆油雞H9亞型流感病毒PB1基因的分子特征與進(jìn)化趨勢(shì)，本研究采用RT-PCR技術(shù)對(duì)新疆油雞分離株A/ Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014(H9N2)的PB1基因進(jìn)行了克隆、測(cè)序及分子進(jìn)化分析，將PB1基因的核苷酸序列和對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與Genbank中已經(jīng)公布的參考序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果表明，新疆油雞分離株的PB1基因由2274個(gè)堿基組成，編碼757個(gè)氨基酸，與AIV A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)的PB1基因處于同一分支，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次為99．2%和99．4%，新疆油雞分離株的PB1基因不屬于歐亞分支G1、A/CK/BJ/94和Y439的任何譜系。

流感病毒;油雞;聚合酶PB1基因;克隆;序列分析

A型流感病毒是威脅人類健康的重要病原體之一，根據(jù)其表面蛋白血凝素(Hemagglutinin，HA)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA)的不同，可以將其分為多種血清型。流感病毒的8個(gè)基因片段分別編碼11種不同的蛋白質(zhì)，RNA聚合酶是由流感病毒基因組3個(gè)最大的片段PB1、PB2和PA編碼的異源三聚體復(fù)合物，其中，PB1是病毒RNA聚合酶的催化亞基，負(fù)責(zé)病毒RNA的復(fù)制以及轉(zhuǎn)錄［1］。在流感病毒的重配中，PB1蛋白及病毒表面糖蛋白經(jīng)常發(fā)生重排，這種重排能通過(guò)提高流感病毒的適應(yīng)性而成為感染動(dòng)物乃至人類的優(yōu)勢(shì)毒株［2］。20世紀(jì)，導(dǎo)致人類4次流感大流行的病毒株中有2次是因PB1基因來(lái)自于禽類而形成重排病毒引起［3］，因此，禽源流感病毒PB1基因的進(jìn)化趨勢(shì)在流感病毒的分子流行病學(xué)研究中具有重要的作用。本研究對(duì)從新疆油雞當(dāng)中分離到的1株H9N2亞型禽流感病毒的PB1基因進(jìn)行了克隆測(cè)序及分子進(jìn)化分析，以了解新疆油雞H9N2亞型AIV PB1基因的遺傳進(jìn)化情況。

1 材料與方法

1．1 供試材料

1．1．1 病毒H9N2亞型禽流感病毒新疆油雞分離株A/Chicken/XinjiangBaicheng/1/2014(H9N2) (簡(jiǎn)稱Xj14)于新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存。

1．1．2 主要試劑及儀器設(shè)備High Pure Viral RNA Kit(Cat．No．11858882001)購(gòu)自Roche公司、PrimeScriptTMII First-strand cDNA Synthesis Kit(Cat．No:6210A)購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司、HiPure Gel Pure DNA Kits購(gòu)自Magen公司、pGEM-T Easy Vector購(gòu)自Promega公司、Trans 2K DNA Markers，Trans Taq-T DNA Polymerase購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司、TIANprep Mini Plasmid Kit購(gòu)自天根生化科技有限公司。梯度PCR儀、全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)、高速離心機(jī)為德國(guó)Eppendorf公司。

1．2 試驗(yàn)方法

1．2．1 引物設(shè)計(jì)參照已知的AIV序列設(shè)計(jì)了1條反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni 12，用于AIV各片段的反轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增，序列如下:Uni 12:5'-AGCAAAAGCAGG-3'。

參考NCBI公布的H9N2亞型AIV的PB1基因序列，利用Primer premier 5．0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)基因特異性引物，引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列如下:Bm-PB1-1:5'-TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA-3';Bm-PB1-2:5'-ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT-3'。

1．2．2 病毒RNA提取及PB1基因RT-PCR擴(kuò)增取200 μl尿囊液，按照Roche公司的High Pure Viral RNA Kit(Cat．No．11858882001)說(shuō)明書(shū)提取病毒RNA，用流感病毒反轉(zhuǎn)錄通用引物Uni-12，按照PrimeScriptTMII First-strand cDNA Synthesis Kit(Cat．No:6210A)說(shuō)明書(shū)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。用所設(shè)計(jì)的PB1的基因特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，采用50 μl的反應(yīng)體系，組成如下:10×PCR緩沖液5 μl，10 mM dNTPs 4 μl，Taq DNA聚合酶(5 U)0．5 μl，上下游引物各1 μl(10 μM)，cDNA模板1 μl，無(wú)RNA酶的水37．5 μl。反應(yīng)條件:95℃，5 min;隨后進(jìn)行如下35個(gè)循環(huán):95℃40 s，53℃40 s，72℃3．5 min;最后一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)72℃10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl反應(yīng)產(chǎn)物在1．2%瓊脂糖凝膠上電泳，在紫外燈下觀察結(jié)果。

1．2．3 PB1基因克隆與序列測(cè)定參照HiPure Gel Pure DNA Kits說(shuō)明書(shū)將RT-PCR產(chǎn)物純化回收，回收產(chǎn)物克隆到pGEM-T Easy Vector上，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，選擇PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送北京擎科武漢測(cè)序部進(jìn)行序列測(cè)定。

1．2．4 PB1基因進(jìn)化生物學(xué)分析應(yīng)用序列分析軟件DNAStar對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接處理，將所得序列與GenBank中公布的H9N2亞型流感病毒典型代表株(表1)的PB1基因序列進(jìn)行同源性比較，用MEGA6軟件的neighbour-joining方法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，分析其遺傳進(jìn)化關(guān)系。

表1 同源性分析的參考毒株Table 1Reference strains used in nucleotide sequence identity analysis

2 結(jié)果與分析

2．1 PB1基因的RT-PCR擴(kuò)增

利用設(shè)計(jì)針對(duì)PB1基因的特異性引物Bm-PB1-1/Bm-PB1-2進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1．2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示，分離株P(guān)B1基因在2300 bp左右有一條特異條帶，與預(yù)期大小一致(圖1)。

2．2 PB1基因的核苷酸及氨基酸序列同源性分析

測(cè)序結(jié)果表明，本研究擴(kuò)增的PB1基因開(kāi)放閱讀框由2274個(gè)堿基組成，編碼757個(gè)氨基酸，將擴(kuò)增的核酸序列提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GenBank登錄號(hào)KX602186。將本研究分離毒株與GenBank公布的其它毒株進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究分離毒株的核苷酸和氨基酸序列均與A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)具有較高的同源性，其核苷酸和氨基酸水平的同源性依次為99．2%和99．4(表2)。

圖1 PB1基因的RT-PCR擴(kuò)增Fig．1RT-PCR amplification of PB1 gene

表2 分離毒株與參考毒株P(guān)B1基因核苷酸和氨基酸同源性比較Table 2Homology of PB1 genes of isolated strain and reference strains(%)

2．3 PB1基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將本研究分離毒株與國(guó)內(nèi)流行毒株的PB1基因進(jìn)行多序列比對(duì)并繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(圖2)，分離毒株Xj14的PB1基因與國(guó)內(nèi)參考毒株A/ chicken/Henan/89/2013(H7N9)的親緣關(guān)系最近。

圖2 PB1基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig．2Phylogenetic tree based on PB1 gene

3 討論

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒(Avian influenza virus，AIV)引起的病毒性傳染病，血清亞型眾多，遺傳變異程度極其頻繁，中國(guó)1994年首次從廣東省的發(fā)病雞群中分離到H9N2亞型禽流感病毒［4－5］，1998年我國(guó)首先報(bào)道H9N2亞型AIV可以感染人［6］，1999年中國(guó)香港地區(qū)發(fā)生了人感染H9N2的病例［7］。進(jìn)一步研究表明，1997年中國(guó)香港地區(qū)感染人的H5N1病毒的內(nèi)部蛋白基因片段來(lái)源于H9N2亞型AIV［8］，2013年發(fā)生于中國(guó)上海等地的重配病毒H7N9其6個(gè)內(nèi)部基因均來(lái)自H9N2亞型AIV［9］，劉金華［10］等近期發(fā)表在PNAS的研究揭示單一基因型H9N2流感病毒在我國(guó)雞群中的優(yōu)勢(shì)流行為H7N9流感病毒的重排提供了充分條件。由此可見(jiàn)，H9N2流感病毒可以通過(guò)基因重組或重配產(chǎn)生新的對(duì)哺乳動(dòng)物甚至人類高致病力的病毒株，因此，加強(qiáng)對(duì)H9N2亞型AIV的檢測(cè)，密切關(guān)注其重配情況，進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)特性以及分子流行病學(xué)研究，對(duì)于預(yù)測(cè)和防控流感大流行的發(fā)生具有不可忽視的作用。

禽流感病毒依據(jù)HA和NA基因的分子進(jìn)化特征可以分為北美和歐亞兩大譜系，歐亞譜系又進(jìn)一步分為A/CK/BJ/94、G1/97和Y439/97 3個(gè)亞分支［11］，AIV的HA、NA、NP、M、PB1、PB2和PA進(jìn)化情況相似。本室前期的研究結(jié)果顯示新疆油雞分離株Xj14的HA和NA基因均屬于國(guó)內(nèi)穩(wěn)定存在的BJ/94亞分支，且從分子水平上證實(shí)Xj14為低致病力的毒株，只是HA在關(guān)鍵位點(diǎn)出現(xiàn)Q234L的突變，NA基因在3個(gè)紅細(xì)胞吸附區(qū)域發(fā)生多處突變，HA和NA基因的糖基化位點(diǎn)均有所增加，這種受體結(jié)合位點(diǎn)的改變和潛在糖基化位點(diǎn)的增加可能使之在進(jìn)化過(guò)程中獲得跨種傳播的能力［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，新疆油雞分離毒株Xj14的PB1基因與2013年家禽中分離的A/chicken/Henan/89/2013(H7N9)具有高度同源性，遺傳進(jìn)化處于同一分支，而與國(guó)內(nèi)流行的歐亞譜系分支A/CK/BJ/94、G1/97和Y439/97均不處在相同的分支，遺傳進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。以往認(rèn)為，H7亞型流感病毒只在禽類中流行，2013年2月底，我國(guó)東部省市地區(qū)首次陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了H7N9甲型禽流感病毒感染人的病例［13］，進(jìn)一步研究表明，H7N9亞型流感病毒能夠發(fā)生人與人之間的感染［14］。新疆油雞分離株Xj14是歐亞譜系以及來(lái)自歐亞譜系之外的不同病毒重排的新毒株，其內(nèi)部基因片段PB1與目前感染人的H7N9亞型流感病毒遺傳距離最接近，這一進(jìn)化趨勢(shì)很有可能是本研究分離毒株獲得致病性的主要原因。

綜上所述，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)邊疆新疆地區(qū)H9N2亞型AIV監(jiān)控的力度，慎防重排的H9N2亞型致病毒株感染人群。

［1］Li M L，Rao P，Krug R．The active sites of the influenza capdependent endonuclease are one different polymerase subunits［J］．EMBO J， 2001，20:2078－2086．

［2］Gíria M，de Andrade H．Genetic evolution of PB1 in the zoonotic transmission of influenza A(H1)virus［J］．Infect Genet Evol，2014，27:234－243．

［3］Kawaoka Y，Krauss S，Webster R G．Avian-to-human transmission of the PB1 gene of influenza A viruses in the 1957 and 1968 pandemics［J］．J Virol，1989，63:4603－4608．

［4］Wang J Y，Ren J J，Liu W H，et al．Complete genome sequence of a new H9N2 avian influenza virus isolated in China［J］．Genome Announc，2013，1(3):eoo261－13．

［5］陳伯倫，張澤紀(jì)，陳偉斌．禽流感研究I．雞A型禽流感病毒的分離與血清學(xué)初步鑒定［J］．中國(guó)獸醫(yī)雜志，1994(10):3－5．

［6］Guo Yuan-ji，Li Jian-guo，Cheng Xiao-wen．Discovery of humans infected by avian influenza A(H9N2)virus［J］．Chin J Exp Clin Virol，1999，15:105－108．

［7］Peiris M，Yuen K Y，Leung C W，et al．Human infection with influenza H9N2［J］．The Lancet，1999，354(9182):916－917．

［8］Liu J H，Okazaki K，Ozaki H，et al．H9N2 influenza viruses prevalent in poultry in China are phylogenetically distinct from A/quail/Hong Kong/G1/97 presumed to be the donor of the internal protein genes of the H5N1 Hong Kong/97 virus［J］．Avian Pathology，2003，32 (5):551－560．

［9］Gao R，Cao B，Hu Y，et al．Human influenza with a novel avian-origin influenza A(H7N9)virus［J］．N Engal J Med，2013，368(20):1888－1897．

［10］Pu J，Wang S，Yin Y，et al．Evolution of the H9N2 influenza genotype that facilitated the genesis of the novel H7N9 virus［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2015，112(2):548－553．

［11］Bi J，Deng G，Dong J，et al．Phylogenetic and molecular characterization of H9N2 influenza isolates from chickens in Northern China from 2007－2009［J］．PLoS One，2010，5(9):13063．

［12］武軍元，康強(qiáng)．新疆油雞H9N2亞型禽流感病毒分離株HA和NA基因的克隆及進(jìn)化生物信息分析［J］．中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，36(4):623－629．

［13］劉春艷，艾軍紅．甲型H7N9禽流感病毒的病毒學(xué)特征［J］．中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2013，15(6):405－408．

［14］Koopmans M，de Jong M D．Avian influenza A H7N9 in Zhejiang，China［J］．Lancet，2013，381(9881):1882－1883．

(責(zé)任編輯 陳虹)

Cloning and Sequence Analysis of PB1 Gene of H9N2 Subtype Avian Influenza Viruses Isolated from Xinjiang Soy Sauce Chicken

WU Jun-yuan1，2，HUANG Zhong-wu3，KANG Qiang4，YAO Li-wen5
(1．Tarim University，Alar，Xinjiang 843300，China;2．Key Laboratory of Tarim Animal Husbandry Science and Technology of Xinjiang Production＆Construction Corps，Xinjiang Alar 843300，China;3．Animal Centers for Disease Control and Prevention of Kuche County，Kuche，Xinjiang 842000，China;4．Animal Centers for Disease Control and Prevention of Aksu，Xinjiang Aksu 843000，China;5．Animal Hatchery of Awati County，Xinjiang Awati 843200，China)

In this study，the PB1 gene of H9N2 subtype avian influenza viruses isolated from Xinjiang soy sauce chicken was amplified by RT-PCR，and molecular characteristics were analyzed to reveal the evolutionary trend of PB1 genes．The homology of nucleotide sequences and putative amino acid sequences were compared with several reference strains．The result showed that the cDNA contains whole open reading frame of PB1 gene，2274 nucleotide，coding 757 amino acides．The PB1 gene isolated strain was on the same branch with A/chicken/ Henan/89/2013(H7N9)，the nucleotide and amino acids homologies of PB1 gene between isolated strain and A/chicken/Henan/89/2013 (H7N9)were 99．2%and 99．4%，and the isolated strain belong to none of the branch G1，A/CK/BJ/94 and Y439 of Eurasian lineage．

Influenza viruse;Soy sauce chicken;PB1 polymerase gene;Clone;Sequence analysis

S852．65

A

1001－4829(2017)1－0222－04

10．16213/j．cnki．scjas．2017．1．038

2016－07－27

國(guó)家自然科學(xué)基金(31160513)

武軍元(1980－)，男，副教授，博士，從事預(yù)防獸醫(yī)學(xué)教學(xué)與科研工作，*為通訊作者，E-mail:wjyn-w@126。