武苾菲，李萬(wàn)峰，徐海燕，張立峰，齊力旺，韓素英*

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091； 2.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

中間錦雞兒CiDR1的克隆及干旱脅迫下的表達(dá)分析

武苾菲1，李萬(wàn)峰2，徐海燕2，張立峰2，齊力旺2，韓素英1*

(1.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京 100091； 2.林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，國(guó)家林業(yè)局林木培育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091)

[目的]研究并了解中間錦雞兒CiDR1基因功能及其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)，為抗性育種提供候選基因。[方法]通過(guò)RACE技術(shù)從中間錦雞兒中克隆CiDR1基因的cDNA全長(zhǎng)，利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。再通過(guò)qRT-PCR技術(shù)對(duì)干旱脅迫后的幼苗中的CiDR1表達(dá)模式進(jìn)行研究。[結(jié)果]從中間錦雞兒中克隆到CiDR1基因的cDNA全長(zhǎng)共計(jì)4 297 bp，GenBank登錄號(hào)為KP277100。生物信息學(xué)分析表明，預(yù)測(cè)的CiDR1蛋白序列中含有1 243個(gè)氨基酸殘基，具有抗病基因特征結(jié)構(gòu)域TIR、NB-ARC、LRR等，其等電點(diǎn)為6.35，不穩(wěn)定指數(shù)為42.91，不具備信號(hào)肽，為非分泌蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中。定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，CiDR1基因在幼年期的莖中表達(dá)量較低，在成年期的葉片中表達(dá)量較高；在干旱脅迫處理后的幼苗中，CiDR1表達(dá)水平有明顯下降，表明該基因的表達(dá)受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應(yīng)干旱相關(guān)。[結(jié)論]中間錦雞兒在干旱脅迫后其根、莖和葉中CiDR1的表達(dá)均明顯下降，表明CiDR1的表達(dá)受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應(yīng)干旱相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CiDR1在根、莖、葉中的表達(dá)水平可能受發(fā)育階段調(diào)控。

中間錦雞兒；CiDR1； TIR-NBS-LRR；干旱

中間錦雞兒(CaraganaintermediaKuang et H.C.Fu)，俗稱檸條，為豆科、錦雞兒屬旱生落葉灌木，分布在我國(guó)西部荒漠草原、干旱草原地區(qū)，是這些地區(qū)的建群植物種[1]。中間錦雞兒耐寒、耐熱、抗干旱、耐貧瘠，對(duì)沙地環(huán)境有很強(qiáng)的適應(yīng)能力，可防風(fēng)固沙、保持水土、改善局部小環(huán)境[2]。近年來(lái)，對(duì)中間錦雞兒的研究日益增多，特別是對(duì)其干旱適應(yīng)性方面。

目前，對(duì)中間錦雞兒干旱適應(yīng)性的研究大致可分為生理機(jī)制研究和分子機(jī)制研究?jī)深?。生理研究發(fā)現(xiàn)，檸條氣孔開(kāi)度較小，全天開(kāi)啟進(jìn)行不間斷的蒸騰，這與一般植物中氣孔白天開(kāi)、晚間閉有明顯的差異[3]；當(dāng)土壤、葉片間的水分關(guān)系緊張系數(shù)低于1.0以后，檸條蒸騰速率會(huì)自動(dòng)調(diào)低，以避免大量失水[4]，另有文章進(jìn)一步證實(shí)檸條的抗旱性與蒸騰速率、小葉水勢(shì)和葉含水率呈負(fù)相關(guān)[5]；在受到干旱脅迫時(shí)，檸條胞間二氧化碳體積分?jǐn)?shù)先輕微下降，而后上升，這與凈光合速率的變化趨勢(shì)相反[6]；在不同CO2濃度下，干旱脅迫均會(huì)造成檸條生物量的減少，且根、莖、葉中生物量下降的程度不同[7-8]。分子機(jī)制方面，檸條錦雞兒水分脅迫下葉片均一化全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)及葉片抑制性差減雜交文庫(kù)已被構(gòu)建[9-10]，且已經(jīng)篩選出適合干旱脅迫下進(jìn)行基因表達(dá)分析的內(nèi)參基因[11]。綜上，目前對(duì)檸條抗旱性的研究大多集中在生理方面，而對(duì)分子方面的研究相對(duì)較少。為探究中間錦雞兒適應(yīng)干旱的分子機(jī)理及進(jìn)行抗性育種，尋找中間錦雞兒抗旱相關(guān)基因并對(duì)其功能進(jìn)行解析顯得十分必要。

大豆miR2118被證實(shí)與干旱脅迫顯著相關(guān)，推測(cè)miR2118通過(guò)對(duì)其靶基因TG01的調(diào)控參與到大豆的干旱脅迫響應(yīng)[12]。通過(guò)分析中間錦雞兒小RNA測(cè)序數(shù)據(jù)，我們獲得了中間錦雞兒miR2118全長(zhǎng)[13]，并預(yù)測(cè)了其靶基因cDNA序列片段。為了明確中間錦雞兒miR2118靶基因是否參與干旱脅迫響應(yīng)，我們克隆了其靶基因CiDR1的cDNA全長(zhǎng)序列，并分析了它在中間錦雞兒遭受干旱脅迫時(shí)的表達(dá)模式。本研究為了解中間錦雞兒CiDR1基因表達(dá)與耐旱性的關(guān)系提供了借鑒，并為進(jìn)一步進(jìn)行中間錦雞兒抗性育種提供了候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料

中間錦雞兒種子于2013年7月中旬采集自中國(guó)林科院玉泉苗圃，用無(wú)菌水反復(fù)清洗后種植于含有蛭石、珍珠巖的營(yíng)養(yǎng)土中于人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(晝溫28℃，夜溫25℃，相對(duì)濕度60%)。生長(zhǎng)3周后，將幼苗從土壤中取出，清水洗凈后分根、莖、葉，分別保存于液氮中，用于基因克隆和幼年期基因表達(dá)分析。

從中國(guó)林科院玉泉苗圃5年生中間錦雞兒植株上取根、莖、葉、花和種子，分別于液氮中保存，用于成年期營(yíng)養(yǎng)器官和生殖器官中基因表達(dá)分析。

中間錦雞兒種子在人工培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3周后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，用無(wú)菌水清洗干凈后轉(zhuǎn)入1/2 Hoagland ’s 營(yíng)養(yǎng)液中培養(yǎng)5天，期間每天更換培養(yǎng)液，以保證氧氣充足。5天后將小苗取出，進(jìn)行干旱脅迫處理。具體處理辦法[12]：將小苗用清水洗凈后，先用濾紙將表面殘余水分吸干，而后用雙層滅菌濾紙包裹根部放入干凈錐形瓶中，于室溫下放置。放置0、2、4、8、12、24、48 h后，分根、莖、葉取材，保存于液氮中，用于干旱脅迫下基因的表達(dá)分析。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 將中間錦雞兒根、莖、葉混合樣于液氮中磨碎后，稱取材料100 mg，按照TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant Kit說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA的提取。樣品總RNA的濃度和純度用ND-1000分光光度計(jì)(Nanodrop Technologies，USA)進(jìn)行檢測(cè)；RNA的完整性用1.5%的凝膠電泳檢測(cè)。cDNA第一鏈的合成采用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，#K1621)進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物用于目的基因全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增和基因表達(dá)分析。用于Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE)的cDNA采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(clontech，USA)進(jìn)行合成。

1.2.2 Rapid Amplification of cDNA Ends(RACE) 將已有中間錦雞兒序列片段經(jīng)PCR檢測(cè)，確認(rèn)真實(shí)表達(dá)后，用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，使用Advantage2 PCR Kit(Clontech，USA)進(jìn)行RACE擴(kuò)增。特異引物5’-GTCCCCGTTAACCTCCGCACATCAA-3’ 和5’-GGCAAAACAGATCGACCCTTGTCCT-3’分別為5’RACE的第一輪引物和第二輪引物。第一輪反應(yīng)條件為94℃ 2 min預(yù)變性，循環(huán)1次；之后94℃ 30 s變性，65℃ 30 s退火；72℃ 2 min延伸，循環(huán)30次。第二輪反應(yīng)程序不變，退火溫度改為61℃。特異引物5’-GGATTCATGGAGTTGGTGGGA-3’和5’-TGGGTTGCCATATCTCCAAA-3’分別為3’ RACE的第一輪引物和第二輪引物。第一輪反應(yīng)條件為94℃ 2 min預(yù)變性，循環(huán)1次；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 3 min，循環(huán)30次。第二輪反應(yīng)程序不變，退火溫度改為66℃。電泳檢測(cè)后，將擴(kuò)增到的目的產(chǎn)物回收、連入pEASY-T1載體中送公司測(cè)序。

將3’RACE和5’RACE測(cè)序獲得的片段與中間片段拼接后，設(shè)計(jì)引物5’-TTCATCCTTTTGCTTACAAGAAC-3’和5’-GACATGGACTCCGATTATCTCACA-3’，擴(kuò)增cDNA全長(zhǎng)進(jìn)行驗(yàn)證。反應(yīng)使用超保真DNA聚合酶(NEW ENGLAND Biolabs)進(jìn)行，擴(kuò)增條件為98℃初始變性30 s，98℃變性8 s，59℃復(fù)性20 s，72℃延伸30 s，循環(huán)35次；最后72℃終延伸8 min。電泳檢測(cè)后，將擴(kuò)增到的目的產(chǎn)物回收、連入pEASY-Blunt載體中送公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 使用ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析CiDR1基因開(kāi)放閱讀框，并用Pfam(http://pfam.xfam.org/)對(duì)預(yù)測(cè)到的CiDR1蛋白序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析。編碼蛋白的理化性質(zhì)和親疏水性分別采用Protparam和ProtScale(http://web.expasy.org)程序進(jìn)行分析，跨膜結(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽的查找及亞細(xì)胞定位分別使用TMHMM2.0、SignalP 4.1和TargetP 1.1(http://www.cbs.dtu.dk/services)進(jìn)行，使用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)及同源性分析，最后采用CLUSTAL X和Mega5.05軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建。

1.2.4CiDR1基因的表達(dá)分析 中間錦雞兒CiDR1基因在生長(zhǎng)發(fā)育各個(gè)時(shí)期、不同器官內(nèi)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)及干旱脅迫下的表達(dá)均以UNK2[11]為內(nèi)參基因，采用SYBR Green熒光染料法，在BioRad CFX96TM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行。定量PCR引物為5’-GAACGGGGATGGATATGAGC-3’和5’-CCAACTCCATGAATCCCTACCA-3’。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制反應(yīng)體系，每個(gè)反應(yīng)做三次重復(fù)；反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，59.5℃退火34 s，循環(huán)40次，之后95℃ 5 s，60℃ 30 s，反應(yīng)結(jié)束后做溶解曲線分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用BioRad實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)軟件和Excel 2010進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中間錦雞兒CiDR1基因全長(zhǎng)cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

通過(guò)3’ RACE和5’RACE巢式擴(kuò)增，分別獲得3 383 bp和463 bp的序列片段，與中間片段拼接之后，得到了CiDR1基因的全長(zhǎng)cDNA序列共計(jì)4 297 bp，全長(zhǎng)引物驗(yàn)證結(jié)果如下(圖1)。將CiDR1基因的cDNA序列提交至GenBank，登錄號(hào)為KP277100。分析表明，CiDR1基因的cDNA序列包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，為3 732 bp，共編碼1 243個(gè)氨基酸殘基。經(jīng)psRNATarget(http://plantgrn.noble.org/psRNATarget/)分析，這段序列中含有miR2118的結(jié)合位點(diǎn)(圖2)，表明CiDR1可能是miR2118的靶基因。

M：DNA標(biāo)記 M：DNA marker圖1 CiDR1基因cDNA全長(zhǎng)克隆電泳結(jié)果Fig.1 PCR product of CiDR1 cDNA sequence

圖2 CiDR1基因中miR2118靶位點(diǎn)示意圖
Fig.2 The alignment of miR2118 and CiDR1 transcript sequences

ExPASy ProtParam分析表明，CiDR1蛋白的分子量約為141 069.6 Da，等電點(diǎn)為6.35；氨基酸組成中亮氨酸所占比例最高，達(dá)到14.1%，其余氨基酸含量均在10% 以下；CiDR1蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為42.91。ProtScale軟件的分析結(jié)果表明CiDR1蛋白平均親水性為-0.126，該蛋白既有親水區(qū)又有疏水區(qū)，且親水性較強(qiáng)而疏水性較弱?？缒ゎA(yù)測(cè)顯示CiDR1無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。經(jīng)SignalP4.1的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法預(yù)測(cè)CiDR1蛋白的信號(hào)肽，發(fā)現(xiàn)其信號(hào)肽分值為0.098，遠(yuǎn)低于0.5據(jù)此可以推測(cè)該蛋白不具備信號(hào)肽，可能為非分泌蛋白。亞細(xì)胞定位分析表明，該蛋白極有可能定位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2 不同植物中DR1同源基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析

Pfam結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，CiDR1蛋白具有TIR-NBS-LRR家族共有的TIR、NB-ARC、LRR等幾個(gè)保守結(jié)構(gòu)域[14-15]，據(jù)此可進(jìn)一步確認(rèn)CiDR1為NBS型抗病基因。保守結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)，其與GenBank中已登錄的植物TIR-NBS-LRR類抗病基因具有一定同源性(圖3)。利用保守結(jié)構(gòu)域在NCBI中BLAST其他植物中已知的TIR-NBS類抗病基因，剔除親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的物種后，最終選定14種植物，包括苜蓿(MedicagotruncatulaGaertn.)、大豆(Glycinemax(L.) Merr.)、蕓豆(PhaseolusvulgarisL.)、鷹嘴豆(CicerarietinumL.)、山荊子(Malusbaccata(L.) Borkh.)、黃瓜(CucumissativusL.)、擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)等進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

(a)TIR 結(jié)構(gòu)域;(b)NBS結(jié)構(gòu)域(a) TIR domain; (b) NBS domain圖3 CiDR1基因保守結(jié)構(gòu)域與其他已知物種抗病基因保守結(jié)構(gòu)域的比較Fig.3 Comparison of conserved domain of CiDR1 in C. intermedia with other species

采用CLUSTAL X進(jìn)行多序列比對(duì)，將比對(duì)結(jié)果在Mega5.05軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。分析結(jié)果表明，中間錦雞兒和苜蓿、鷹嘴豆親緣關(guān)系最近，其次是大豆和蕓豆(圖4)，這五個(gè)物種同屬于豆科蝶形花亞科，該結(jié)果與植物形態(tài)學(xué)分類結(jié)果相一致。與豆科植物在同一分支上的是黃瓜、可可(TheobromacacaoL.)和山荊子，說(shuō)明它們中的DR1基因相似性較高。而在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中距離中間錦雞兒CiDR1基因最遠(yuǎn)的是山白松(PinusmonticolaDouglas ex D. Don)、火炬松(PinustaedaL.)和毛果楊(PopulusrihocarpaTorr. & A.Gray ex. Hook.)，它們從起源處就處于不同分支，尤其是火炬松，其DR1基因與CiDR1基因相似性只有19.3%。

注：Medicago truncatula苜蓿(XM_003620157)；Cicer arietinum鷹嘴豆(XM_004512741)；Glycine max大豆(XM_006603803)；Phaseolus vulgaris菜豆(XM_007151169)；Cucumis sativus黃瓜(HM124891)；Theobroma cacao可可(XM_007044371)；Malus baccata山荊子(AY363617)；Arabidopsis thaliana擬南芥(AY522496)；Malus x domestica蘋(píng)果(KC693054)；Helianthus annuus向日葵(GU085221)；Populus trichocarpa毛果楊(DQ513250)；Pinus monticola山白松(HQ840715)；Pinus taeda火炬松(AY091566)圖4 CiDR1蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.4 Phylogenetic tree of the amino acid sequence of CiDR1 protein

2.3CiDR1基因在不同發(fā)育時(shí)期及干旱脅迫下的表達(dá)分析

定量PCR分析表明，CiDR1基因在中間錦雞兒幼年期及成年期的各個(gè)器官中均有表達(dá)，且在每個(gè)器官中，幼年期的表達(dá)量都低于成年期(圖5)；無(wú)論是在幼年期還是在成年期，莖中的表達(dá)量相對(duì)較低，葉中的表達(dá)量相對(duì)較高(圖5)。干旱脅迫后，CiDR1表達(dá)量迅速下降，到第8小時(shí)左右表達(dá)量有小幅回升，到第12小時(shí)表達(dá)量又下降到比之前更低的水平；且在中間錦雞兒根、莖和葉中，CiDR1基因響應(yīng)干旱脅迫時(shí)的表達(dá)變化呈現(xiàn)相似的模式(圖6 (a)，(b)，(c))。

R：根；S：莖；L：葉；F：花；SE：種子R:Root; S:Stem; L:Leaf; F:Flower; SE:Seed圖5 CiDR1基因在不同器官中的表達(dá)分析Fig.5 The relative expression of CiDR1 gene in different tissues

圖6 CiDR1基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析
Fig.6 The relative expression of CiDR1 gene under drought stress

3 討論

干旱嚴(yán)重影響到植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，有報(bào)道稱干旱對(duì)作物造成的損失在所有非生物脅迫中占首位[16-17]。為最大限度地減輕干旱脅迫造成的傷害，植物中表達(dá)了一系列干旱適應(yīng)相關(guān)基因，目前已克隆的干旱脅迫相關(guān)基因大致可分為兩類[18-21]：一類基因編碼的蛋白質(zhì)在信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)中起調(diào)節(jié)作用，為調(diào)控基因，包括：轉(zhuǎn)錄因子，如DREB[22-23]等；蛋白激酶，如MAP激酶等[24]和其他一些信號(hào)分子如鈣結(jié)合蛋白CDPK[25]等。另一類基因編碼的蛋白質(zhì)對(duì)干旱脅迫中的植物起直接的保護(hù)作用，為功能基因。這類基因包括脫水響應(yīng)基因RD29A，RD29B等[26]；水通道蛋白MIP等[27]；滲透蛋白LEA蛋白等[28]及COR、KIN、LTI等晚期響應(yīng)基因[29-30]。這些基因在植物遭受干旱脅迫時(shí)，其表達(dá)被快速誘導(dǎo)或抑制，以保障植物的生存。本研究發(fā)現(xiàn)，中間錦雞兒在干旱脅迫后僅2 h，其根、莖和葉中CiDR1的表達(dá)均明顯下降，表明CiDR1的表達(dá)受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應(yīng)干旱相關(guān)。值得關(guān)注的是，幼年期植物根、莖、葉中CiDR1的表達(dá)水平均低于成年期植物對(duì)應(yīng)器官中的表達(dá)，表明CiDR1的轉(zhuǎn)錄受發(fā)育階段調(diào)控。

CiDR1基因編碼的產(chǎn)物為T(mén)IR-NBS-LRR類抗病相關(guān)蛋白。該蛋白的NBS結(jié)構(gòu)域包含一些非常保守的基序，如p-loop(GGVGKTT)、Kinase-2a(VLDD)、Kinase-3a(GSRII)及跨膜區(qū)GLPL[31]，因此常被用于植物抗病基因的識(shí)別和分類[32]。由生物信息學(xué)分析可以初步認(rèn)定，CiDR1基因的編碼產(chǎn)物結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，為親水蛋白，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)且屬于非分泌蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)中。編碼氨基酸序列多重比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，CiDR1與其他植物有很高的同源性，特別是豆科植物苜蓿、鷹嘴豆、大豆等，相似性均達(dá)到60%以上，表明CiDR1可能與豆科植物苜蓿、大豆等有同一起源。有報(bào)道稱大豆NBS抗病基因TG01受到干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)[12]，這更加為我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了佐證。

植物抗旱基因的發(fā)掘及抗旱機(jī)制的研究一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。中間錦雞兒對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)涉及到體內(nèi)各類物質(zhì)代謝、能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和物質(zhì)運(yùn)輸?shù)榷鄠€(gè)方面[10]。本研究對(duì)CiDR1基因進(jìn)行了初步研究，下一步對(duì)其功能的深入分析將有利于我們解析中間錦雞兒干旱適應(yīng)性的分子機(jī)理。

4 結(jié)論

本研究中，中間錦雞兒在干旱脅迫后其根、莖和葉中CiDR1的表達(dá)均明顯下降，表明CiDR1的表達(dá)受干旱抑制，可能與中間錦雞兒適應(yīng)干旱相關(guān)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CiDR1在根、莖、葉中的表達(dá)水平可能受發(fā)育階段調(diào)控。相關(guān)研究為中間錦雞兒抗旱基因工程和遺傳改良提供了參考，并為進(jìn)一步揭示其抗旱分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：張 研)

Cloning ofCiDR1 fromCaraganaintermediaand Its Expression under Drought Stress

WUBi-fei1，LIWan-feng2，XUHai-yan2，ZHANGLi-feng2，QILi-wang2，HANSu-ying1

(1.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forest Ecology, Environment and Protection, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091, China; 2.State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Beijing 100091, China)

[Objective]To study the function ofCiDR1 gene inCaraganaintermediaand its response to drought stress.[Method]The full-length cDNA sequence of CiDR1 gene was cloned using RACE methods, and then the bioinformatics analysis were carried out to predict gene structure. Finally,CiDR1 expression patterns under drought stress was investigated by qRT-PCR. [Result]The full-length cDNA sequence ofCiDR1 gene was 4 297 bp. The deduced amino-acid sequence forCiDR1 was 1 243 amino acids long and contained toll/interluekin receptor (TIR), nucleotide binding site (NBS) and leucine-rich repeats (LRR) motif, which are the characteristics of plant resistance genes. The theoretical isoelectric point and instability index ofCiDR1 protein was 6.35 and 42.91, respectively. Further analysis showed thatCiDR1 protein had no signal peptide, was a non-secretary protein and located in the cytoplasmic matrix. The qPCR analysis showed that theCiDR1 transcripts were expressed strongly in adult leaves and weakly in juvenile stems, and after drought treatments the levels ofCiDR1 transcripts decreased. [Conclusion]The results indicate thatCiDR1 might play an role in response ofC.intermediatodrought and could be used for molecular breeding.

Caraganaintermedia;CiDR1; TIR-NBS-LRR; drought

2014-12-30

2016-12-22 基金項(xiàng)目： 國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863)項(xiàng)目(2013AA102704)、國(guó)家自然科學(xué)基金(31330017)。 作者簡(jiǎn)介： 武苾菲，女，碩士研究生。主要研究方向：林木遺傳育種。電話：18810750915，E-mail：wufaye_1229@163.com * 通訊作者：韓素英，教授，碩士生導(dǎo)師。主要研究方向：樹(shù)木生物技術(shù)。E-mail：syhan@caf.ac.cn

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.02.008

S718.46

A

1001-1498(2017)02-0238-07