劉敬怡 盧 晶 楊金奎*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730)

·內(nèi)分泌與代謝病專題 ·

KCN基因?qū)π∈笾x的影響及其機(jī)制初探

劉敬怡1,2盧 晶1,2楊金奎1,2*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科,北京 100730; 2.糖尿病防治研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730)

目的 研究鉀離子電壓門控通道(potassium voltage-gated channel,KCN)基因?qū)π∈笾x的影響及其相關(guān)信號(hào)通路，為治療糖尿病的脂肪異常提供新的治療靶點(diǎn)。方法 采用KCN基因敲除的小鼠模型及對(duì)照C57BL/6野生小鼠動(dòng)物模型，檢測(cè)三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇等脂代謝相關(guān)指標(biāo)。HE染色觀察小鼠肝臟組織脂肪變。Western blotting法測(cè)定小鼠肝臟組織腺苷酸激活蛋白激酶[adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK]通路相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果KCN基因敲除小鼠較野生型對(duì)照小鼠血清中三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇濃度均明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)高密度脂蛋白明顯降低，肝臟HE染色顯示基因敲除小鼠肝臟內(nèi)脂滴的數(shù)目和體積均與野生型有明顯差異，Western blotting結(jié)果顯示KCN基因敲除小鼠肝臟組織中磷酸化蛋白激酶B(phosphate-protein kinase B，Phos-AKT)、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶(phosphate-acetyl CoA carboxylase，Phos-ACC)、phos-AMPK濃度均較正常對(duì)照組小鼠表達(dá)量降低，phos-ACCα水平較正常對(duì)照組小鼠明顯增高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論KCN基因?qū)π∈笱x有保護(hù)作用，其作用機(jī)制與AMPK的脂肪酸氧化有關(guān)。

鉀離子電壓門控通道(potassium voltage-gated channel,KCN)；脂代謝；AMPK通絡(luò)

鉀離子電壓門控通道(potassium voltage-gated channel,KCN),是電壓依賴性鉀通道(voltage-dependent potassium channel, Kv) 家族中的一員[1]。在人的心臟、腦和胰腺組織中有表達(dá)[2]。本課題組[3]前期研究表明，KCN通道基因在維持胰島β細(xì)胞的形態(tài)及功能方面具有重要作用，在C57BL/6小鼠上將KCN基因敲除后，小鼠會(huì)出現(xiàn)血糖增高、胰島素抵抗等糖代謝紊亂現(xiàn)象。

蛋白激酶B(protein kinase B,AKT/PKB)-腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)-乙酰輔酶A羧化酶(acetyl CoA carboxylase，ACC)信號(hào)通路為人和動(dòng)物體內(nèi)控制脂肪酸氧化的重要途徑[4]。本課題組[3]前期已經(jīng)構(gòu)建KCN基因敲除小鼠動(dòng)物模型。本研究觀察到KCN基因敲除糖尿病小鼠在14月齡時(shí)出現(xiàn)血糖和脂肪代謝異常，進(jìn)一步探討其機(jī)制發(fā)現(xiàn)，KCN基因敲除小鼠體內(nèi)AMPK及其上游的AKT/PKB被抑制并促進(jìn)其下游的ACCa磷酸化使其活性增高，脂肪酸氧化受到抑制，最終導(dǎo)致血脂代謝異常。本研究將有助于了解KCN基因在糖尿病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及其相關(guān)機(jī)制，KCN基因有望成為糖尿病血脂病變藥物作用的新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

14月齡雄性SPF級(jí)C57BL/6野生型小鼠及KCN+/-、KCN-/-小鼠(C57BL/6 background)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：11400700146921，所有動(dòng)物均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理法案。所有的小鼠均置于SPF環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫22 ℃～23 ℃，每天光照12 h，動(dòng)物可自由攝食攝水。

1.2 主要試劑

血清三酰甘油(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、高密度脂蛋白膽固醇(highdensity lipoprotein-cholesterol, HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(lowdensity lipoprotein-cholesterol, LDL-C) 試劑盒(中生北控科技股份有限公司)，抗APMK抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、抗Phos-AMPK抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、抗ACCa抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、抗Phos-ACCa抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、抗AKT抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、抗Phos-AKT抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)、β-actin(美國(guó)Cell Signaling公司)，酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1) 動(dòng)物分組：14個(gè)月齡雄性C57BL/6小鼠(A組)、同月齡KCN+/-小鼠(B組)及同月齡KCN-/-小鼠(C組)，每組10只，普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后稱量體質(zhì)量并進(jìn)行腹腔糖耐量試驗(yàn)。

2)小鼠腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)：將3組小鼠過(guò)夜禁食14 h(但不禁水)，采用1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))戊巴比妥鈉，45 mg/kg用量麻醉小鼠，尾靜脈取空腹血糖(0 min)后腹腔注射葡萄糖2 g/kg [20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖注射液]，在注射葡萄糖后15、30、60及120 min時(shí)尾靜脈取血測(cè)血糖，血糖測(cè)定用強(qiáng)生公司One-Touch 血糖儀及配套試紙。

3)標(biāo)本采集：腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)5～7 d后處死動(dòng)物。處死前禁食過(guò)夜12 h，內(nèi)眥取血，4 ℃ 4 000 r/min離心10 min，取上清后分裝-80 ℃保存，待測(cè)血清中三酰甘油、總膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇。麻醉后測(cè)量其體質(zhì)量，體長(zhǎng)(鼻尖至肛門外沿的距離)。計(jì)算Lee’s指數(shù)，Lee’s指數(shù)=體質(zhì)量(g)1/3/體長(zhǎng)(cm)×1 000。斷頸處死后，取睪周脂肪、肝臟、骨骼肌及胰腺組織，迅速稱質(zhì)量。并留取組織置入10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液保存，用于制備石蠟切片。

4)血脂測(cè)定：采用Bio-Rad酶標(biāo)儀測(cè)定濃度血漿三酰甘油、膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇及低密度脂蛋白膽固醇濃度。

5)肝臟組織HE染色：將肝臟組織常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片，烤片，72 ℃，100 min。石蠟切片脫蠟至水，自來(lái)水沖洗5 min，洗去乙醇，蘇木精侵染3 min，自來(lái)水沖洗1 min，鹽酸分化液2 s，自來(lái)水沖返藍(lán)5 min。伊紅侵染30 s，自來(lái)水沖30 s，80%(體積分?jǐn)?shù))乙醇30 s，95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇各3 min。二甲苯透明1～2 h，中性樹膠封片后顯微鏡下拍照。

6)Western blotting法提取小鼠肝臟組織總蛋白:BCA蛋白分析試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取80 μg總蛋白進(jìn)行10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)(200 mA，120 min)至硝酸纖維膜上。用TBST(TBS+0.1%Tween-20)配制的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，用封閉液將一抗按照一定比例稀釋(抗APMK抗體 1∶200、抗Phos-AMPK抗體 1∶200、抗ACCa抗體1∶200、抗Phos-ACC抗體1∶200、抗AKT抗體 1∶1 000、抗Phos-AKT抗體1∶1 000)，將膜與一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日TBST洗膜3次，每次5 min，再與辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記的二抗(1∶2 000)室溫孵育1 h。同時(shí)以β-actin作為內(nèi)參，抗體稀釋比例為1∶1 000。TBST洗滌，滴加增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence, ECL)發(fā)光液后用Chemi-Doc Touch凝膠成像系統(tǒng)顯影成像，并用 Image J軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。分別計(jì)算出AMPK、phos-AMPK、phos-ACC、ACC和phos-AKT、AKT與內(nèi)參β-actin的吸光度積分值之比作為AMPK、phos-AMPK、ACC、phos-ACC、AKT和phos-AKT的相對(duì)含量值。

解決上述2個(gè)問(wèn)題的辦法：①在焚燒爐超負(fù)荷運(yùn)行時(shí)，如增加垃圾處理量、增加爐膛熱負(fù)荷，可適當(dāng)回噴濃縮液，起到降低焚燒爐出口煙溫的作用。②協(xié)同處理沼氣回噴、污泥入爐。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1KCN基因敲除小鼠與C57BL/6野生型小鼠的一般特征比較

小鼠體質(zhì)量和身長(zhǎng)及一般情況的觀察C組小鼠體質(zhì)量較A組有顯著增長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，B組較A組有增長(zhǎng)趨勢(shì)。B、C 2組的體長(zhǎng)及Lee’s指數(shù)較A組有增高的趨勢(shì)(圖1)。

2.2KCN基因敲除小鼠腹腔葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)(introperitoneal glucose tolerance test, IPGTT)異常

腹腔注射葡萄糖后15 min B、C 2組的血糖濃度明顯高于A組(F=52.89,P<0.05;F=2 173.89,P<0.01)、30 min B、C 2組的血糖水平明顯高于A組(F=128.2,P<0.05;F=221.1,P<0.05,)、60 min及120 minB、C 2組的血糖水平較A組有增高的趨勢(shì)。(P<0.05，圖2)。

圖1 小鼠體質(zhì)量、體長(zhǎng)及Lee’s指數(shù)的比較

A:C57BL/6 group； B:KCN+/-group； C:KCN-/-group;*P<0.05vsgroup A;n=6;KCN: potassium voltage-gated channel.

圖2 小鼠腹腔糖耐量的比較

A:C57BL/6 group； B:KCN+/-group； C:KCN-/-group; At 15 minutes，the blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A (*P<0.05),n=6; The blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A (**P<0.01). At 30 minutes:the blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A (*P<0.05). The blood glucose level in group B was significantly higher than that in group A.IPGTT:introperitoneal glucose tolerance test;KCN：potassium voltage-gated channel.

B、C 2組的TG和LDL-C較A組明顯增高(P<0.05)，而TC較A組有升高趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05, 圖3)。B、C組的HDL-C較A組明顯降低。

2.4 HE染色結(jié)果

KCN基因敲除小鼠肝臟有明顯的脂肪堆積，對(duì)照組A組小鼠肝臟色暗紅、質(zhì)地柔軟， B組、C組肝臟顏色灰黃，體積變大，表面有白色顆粒狀物。B、C兩組肝臟有明顯的肝臟脂肪變性，氣球樣變?cè)龆?，有較多壞死灶，肝小葉內(nèi)明顯的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖4)。

2.5 Western blotting檢測(cè)結(jié)果

AKT-AMPK-ACCa脂代謝通路激活,KCN基因敲除小鼠B、C兩組肝臟組織中phos-AKT，phos-ACCα，phos-AMPK水平均較正常對(duì)照組A組小鼠表達(dá)量降低(P<0.05，圖5)，ACCα水平較A組明顯增高KCN基因敲除小鼠的AMPK通路受到抑制(P<0.05，圖5)。

圖3 小鼠血脂比較

A:C57BL/6 group; B:KCN+/-group； C:KCN-/-group;KCN：potassium voltage-gated channel； TG: triglyceride; TC: total cholesterol; LDL-C: low density lipoprotein cholesterol; HDL-C: high density lipoprotein cholesterol；*P<0.05，**P<0.01vsgroup A，n=10.

圖4 小鼠肝臟組織

3 討論

隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展及人們生活方式的改變，糖尿病已經(jīng)成為威脅我國(guó)人民健康的主要疾病，糖尿病主要表現(xiàn)為胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙[5]。糖尿病病人大多伴有肥胖和血脂異常，其主要原因是病人體內(nèi)脂肪組織大量蓄積。而脂肪細(xì)胞中脂肪酸的大量堆積可以導(dǎo)致胰島素抵抗，從而引發(fā)糖尿病[6]。

非酒精性脂肪肝、高三酰甘油血癥、血脂增高等脂代謝紊亂癥狀在代謝綜合征、肥胖及2型糖尿病病人中普遍存在，細(xì)胞中脂肪酸的大量堆積可以導(dǎo)致胰島素抵抗，進(jìn)而引發(fā)糖耐量異常[7]。而機(jī)體中糖代謝與脂代謝有密不可分的關(guān)系，一定條件下可以相互轉(zhuǎn)化[8]。AMPK是一個(gè)能量傳感器，參與調(diào)節(jié)包括胰島B細(xì)胞、肝臟、骨骼肌和脂肪在內(nèi)的多種外周組織的糖脂代謝過(guò)程[9]。AMPK調(diào)節(jié)脂代謝的信號(hào)通路是由AMPK、ACCa以及AKT組成[10]?；罨罂赏ㄟ^(guò)減少葡萄糖利用、增加脂肪酸氧化而產(chǎn)生能量，同時(shí)抑制葡萄糖異生及脂肪酸合成而減少能量消耗以維持細(xì)胞能量代謝平衡[11-13]。

AMPK是細(xì)胞和機(jī)體能量代謝的主要調(diào)節(jié)器[14], 其活性主要受細(xì)胞中AMP/ATP比例的調(diào)節(jié)，控制能量的分解與合成代謝通路。ACC受AMPK負(fù)調(diào)控，是脂肪酸代謝的限速酶。ACC在體內(nèi)主要有ACCa 和ACCD兩種形式，由不同基因編碼，ACCa(265 000)主要在脂肪生成活躍的肝臟、脂肪組織和乳腺組織中表達(dá)，在脂類代謝過(guò)程中具有重要作用[15]。

已有結(jié)果表明在人類、小鼠、大鼠的胰島細(xì)胞中，KCN基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)胰島素分泌扮演了重要的角色[16]，但目前對(duì)于KCN基因是否影響糖尿病合并脂代謝紊亂及相關(guān)機(jī)制尚未有定論。本研究表明，KCN基因敲除糖尿病小鼠存在TG、TC和LDL增高，HDL降低等脂代謝紊亂癥狀。進(jìn)一步研究其機(jī)制發(fā)現(xiàn),KCN基因敲除糖尿病小鼠的AMPK及其上游的AKT被抑制，并且其下游的ACCa磷酸化增強(qiáng)，脂肪酸氧化受到抑制。因此，本研究將有助于明確KCN通道基因在糖尿病發(fā)生、發(fā)展中的作用及其機(jī)制，并可能為糖尿病合并脂代謝異常的治療提供新策略和新的藥物靶點(diǎn)。

圖5 AKT、AMPK、ACC及其磷酸化水平

A:C57BL/6 group； B:KCN+/-group； C:KCN-/-group. The levels of phos-AKT and phos-AMPK in group B and C were significantly lower than thosein control group and phos-ACCα significantly increased,*P<0.05，**P<0.01vsgroup A；KCN：human ether-a-go-go related gene; AKT：protein kinase B; AMPK：adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase; ACC：acetyl CoA carboxylase.

本研究的后續(xù)工作將在細(xì)胞水平驗(yàn)證AMPK對(duì)脂代謝的影響以及驗(yàn)證AKT-AMPK-SREBP-1脂肪酸合成途徑是否與脂肪酸氧化途徑共同影響了KCN基因敲除糖尿病小鼠的脂代謝。下一步，將分別采用KCN基因激動(dòng)劑和抑制劑進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞和動(dòng)物水平的三酰甘油等脂代謝相關(guān)指標(biāo)，并從RNA水平和蛋白水平分別檢測(cè)AMPK相關(guān)通路蛋白標(biāo)志物的表達(dá)情況，進(jìn)一步明確KCN通道基因在糖尿病合并脂代謝紊亂發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的作用及機(jī)制。

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編輯 慕 萌

Effect ofKCNpotassium channel gene on lipid metabolism in mice

Liu Jingyi1,2， Lu Jing1,2， Yang Jinkui1,2*

(1.DepartmentofEndocrinology,BeijingTongrenHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100730,China; 2.BeijingKeyLaboratoryofDiabetesResearchandCare,Beijing100730,China)

Objective To study the effect of potassium channel gene (KCN) on lipid metabolism in mice and its related signal pathway and to provide a new therapeutic target for dyslipidemia in diabetes . Methods Our group constructedKCNchannel knock-out mouse model. In this study,KCNchannel knock-out mice and control C57BL/6 mice will be examined. We will detect total cholesterol, triglyceride, high-density lipoprotein and low-density lipoprotein in their serum, the protein level of adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase (AMPK) pathway from rat’s tissue was detected by western blot and the level of hepatic steatosis will be observed by HE staining.Results The serum levels of total cholesterol, triglyceride and low-density lipoprotein inKCNgene knock-out mouse were all significantly higher than those in controls, and high-density lipoprotein is lower than control (P<0.05). The results of Western blotting showed that phosphate-protein kinase B (Phos-AKT) and phos-AMPK levels in liver tissue ofKCNgene knockout mice were lower than those in normal control group, and phosphate-acetyl CoA carboxylase (phos-ACCα) level was significantly higher (P<0.05). ConclusionKCNchannel influences lipid metabolism in mice by classical fatty acid oxidation AMPK pathway.

potassium voltage-gated channel; lipid metabolism; adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase pathway

國(guó)家自然科學(xué)基金(81400824,81370946, 81300726)，北京市自然科學(xué)基金(7131005). This study was supported by National Natural Science Foundation of China (81400824,81370946, 81300726)，Natural Science Foundation of Beijing (7131005).

時(shí)間：2017-04-13 20∶08

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2008.060.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.004]

R589.2

2017-01-20)

*Corresponding author， E-mail：jinkui.yang@gmail.com