穆凌云 李金霞 張秋云 * 陳 煜 高連印 杜宇瓊

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心，北京 100069)

·基礎(chǔ)研究 ·

截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭模型大鼠血清TNF-α、肝組織p-JNK及c-Jun的影響

穆凌云1李金霞1張秋云1*陳 煜2高連印1杜宇瓊1

(1.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院 中醫(yī)絡(luò)病研究北京市重點實驗室，北京 100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心，北京 100069)

目的 觀察截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)含量、肝組織磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)及轉(zhuǎn)錄因子c-Jun表達的影響，探討該方干預(yù)ACLF大鼠的部分作用機制。方法 選擇SPF級Wistar雄性大鼠70只，采用數(shù)字表法隨機分為正常對照組、模型組、截斷逆挽方組和JNK抑制劑SP600125(anthrapyrazolone)組，予豬血清免疫誘導(dǎo)大鼠形成肝纖維化模型，再聯(lián)合D-氨基半乳糖/脂多糖(D-galactosamine/lipopolysaccharide,D-GalN/LPS)急性攻擊，建立ACLF大鼠模型。截斷逆挽方組在急性攻擊前給予截斷逆挽方連續(xù)灌胃3 d，SP600125組在急性攻擊前0.5 h腹腔注射SP600125。各組大鼠分別在急性攻擊后4、8、12 h取材。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA)檢測血清TNF-α含量，蛋白印跡法(Western blotting，WB)檢測c-Jun蛋白表達量，免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中p-JNK蛋白表達量，HE染色觀察肝臟結(jié)構(gòu)病理變化。結(jié)果 與正常組相比，模型組各時間點血清TNF-α濃度均升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與對應(yīng)時間點模型組相比，截斷逆挽方組及SP600125組4、8 h血清TNF-α含量明顯降低(P<0.01),12 h有所升高；與正常組相比，模型組各時間點c-Jun、p-JNK表達量升高(P<0.01)；與模型組相比，截斷逆挽方組、SP600125組在4 h及8 h c-Jun、p-JNK表達減少(P<0.05)，12 h表達增多。截斷逆挽方組及SP600125組兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 截斷逆挽方在一定程度上可以減輕ACLF大鼠肝細胞的損傷，其作用機制可能是通過影響JNK信號通路介導(dǎo)的細胞凋亡，從而保護肝細胞，抑制肝衰竭。

慢加急性肝衰竭；截斷逆挽方；細胞凋亡；JNK信號通路

慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure，ACLF)主要表現(xiàn)為肝細胞發(fā)生大塊或亞大塊壞死[1]，病情重，合并癥多，病死率高而且缺乏特效治療藥物和手段。其病理變化的實質(zhì)是大量肝細胞過度死亡，而且細胞凋亡作為細胞死亡的重要形式之一，是ACLF發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵病理變化。

截斷逆挽方是首都國醫(yī)名師錢英教授臨床用于治療慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis，CSH)的經(jīng)驗方[1]。本課題組前期實驗結(jié)果表明：該方對ACLF大鼠模型的肝功能具有一定保護作用，可以減輕肝組織損傷，降低病死率，并延長其存活時間；并且可以降低血漿內(nèi)毒素(endotoxin,ET)、細胞凋亡指數(shù)(apoptosis index,AI)、半胱氨酸蛋白酶-8(cysteine proteinase-8,Caspase-8)、半胱氨酸蛋白酶-3(cysteine proteinase-3,Caspase-3)、細胞周期蛋白 E(cyclin E)及其轉(zhuǎn)錄因子(DRTF-1-polypeptide-1,DP1)的表達量，可以降低血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine transaminase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate transaminase,AST)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、肝組織腫瘤壞死因子受體(tumor necrosis factor receptor，TNFR1)的含量，并且可以通過抑制線粒體途徑，從而抑制肝細胞凋亡[2-8]。本實驗旨在通過觀察截斷逆挽方對ACLF大鼠血清TNF-α含量、肝組織磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase,p-JNK)及c-Jun表達量的影響，進一步探討該方干預(yù)ACLF大鼠的部分作用機制，為臨床應(yīng)用該方提供可行的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar雄性大鼠70只，SPF級，體質(zhì)量180～200 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，實驗動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。首都醫(yī)科大學(xué)動物房飼養(yǎng)，實驗室合格證號：SYXK(京)2005-0022。每籠3只，自由飲食，室溫18℃～23 ℃，濕度為(50.0±2.0)%，每隔12 h開燈照明。

1.2 主要試劑

豬血清(北京平睿生物有限公司，批號：20140713)；D-氨基半乳糖(D-galactosamine/lipopolysaccharide，D-GalN)，(P29/14/221，美國Inalco公司)；脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)(109K4075，美國Sigma公司)；Rat TNF-α platinum ELISA(CA,美國eBioscience公司)；DAB試劑盒(ZLI-9018，北京中杉金橋公司)；封閉用羊血清原液(ZLI-9021，北京中杉金橋公司)；兔二步法檢測試劑盒(PV-9001，北京中杉金橋公司)，Beta-tubulin rabbit Polyclonal 抗體(10094-1-AP,美國Proteintech)，Anti-p-JNK 抗體及c-Jun(H-79)抗體(美國Santa Cruz公司)。

1.3 主要藥物

截斷逆挽方(苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、生黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、莪術(shù)6 g、丹參20 g、生地20 g、黑附片15 g)，藥材購自北京同仁堂藥店，濃煎成4.34 g/mL，4 ℃保存，使用前水浴加熱。

1.4 主要儀器

Eclipse 80i共聚焦熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；Universal 320R低溫離心機(德國Hettich公司)；1-14高速離心機(美國Sigma公司)；Multiskan MK3酶標儀；EG720EAU-SS微波爐(中國美的公司)；F6/10超細勻漿器(德國Fluko公司)；Western blotting電泳儀及附件(美國Bio-Rad公司)；Odysseey2.1紅外熒光掃描成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)；JEM-1400高襯度投射電子顯微鏡(日本JEOL公司)。

1.5 實驗方法

1.5.1 ACLF大鼠造模

課題組前期采用劉旭華等[9]制備的免疫誘導(dǎo)型ACLF大鼠模型，但造模期間病死率達58%。后采用崔麗娟等[5]改變的造模方法，運用豬血清連續(xù)腹腔注射13周造成肝纖維化模型，再聯(lián)合D-GalN/LPS急性攻擊，造模期間病死率降為4%。

ACLF大鼠模型建立方法分為兩個階段。(1)免疫階段：大鼠采用數(shù)字表法隨機分為正常對照組6只和處理組64只，處理組腹腔注射豬血清1周2次、1次1只注射0.5 mL，正常組大鼠注射等量0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液，共13周，造模過程中無死亡。于13周末處理組中采用抽樣法隨機抽取1只大鼠處死，取肝組織做病理觀察，根據(jù)《肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南》[10]判定免疫型肝纖維化造模是否成功。造模成功后，將處理組采用數(shù)字表法隨機分為模型組、截斷逆挽方組及SP600125組，每組21只。(2)急性攻擊階段：模型組、截斷逆挽方組及SP600125組同時給予D-GalN 800 mg/kg聯(lián)合LPS 100 μg/kg腹腔注射造成急性攻擊，建立ACLF模型。

1.5.2 分組與給藥方法

急性攻擊前，截斷逆挽方組給予生藥量為21.7 g·kg-1·d-1濃度為4.34 g/mL的截斷逆挽方連續(xù)灌胃 3 d，正常組及模型組給予同等劑量0.9%(質(zhì)量分數(shù))氯化鈉注射液灌胃。各組大鼠分別于急性攻擊4 h、8 h、12 h后進行平行取材，每組每個時間點7只。大鼠麻醉后腹主動脈取血，摘取肝右葉同一部分置于10%(體積分數(shù))甲醛溶液固定，余下部分于液氮中快速凍存。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay，ELISA)檢測血清TNF-α含量

TNF-α應(yīng)用ELISA法通過進行檢測，具體步驟按照說明書操作，測定各組大鼠血清中TNF-α含量。

1.5.4 Western blotting法檢測肝組織中c-Jun蛋白的表達

于-80℃冰箱取出凍存肝組織，每組每個時間點取5支進行勻漿、蛋白定量，按照蛋白定量試劑盒說明書步驟測定蛋白濃度。每支上樣蛋白84μg，經(jīng)10%質(zhì)量分數(shù)SDS-聚丙烯凝膠電泳分離后300 mA電轉(zhuǎn)1 h至0.22μm NC膜上，5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉封閉1 h，c-Jun抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌，加二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，紅外熒光掃描成像系統(tǒng)Oddsey掃膜。以β-tubulin作為參照蛋白，使用Image J軟件獲得目的蛋白條帶的灰度值，通過灰度比較的方法來確定目的蛋白相對于內(nèi)參的表達量，以分析樣本之間目的蛋白表達量差異。

1.5.5 免疫組織化學(xué)法檢測肝組織中p-JNK蛋白的表達

10%(體積分數(shù))甲醛固定肝組織后進行石蠟包埋、切片，經(jīng)二甲苯、梯度無水乙醇脫蠟、水化，微波抗原修復(fù)，3%(體積分數(shù))過氧化氫封閉過氧化物酶，10%(體積分數(shù))羊血清封閉1 h，p-JNK兔多克隆抗體(1：200)4 ℃過夜孵育，PBS洗滌后滴加HRP標記二抗37 ℃孵育1 h，DAB顯色2 min，蘇木素復(fù)染，經(jīng)自來水沖洗反藍，脫水之后中性樹膠封片。每組每個時間點觀察3張切片，隨機選取10個高倍視野進行拍攝，并運用NIKON NIS-Elements BR軟件進行陽性表達的標示及積分吸光度值(A值)檢測。

每組選取5個肝組織樣本，石蠟包埋切片，經(jīng)蘇木素-伊紅染色，脫水之后予中性樹膠封片。在200倍光鏡下對肝臟病理變化進行觀察。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況觀察

造模過程中大鼠無死亡。正常組大鼠一般狀況良好，攝食、飲水正常、體質(zhì)量增加較快、毛色光潔、反應(yīng)靈敏、活動自如。豬血清免疫損傷期間，處理組大鼠飲食、飲水較正常組少，躁動不安，體質(zhì)量較正常組無明顯差異。急性攻擊4 h后，大鼠毛發(fā)直立，身體顫抖，抱團；急性攻擊8 h后，大鼠抗捕捉能力較弱，反應(yīng)遲鈍；急性攻擊12 h后，大鼠抗捕捉能力明顯降低。中藥組較模型組癥狀均有所減輕。

2.2 各組大鼠血清腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)濃度比較

如表1、表2所示，正常組血清中TNF-α濃度較低，與正常組相比，模型組各時間點血清TNF-α濃度均升高，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。與模型組相比，截斷逆挽方及SP600125 4 h、8 h組血清TNF-α含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，在12 h TNF-α含量較模型組略有下降，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，整體呈現(xiàn)升高趨勢。經(jīng)析因方差分析，截斷逆挽方及SP600125組進行兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清TNF-α值比較

*P<0.05,**P<0.01vsthe same point in model group;##P<0.01vsthe same point in normal control group；△△P<0.01vsthe last point in the same treatment group；TNF-α：tumor necrosis factor-α；JDNW：Jieduan Niwan Formula.

2.3 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織p-JNK蛋白表達的影響

如圖1、表2所示，p-JNK 免疫組織化學(xué)染色陽性結(jié)果顯示為棕褐色，在細胞質(zhì)表達。與正常組相比，模型組p-JNK表達量各時間點均明顯升高(P<0.01)，于8 h表達明顯增多，并達到峰值，12 h較前降低；與模型組相比，截斷逆挽方組及SP600125組在4 h、8 h表達明顯降低(P<0.01)，12 h表達略高。經(jīng)析因方差分析，截斷逆挽方及SP600125組進行兩兩比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 免疫組織化學(xué)法檢測大鼠肝組織p-JNK蛋白表達

A：normal control group； B：model 4 h group; C:JDNW 4 h group; D:SP600125 4 h group; E:model 8 h group; F:JDNW 8 h group; G:SP600125 8 h group; H:model 12 h group；Arrow：expression of p-JNK；P-JNK：phosphorylated c-Jun N-terminal kinase；JDNW：Jieduan Niwan Formula.

表2 各組大鼠p-JNK表達A值比較

**P<0.01vsthe same point in model group；##P<0.01vsthe same point in normal control group；△△P<0.01vsthe last point in the same treatment group；p-JNK：phosphorylated c-Jun N-terminal kinase；A：absorbancy；JDNW：Jieduan-Niwan Formula.

2.4 截斷逆挽方對ACLF大鼠肝組織c-Jun蛋白表達的影響

c-Jun蛋白在各組大鼠肝組織中表達的趨勢如圖2、表3所示。與正常組相比，模型組4 h時c-Jun蛋白表達增多，至8 h達到高峰，至12 h表達降低(P<0.01)，但仍比正常組高；與模型組相比，截斷逆挽方組及SP600125組4 h(P<0.01)、8 h(P<0.01)c-Jun蛋白表達較少，12 h表達較模型組增多，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，整體呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。經(jīng)析因方差分析，截斷逆挽方及SP600125組進行兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 Western blotting法檢測各組大鼠肝組織c-Jun蛋白表達情況

A:normal control group; B:model 4 h group; C:JDNW 4 h group; D:SP600125 4 h group; E:model 8 h group; F:JDNW 8 h group; G:SP600125 8 h group; H:model 12 h group; I:JDNW 12 h group; J:SP600125 12 h group；JDNW：Jieduan-Niwan Formula.

表3 各組大鼠肝組織c-Jun蛋白表達A值比較

2.5 各組大鼠肝臟病理表現(xiàn)

如圖3所示，大鼠HE染色顯示，正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀，排列有序，肝細胞無壞死、變性，無炎性細胞浸潤。模型組4 h可見肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝細胞排列不規(guī)整，纖維組織增生，部分增生纖維組織可構(gòu)成假小葉；模型組8 h可見肝細胞呈點狀或局灶性壞死，有炎性細胞浸潤；模型組12 h可見肝細胞呈片狀壞死或大塊壞死，有大量炎性細胞浸潤，部分肝細胞可見脂肪變性或氣球樣變。截斷逆挽方組和SP600125組較相應(yīng)時間點模型組，病理變化均有減輕，纖維組織增生較少，肝細胞壞死程度減輕。

圖3 各組大鼠肝組織HE染色

A:normal control group; B:model 4 h group; C:JDNW 4 h group; D:SP600125 4 h group; E:model 8 h group; F:JDNW 8 h group; G:SP600125 8 h group; H:model 12 h group; I:JDNW 12 h group; J:SP600125 12 h group，JDNW：Jieduan-Niwan Formula.

3 討論

ACLF是我國肝衰竭中的主要類型，多是在慢性肝病的基礎(chǔ)上因勞累、飲酒、感染、病毒復(fù)制等因素誘使肝臟發(fā)生大塊或亞大塊壞死，主要表現(xiàn)為肝細胞大面積凋亡。臨床多將ACLF等同于慢性重型肝炎(chronic severe hepatitis,CSH)，病情危重，發(fā)展快，病死率高(可達70%以上)[11]。國內(nèi)多采用針對病因進行的抗病毒治療及肝移植、人工肝等手段，而且廣泛運用降酶保肝藥物，但是這些方法對ACLF病人的預(yù)后效果尚不明確[12]。本實驗采用D-GalN/LPS急性攻擊構(gòu)建ACLF大鼠模型，模擬人體發(fā)病過程，旨在為ACLF的發(fā)病機制和臨床治療提供新的思路。

TNF-α由活化的巨噬細胞/單核細胞產(chǎn)生,是調(diào)控細胞死亡、增生以及免疫等多種生理病理性反應(yīng)的重要介質(zhì)。其活化機制主要由3條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來誘導(dǎo)產(chǎn)生：Caspase家族介導(dǎo)的細胞凋亡、銜接蛋白TRAF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB和JNK蛋白激酶的活化。TNF-α介導(dǎo)的細胞凋亡是ACLF大鼠模型重要的發(fā)病機制之一。在D-GalN/LPS誘導(dǎo)建立的ACLF大鼠模型中，TNF-α主要是通過與受體TNFR結(jié)合，促使上游蛋白激酶活化，招募TRAF2聚集激活下游絲裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)級聯(lián)反應(yīng)。其中MKK4/MKK7使JNK位點磷酸化，特異性激活JNK。JNK被激活后活化轉(zhuǎn)錄因子AP-1(由c-Jun、c-fos等蛋白合成)，誘導(dǎo)下游蛋白級聯(lián)反應(yīng)，從而引起細胞凋亡。

在哺乳動物細胞中，MAPKs作為將凋亡信號由細胞表面?zhèn)鲗?dǎo)至胞核內(nèi)部的重要媒介，可以調(diào)控細胞內(nèi)外不同的應(yīng)激反應(yīng)。而JNK是MAPKs家族重要成員之一，JNK信號通路已被證實在調(diào)控細胞凋亡方面起著重要作用。JNK主要位于細胞質(zhì)，當受到外界刺激時，其氨基酸殘基磷酸化從而被激活，研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)的JNK活化會引起細胞凋亡?；罨腏NK可以和轉(zhuǎn)錄因子c-Jun的氨基末端區(qū)域結(jié)合，使轉(zhuǎn)錄因子的活性區(qū)域發(fā)生磷酸化，促進下游相應(yīng)靶基因及蛋白的表達。

而且在本實驗中，與正常組相比，模型組在4 h至8 h p-JNK、c-Jun表達均呈現(xiàn)逐漸升高趨勢，提示JNK持續(xù)活化，并激活c-Jun，高峰出現(xiàn)在急性攻擊后8 h。在12 h，蛋白表達較8 h有所降低，但仍高于正常組，此時細胞凋亡活動減弱。考證其原因[13]，可能是造模終末期肝細胞大量死亡，為不可逆損傷，細胞凋亡相應(yīng)減少。

截斷逆挽方組在4 h、8 h時血清TNF-α、p-JNK、c-Jun表達量均較模型組減少，證明該方抑制了JNK的活化及JNK信號通路上游關(guān)鍵蛋白的表達，將凋亡活動減弱；在12 h，截斷逆挽方組血清TNF-α、p-JNK、c-Jun蛋白表達略高于模型組，而且4～12 h呈現(xiàn)表達持續(xù)升高的趨勢，未見降低，表明截斷逆挽方干預(yù)的模型大鼠肝細胞凋亡活動持續(xù)活躍，提示我們截斷逆挽方抑制了細胞凋亡的活動，在一定程度上延緩了ACLF大鼠肝細胞死亡的進程。

JNK抑制劑SP600125可以對JNK信號通路產(chǎn)生特異性地抑制作用，目前已有相關(guān)動物實驗證實SP600125可以直接抑制JNK并且在一定程度上干預(yù)治療動物疾病模型[14]。如在海洛因誘導(dǎo)的小腦顆粒細胞凋亡中JNK/c-Jun通路被激活，JNK特異性抑制劑SP600125可以降低c-Jun磷酸化水平[15]。

另，SP600125組各細胞因子的表達趨勢與截斷逆挽方組一致：與模型組4 h、8 h相比，SP600125組蛋白表達均減少，在12 h較模型組增多，4～12 h呈逐漸上升的趨勢。經(jīng)過析因方差分析兩組間比較得知，截斷逆挽方與SP600125作用于ACLF大鼠血清TNF-α、p-JNK、c-Jun的表達無明顯差異，證實了截斷逆挽方與SP600125的作用機制相似，進一步提示截斷逆挽方可能可以通過干預(yù)JNK信號通路從而減輕肝細胞損傷。

病理學(xué)檢驗作為診斷肝衰竭的重要指標，本實驗中HE染色顯示模型組有假小葉形成，廣泛的纖維組織增生，肝細胞大片壞死。與模型組比較，截斷逆挽方組及SP600125組在相應(yīng)時間點，壞死減少，炎性反應(yīng)細胞浸潤較少。

綜上分析，結(jié)合課題組前期實驗結(jié)果，降低血清TNF-α、肝組織蛋白p-JNK、c-Jun表達，調(diào)控JNK信號通路從而減少肝細胞凋亡，可能是截斷逆挽方改善ACLF模型大鼠肝功能和減輕其肝細胞損傷的部分作用機制。

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編輯 慕 萌

Effects of Jieduan Niwan Formula on the c-Jun,p-JNK of liver tissue in Acute-on-Chronic liver failure rats

Mu Lingyun1， Li Jinxia1， Zhang Qiuyun1*Chen Yu2，Gao Lianyin1， Du Yuqiong1

(1.TraditionalChineseMedicineAcademyofCapitalMedicineUniversity，BeijingKeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicineCollateralDiseaseResearch，Beijing100069,China;3.ArtificialLiverCenter，BeijingYouanHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069,China)

Objective To observe the effect of the Jieduan-Niwan Formula (JDNW)on the serum tumor necrosis factor alpha(TNF-α)content,the expression of p-JNK and transcription factor c-Jun in acute-on-chronic liver failure(ACLF)rats,to discuss part of the action mechanism of intervention of in ACLF. Methods SPF 70 male Wistar rats were randomly divided into normal control group,model group,JDNW group and JNK inhibitor SP600125 group,to inject pig serum to induce rat liver fibrosis model,and then acute attack combined with D-GalN/LPS,ACLF model was established. Rats in JDNW group were orally given JDNW formula for 3 days before acute attack.Rats in SP600125 group giving intraperitoneal injection half an hour before acute attack.Rats were sacrificed, respectively at 4,8 and 12 h after model established.The expression of TNF-α,c-Jun,p-JNK were detected by enzyme-linked immune sorbent assay(ELISA),western blot method and immunohistochemical analysis, respectively. Results Compared with normal group,the expression of TNF-α,p-JNK,c-Jun of model group were gradually increased;compared with the model group,the expression of TNF-α,p-JNK,c-Jun of JDNW and SP600125 group in 4h and 8h was less(P<0.05),and the expression of 12h increased; the different expression of SP600125 group was in accordance with the JDNW group. Conclusion The prescription of JDNWcan reduce the damage of rat liver cell ACLF in a certain extent,its mechanism may be through cell apoptosis mediated by JNK signaling pathway,thereby protecting liver cells,inhibiting liver failure.

acute-on-chronic liver failure;Jieduan Niwan Formula;apoptosis;JNK signaling pathway

首都中醫(yī)藥研究專項(14ZY01)。This study was supported by Capital of Traditional Chinese Medicine Special Research(14ZY01).

時間：2017-04-13 19∶31

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.1931.004.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.023]

R285.6

2016-07-13)

*Corresponding author， E-mail：zhangqiuyun8202@aliyun.com