王 驊, 王靜成, 王永祥, 王大新, 陶玉平,馮新民, 熊傳芝, 顧加祥, 何金山

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

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論 著

NEP1-40對(duì)缺氧缺血性腦病新生大鼠的Wnt信號(hào)通路胞增殖的調(diào)控作用

王 驊, 王靜成, 王永祥, 王大新, 陶玉平,馮新民, 熊傳芝, 顧加祥, 何金山

(江蘇省蘇北人民醫(yī)院 骨科, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

目的 探討Nogo-A受體拮抗劑NEP1-40對(duì)Wnt信號(hào)通路和神經(jīng)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。方法 40只大鼠被均分為HIBD(缺氧缺血性腦損傷)組和HIBD+NEP1-40組，采用PCR定量、Western blot分析、細(xì)胞增殖的免疫組化試驗(yàn)、8-異前列腺素評(píng)估等檢測(cè)分析缺氧缺血性腦病新生大鼠的修復(fù)過程中Wnt信號(hào)通路中NgR的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控與神經(jīng)細(xì)胞增殖。結(jié)果 NEP1-40處理后, cJun和c-Myc的表達(dá)在蛋白水平上調(diào)，基因表達(dá)水平上調(diào), Ki-67增加, 8-異前列腺素?zé)o顯著變化。結(jié)論 通過抑制NgR后發(fā)現(xiàn), c-Jun和c-Myc是Wnt通路的主要轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)腦室下區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的增殖增加。

缺氧缺血性腦病; Wnt信號(hào)通路; Nogo-A; NEP1-40; 神經(jīng)細(xì)胞增殖

缺氧缺血性腦病(HIE)是由于各種圍生期因素引起的腦缺氧或缺血而形成的常見腦損傷。對(duì)于HIE新生兒來說，神經(jīng)細(xì)胞再生是一個(gè)至關(guān)重要的受損腦組織修復(fù)過程[1]。抑制劑能降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的自我修復(fù)能力，其中Nogo A尤為重要[2]。Nogo A是已知的特定中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)突起生長(zhǎng)的抑制劑，它屬于編碼網(wǎng)狀組織的基因家族，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)[3]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后, Nogo A抑制神經(jīng)元軸突再生及其突觸的重塑[4], 也可能抑制高等脊椎動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生[5]。Kmari等[6]應(yīng)用RT-PCR對(duì)正常老化的小鼠腦組織Nogo A蛋白和mRNA水平進(jìn)行分析，證實(shí)Nogo A蛋白水平在衰老過程中具有改變突觸可塑的作用。Nogo A基因敲除成年小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突導(dǎo)向因子增加，在體內(nèi)促進(jìn)軸突的再生[7]。 Nogo-66受體(NgR)連同少突神經(jīng)細(xì)胞-髓磷脂糖蛋白和髓鞘相關(guān)糖蛋白共同介導(dǎo)抑制軸突生長(zhǎng)，調(diào)節(jié)成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)的軸突再生及可塑性[8-9]。Wnt信號(hào)通路調(diào)控著胚胎以及成人的細(xì)胞與細(xì)胞間聯(lián)系，包括在發(fā)育和修復(fù)期間的細(xì)胞增殖和分化[10]。研究[11]表明, Wnt信號(hào)通路參與了由Nogo介導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞再生，但其機(jī)制仍然未知。本實(shí)驗(yàn)使用NgR的拮抗劑NEP1-40, 研究其對(duì)受損中樞神經(jīng)的再生及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(TF)的作用，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 構(gòu)建動(dòng)物模型和藥物治療

采用新生雄性Wistar大鼠40只(7 d齡，體質(zhì)量為(16±3.0) g, 揚(yáng)州大學(xué)的動(dòng)物研究中心提供)。新生缺氧缺血性腦病大鼠動(dòng)物模型按經(jīng)典法構(gòu)建，該法由Vannucci于1981年在Levine的成年大鼠缺氧缺血性腦損傷模型基礎(chǔ)上經(jīng)過改進(jìn)而建成，至今在全世界被廣泛應(yīng)用。其具體操作方法如下：生后7 d大鼠麻醉后行左頸總動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)，術(shù)后恢復(fù)4～8 h后置于氧濃度為8%、環(huán)境溫度為37 ℃的密閉容器內(nèi)持續(xù)缺氧3.5 h, 構(gòu)建后被命名為缺氧缺血性腦損傷(HIBD)大鼠[12]。40只大鼠被分為HIBD組和HIBD + NEP1-40組，每組20只，NEP1-40處理7 d。

1.2 PCR定量

采用TRIzol(Invitrogen, 美國)分離大腦總RNA。采用PCR芯片(SABiosciences, 美國)用于檢測(cè)大鼠Wnt信號(hào)通路，其中包含APC、APC2、CCND1、CCND2、CCND3、CTNNB1、EP300、FGF4、FZD3、c-Jun、LRP5基因, c-Myc、Ppp2ca、PPP2R1A、WISP1、Wnt3a。采用cDNA合成裝備(Invitrogen, 美國)逆轉(zhuǎn)錄后，使用ABI Prism SDS 7000 (Applied Biosystems, 美國) 將所有的產(chǎn)物都用作實(shí)時(shí)PCR模板。步驟如下: ① 50 ℃ 2 min, 1循環(huán); ② 95 ℃ 10 min, 1循環(huán); ③ 95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s, 40循環(huán); ④ 72 ℃ 10 min, 1循環(huán)。

1.3 Western blot分析

腦的總蛋白提取物(12 μg)加入4×緩沖液, 100 ℃煮5 min, 然后經(jīng)10% SDS-PAGE凝膠(Invitrogen, 美國)。凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到NE膜(70 V, 2 h, 4 ℃)。5%脫脂牛奶封閉1 h后，膜用APC、EP300、c-Jun、c-Myc、Wnt3a的一抗(兔多克隆抗體IgG，Millipore)孵育, 3% BSA，根據(jù)實(shí)時(shí)PCR, 4℃ 過夜。1×TPBS洗滌后(pH 7.4), 膜與二抗(羊抗兔IgG)在室溫條件下孵育1 h, 1×TPBS再洗滌(pH 7.4), 拍攝照片(Kodak, 美國)用于分析。β-肌動(dòng)蛋白作為陰性對(duì)照。

1.4 細(xì)胞增殖的免疫組化試驗(yàn)

腦提取物通過免疫組化檢測(cè)Ki67的表達(dá)。制備了12 μm冰凍鼠腦冠狀切片(Leica), Ki67染色(Abcam、1∶1 000), 評(píng)估腦室下區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖。在激光共聚焦顯微鏡下拍攝的照片，背景為暗(Nikon, 100×)。

1.5 8-異前列腺素評(píng)估檢測(cè)

腦組織在加蛋白酶抑制劑(1∶1 000, Invitrogen, 美國)的TBS緩沖液中磨碎, 12 000 g/min 4 ℃離心40 min。上清液轉(zhuǎn)移至另一管。活性氧ROS的特殊標(biāo)記物8-異前列腺素水平，按照流程用試劑盒(Cayman Chemical Company, 美國)測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果用t檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NEP1-40對(duì)基因表達(dá)的影響

HIBD組APC、EP300、c-Jun、c-Myc、Wnt3a基因表達(dá)明顯增加(>1.35 fold), 而HIBD + NEP1-40組, CCND2、WISP1 用NEP1-40處理7 d后減少(<0.75 fold)。而其他基因無顯著變化(>1.5 fold或<0.75 fold)。HIBD組值設(shè)定為1, HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得出相對(duì)值。所有的數(shù)據(jù)分析見圖1。

2.2 NEP1-40對(duì)蛋白表達(dá)的影響

Western blot分析見圖 2, NEP1-40處理7 d后, cJun和c-Myc的表達(dá)在蛋白水平上調(diào)(>1.5 fold), 基因表達(dá)有相同的變化。然而APC、EP300、Wnt3a、CCND2、WISP1, 表達(dá)無明顯變化(>1.35 fold或<0.75 fold), 基因表達(dá)完全不同。HIBD組值設(shè)定為1, 而HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得相對(duì)值。見圖3。

a:>1.35fold;b:<0.75fold;*P<0.05;**P<0.01圖1 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的基因表達(dá)對(duì)比分析

左:HIBD+NEP1-40組;右:HIBD組圖2 Westernblot分析結(jié)果

a:>1.35fold;*P<0.05;**P<0.01圖3 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的蛋白表達(dá)對(duì)比分析

2.3 8-異前列腺素的檢測(cè)分析

8-異前列腺素是檢測(cè)組織器官中氧化應(yīng)激的一個(gè)理想的生物標(biāo)志物。HIBD + NEP1-40組和HIBD組之間無顯著的變化。本研究表明NEP1-40不能調(diào)節(jié)缺氧缺血性腦病中樞神經(jīng)系統(tǒng)的氧化應(yīng)激。HIBD組值設(shè)定為1, 而HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得相對(duì)值。見圖4。

圖4 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的8-isoprostane檢測(cè)對(duì)比分析

2.4 神經(jīng)細(xì)胞再生的分析

如圖5(Bar: 200 μm)箭頭所示Ki67, 在成人大腦中的神經(jīng)細(xì)胞增殖的腦室下區(qū), HIBD + NEP1-40組(圖5 A)與HIBD組(圖5 B)相比神經(jīng)細(xì)胞的再生增加，或許有助于修復(fù)損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)。促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的增殖對(duì)缺氧缺血性腦病患者的治療是一種潛在有效的方法。腦室下區(qū)Ki67的表達(dá)HIBD組值設(shè)定為1, 而HIBD + NEP1-40組與HIBD組相比得出相對(duì)值。見圖6。

A:HIBD+NEP1-40組;B:HIBD組圖5 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的腦室下區(qū)Ki67表達(dá)檢測(cè)(200倍,Bar:200μm)

圖6 HIBD組與HIBD+NEP1-40組的腦室下區(qū)Ki67表達(dá)對(duì)比分析(*P<0.05)

3 討 論

許多蛋白質(zhì)都參與了神經(jīng)內(nèi)分泌或神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞中的膜轉(zhuǎn)運(yùn), Nogo蛋白是其中之一[13]。Nogo-A具有2個(gè)已知的抑制作用域，包括氨基-Nogo(位于N-末端)和Nogo-66[5]。神經(jīng)細(xì)胞損傷時(shí)阻斷 Nogo-A蛋白將有助于保護(hù)或修復(fù)受損的神經(jīng)細(xì)胞。Nogo-66受體(NgR)對(duì)于Nogo蛋白的一個(gè)特定區(qū)域是一種高親和力結(jié)合受體，這個(gè)區(qū)域是一種抑制軸突生長(zhǎng)的髓磷脂相關(guān)蛋白[14]。NgR關(guān)乎到神經(jīng)細(xì)胞的可塑性和再生性[15]。Wnt信號(hào)通路在胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞極性生成中發(fā)揮著多種重要作用[16], 尤其是轉(zhuǎn)移神經(jīng)管腹側(cè)基因至背區(qū)[17]。在本研究中，發(fā)現(xiàn)c-Jun和c-Myc大多上調(diào)。c-Jun在整個(gè)月經(jīng)周期對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的增殖和凋亡有重要作用[18]。c-Jun蛋白水平的周期性變化對(duì)腺上皮細(xì)胞增殖凋亡具有顯著意義[19]。c-Myc通過結(jié)合增強(qiáng)子Box序列和召集組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HATs)激活大量的基因表達(dá)[20], 在各種有絲分裂信號(hào)包括 Wnt信號(hào)通路激活[21]。

8-異同前列腺素是一種理想的氧化應(yīng)激標(biāo)志物，其濃度變化可在不穩(wěn)定的氧化應(yīng)激中檢測(cè)到[22]。本研究表明, 2組間8-異同前列腺素?zé)o明顯變化。這一結(jié)果表明氧化應(yīng)激與神經(jīng)細(xì)胞損傷和神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)無關(guān)或未參與Nogo-A的抑制。Ki-67是細(xì)胞增殖標(biāo)記物，與細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期中各階段(G1, S, G2, 有絲分裂)密切相關(guān)，但與休眠細(xì)胞(G0)無關(guān)[23]。HIBD + NEP1-40組可檢測(cè)到Ki-67增加，意味著在大腦中的神經(jīng)細(xì)胞增殖的地方腦室下區(qū)發(fā)生了神經(jīng)細(xì)胞再生的增加。促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖是一個(gè)潛在有效的方法治療HIE患者，有待進(jìn)一步研究。

本研究主要集中在Nogo-A受體拮抗劑NEP1-40對(duì)調(diào)控Wnt信號(hào)通路與新生缺氧缺血性腦病大鼠神經(jīng)細(xì)胞的增殖的影響，通過抑制NgR發(fā)現(xiàn), c-Jun和c-Myc是Wnt通路的主要轉(zhuǎn)錄因子，而發(fā)生在腦室下區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞的增殖在此過程中增加。

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Role of NEP1-40 in regulation of Wnt signaling pathway and regeneration of neural cells in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy

WANG Hua, WANG Jingcheng, WANG Yongxiang, WANG Daxin,TAO Yuping, FENG Xinmin, XIONG Chuanzhi, GU Jiaxiang, HE Jinshan

(DepartmentofOrthopedics,SubeiPeople′sHospital,Yangzhou,Jiangsu, 225000)

Objective To explore the role of Nogo-A receptor antagonist NEP1-40 in regulating regeneration of neural cells and related Wnt signaling pathway in neonatal rats with hypoxic ischemic encephalopathy (HIBD). Methods A total of 40 HIBD rats were divided into HIBD group and HIBD+ NEP1-40 group, 20 rats in each group. PCR Test, Western Blot Analysis, IHC test for cell proliferation and 8-isoprostane detection were used to evaluate regulation of NgR transcription factors in Wnt signaling pathway and proliferation of neural cells. Results The expressions of c-Jun and c-Myc, at the protein level, were up-regulated after treatment with Nogo-A receptor antagonist NEP1-40 for 7 days, and the same change was observed at gene expression and Ki-67. There was no significant change of 8-isoprostane. Conclusion The c-Jun and c-Myc are the main transcription factors in Wnt signaling pathway by inhibition of NgR, and meanwhile the proliferation of nerve cells in subventricular zone increase.

hypoxic ischemic encephalopathy; Wnt signaling pathway; Nogo-A; NEP1-40; neural cell proliferation

2016-11-21

江蘇省揚(yáng)州市社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)資助項(xiàng)目(YZ2011082); 江蘇省科技支撐計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展資助項(xiàng)目(BE2013911);

江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(BK20141281)

王永祥

R 742

A

1672-2353(2017)05-001-04

10.7619/jcmp.201705001