藥物涂層球囊藥物釋放和微粒脫落的體外評估方法

【作 者】宋精忠，謝琦宗，盧金華，王剛，龍漢先健科技（深圳）有限公司，深圳市，518057

目的 開發(fā)藥物釋放和微粒脫落的體外測試方法，解決現(xiàn)有評估方法的缺點與不足。方法 使用離體豬血管作為靶作用部位在自制的股髂動脈模型中進行體外轉(zhuǎn)載實驗，增加擴張過程和回撤過程的藥物損失實驗，細分微粒測試通道并使用顯微法聯(lián)合Image-Pro Plus軟件測試大微粒的數(shù)量和具體尺寸。結(jié)果 轉(zhuǎn)載率測試方法分辨度較好，實現(xiàn)了物料平衡，可獲得更詳盡的數(shù)據(jù)。結(jié)論 所開發(fā)的方法為企業(yè)配方篩選、臺架實驗和臨床前動物試驗提供了參考。

藥物球囊；藥物釋放；微粒脫落；藥物轉(zhuǎn)載；體外評估

【 Writers 】SONG Jingzhong, XIE Qizong, LU Jinhua, WANG Gang, LONG Han

Lifetech Scienti fi c (Shenzhen) Co. Ltd, Shenzhen, 518057

【 Abstract 】Objective Development in vitro test methods for drug release and particle release from drug coated balloon to address the disadvantages and inadequacy of existing assessment methods. Methods In vitro drug transfer test were carried out using the isolated porcine vessel as target site in the self-designed iliofemoral artery model, drug loss experiment during dilatation and retraction were added in drug release test, the particle test channel was subdivided and the size and number of the large particles were measured by microscopy combined with Image-Pro Plus software. Results The result shows that the method is feasible and the discrimination is good. The material balance can be achieved. More detailed data can be obtained. Conclusion The developed in vitro evaluation method provides a reference for formulation screening, in vitro bench testing and in vivo pre-clinical animal testing.

0 引言

經(jīng)皮腔內(nèi)介入治療技術(shù)是心血管治療領(lǐng)域新興的技術(shù)，藥物洗脫球囊由于具有無植入物永久保留在病人體內(nèi)，沒有聚合物涂層導(dǎo)致的炎性反應(yīng)及內(nèi)皮化障礙等優(yōu)點，使得藥物洗脫球囊導(dǎo)管在血管介入領(lǐng)域受到極大的追捧。隨著巴德和美敦力所開發(fā)的藥物球囊導(dǎo)管陸續(xù)被美國FDA批準上市，藥物洗脫外周球囊導(dǎo)管在下肢動脈疾病中的應(yīng)用越來越被廣大醫(yī)患所接受，越來越多的臨床試驗證明了藥物球囊在治療某些病變的有效性[1-3]，針對藥物球囊導(dǎo)管的研究熱度也越來越高。

針對藥物支架的產(chǎn)品標準及指導(dǎo)原則相對比較完善和成熟，但目前尚無有關(guān)藥物球囊的產(chǎn)品標準、指導(dǎo)原則及指南，研究者主要依據(jù)藥物—器械組合類產(chǎn)品的通用標準[4]來開發(fā)新產(chǎn)品，或者參考藥物支架的相關(guān)標準及指導(dǎo)原則。但通用標準往往比較籠統(tǒng)，很少涉及細節(jié)，而針對藥物支架的相關(guān)標準，由于產(chǎn)品特點和作用方式等的差異，有時又不完全適用，涉及藥物涂層體外評價的方法各不相同，這導(dǎo)致藥物球囊的研究顯得無據(jù)可依。

Seidlitz A[5]等，通過將自制的藻酸鈣凝膠膜制成圓柱狀凝膠物，作為體外轉(zhuǎn)載試驗的模擬血管使用，并采用ASTM F-2394-07模型，模擬藥物球囊作用路徑，測試藥物濃度并計算轉(zhuǎn)載率。Kelsch B[6]等，在體外干燥環(huán)境下擴張并搖晃，收集擴張過程中剝離的藥物涂層，評價涂層的粘附性。將球囊導(dǎo)管在充滿血液的環(huán)境中通過止血閥、指引導(dǎo)管并在攪動的血液環(huán)境中保持1 min，評價藥物涂層的脫落性能以及到達靶部位前的藥量損失。Kaule S[7]等，使用ASTM F-2394-07的模型模擬路徑，在模型的遠端連接硅膠管作為目標血管，計算藥物轉(zhuǎn)載、殘留和損失。其對微粒計數(shù)測試的方法是，輸送到目標位置后，收集沖洗及擴張過程中的溶液，測試≥10 μm和≥25 μm的微粒數(shù)目。

基于筆者對所查文獻的理解，發(fā)現(xiàn)不少研究者對藥物球囊的藥物釋放行為和微粒脫落水平的研究存在一些不足之處。表現(xiàn)如下：①藥物釋放行為研究測試模型多選擇ASTM標準的模型，與產(chǎn)品實際作用部位和路徑不同；②使用硅膠管或自制的管狀凝膠等作為模擬血管不能很好的模擬體內(nèi)血管壁對藥物的吸附作用；③對藥物球囊使用過程的涂層去向的分解不夠細致，不能做到物料平衡；④對于藥物球囊微粒脫落的研究不夠全面細致。本文針對藥物釋放和微粒脫落評估的不足之處，嘗試開發(fā)幾種方法，期望能解決這些問題。

1 儀器

球囊與支架輸送系統(tǒng)測試設(shè)備（型號IDTE2000）購自Machine Solution Inc.；液相色譜儀（LC-20AT）購自島津；液質(zhì)聯(lián)用儀（API4000）購自AB sciex；手持式勻漿機（T10）購自IKA；Talboys Advanced Vortex Mixers 購自Troemner；量筒式微量砂芯過濾裝置（砂芯片直徑20 mm，濾膜直徑25 mm) 購自建湖亞東玻璃儀器；數(shù)碼體視鏡（EZ4 HD）購自Leica； Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件來自 Media Cybernetics。

2 材料

紫杉醇對照品購自中國食品藥品檢定研究所；藥物洗脫外周球囊導(dǎo)管(規(guī)格3.0 mm×40 mm，5.0 mm×60 mm)由先健科技(深圳)有限公司自制；醫(yī)用混合纖維素聚酯薄膜（直徑25 mm，孔徑0.8 μm，黑色）購自天津市領(lǐng)航實驗設(shè)備有限公司；指引導(dǎo)管（6F MPA1）購自Cordis；指引導(dǎo)絲（V18TM0.018"×300 cm Control WireTM） 購自Boston Scientif i c。

3 方法

3.1 體外藥物釋放測試模型

使用自制的髂股動脈模型，該模型基本尺寸按與正常成年人1:1比例設(shè)計制作，用于模擬下肢動脈的路徑。按對側(cè)翻山手術(shù)流程依次置入導(dǎo)絲、導(dǎo)管。通過IDTE2000球囊與支架輸送系統(tǒng)測試設(shè)備輸送循環(huán)介質(zhì)。模型浸沒在恒溫為(37±2) ℃的生理鹽水中。

3.2 體外藥物釋放測試步驟

沿導(dǎo)絲將球囊通過指引導(dǎo)管推送至預(yù)擴張部位，收集輸送過程的流出液，測試流出液的藥物濃度。擴張球囊至(200～400) kPa，收集擴張過程的流出液，測試流出液的濃度。選擇大小適中的豬心臟，解剖獲取冠狀動脈的左回旋支和右冠。在導(dǎo)管末端連接離體豬血管，作為球囊擴張靶部位。沿導(dǎo)絲將球囊通過指引導(dǎo)管推送至血管的預(yù)擴張部位，用充盈器迅速充盈到預(yù)定壓力，并維持2 min，泄壓后撤出球囊導(dǎo)管，收集回撤過程的流出液，測試流出液的濃度。剪下球囊導(dǎo)管，測試球囊表面殘留藥量。準確截取球囊擴張部位的血管，測試血管藥物含量。

3.3 藥物含量測試

血管組織樣品的前處理方法：經(jīng)體外模擬后取下的靶血管，經(jīng)冷凍干燥，快速稱重，室溫下解凍2 h，精密加入適量空白勻漿液，使用手持式勻漿機研磨。超聲10 min，離心5 min，取上層清液加入一定比例的乙腈，漩渦混合，再經(jīng)低溫高速離心沉淀。取上清液進LC-MS/MS分析。

LC-MS/MS儀器主要工作參數(shù)：API4000 QTRAP型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，配備電噴霧電離源（ESI），分析柱：Agela Venusil XBP C8 (2.1 × 50 mm, 5 μm)，梯度洗脫，ESI正離子檢測模式。

剪下的球囊導(dǎo)管使用甲醇浸提，收集的輸送、擴張和回撤過程流出液，均使用甲醇溶解，定容后進液相色譜測試。

HPLC儀器主要工作參數(shù) 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6×2.5 μm，250 mm，柱溫：30oC，進樣量：10 μL，流速：0.8 mL/min， 流動相：甲醇/水/乙腈=23/41/36(V/V/V)，檢測波長：227 nm。

3.4 體外微粒測試模型

使用ASTM F2394-07，X.2.4模型，按手術(shù)流程依次置入導(dǎo)絲、導(dǎo)管，在導(dǎo)管末端連接適宜內(nèi)徑的硅膠管，作為球囊擴張靶部位。頭端連接蠕動泵用于輸送介質(zhì)，選擇恒溫為(37±2) ℃的生理鹽水作為介質(zhì)，模型浸沒其中。

3.5 體外微粒測試實施步驟

沿導(dǎo)絲推送球囊導(dǎo)管到硅膠管部位，迅速充盈球囊至名義壓力，卸壓后回撤球囊，并持續(xù)沖刷鞘管，收集模擬使用過程中產(chǎn)生的微粒懸浮液。設(shè)置自定義通道 10 μm、25 μm、50 μm、100 μm，將待測懸浮液置于取樣口測試。

量取均勻的10 mL待測懸浮液，傾倒入量筒式微量砂芯漏斗中，真空泵抽吸，微粒被截獲在微孔濾膜上，再使用EZ4 HD數(shù)碼體視鏡對微孔濾膜拍照，并將所有照片無縫合成為一張完整的照片。打開Image-Pro Plus軟件，選擇“area”和“feret（max）”二個參數(shù)，并分別將最小閾值設(shè)定為7 850和100，則可以自動輸出所有符合設(shè)定要求的微粒的具體尺寸數(shù)據(jù)。

4 結(jié)果

使用三種配方的藥物球囊，規(guī)格為3.0 mm×40 mm，在體外測試模型下，分別用離體豬血管和硅膠管做轉(zhuǎn)載率試驗，結(jié)果如圖1顯示，模擬血管的轉(zhuǎn)載率為4.23%±0.64%、12.34%±2.47%、16.62%±5.21%，硅膠管測試的轉(zhuǎn)載率1.5 3%±0.1 6%、2.66%±0.35%、3.15%±0.78%。硅膠管測試的結(jié)果區(qū)分度不如離體豬血管。

圖1 不同配方使用不同模擬血管的轉(zhuǎn)載率Fig.1 Drug transfer rate of different formulations using different simulated vessels

使用自制的藥物球囊，體外模擬藥物釋放的每個過程，結(jié)果如圖2所示。輸送過程損失為47.42%±4.72%。擴張過程損失為24.27%±4.45%，模擬使用轉(zhuǎn)載率為12.29%±3.44%，回撤過程損失7.61%±4.65%，球囊撤出導(dǎo)管后最終殘留在球囊表面的藥物含量10.81%±3.55%。各部分的藥物比例總和為102.40%，達到物料平衡。

圖2 體外模擬各過程的藥物釋放Fig.2 Drug release from drug coated balloon during each process in vitro simulate use

對配方2和配方3的藥物球囊分別進行微粒測試，數(shù)據(jù)如表1所示。除常規(guī)≥10 μm，≥25 μm的數(shù)據(jù)外，通過細分通道可以進一步得出≥50 μm，≥100 μm的數(shù)據(jù)，這使得對25 μm以上的微粒的分布有了進一步的認識。另外，對收集的微粒懸浮液，進行顯微法聯(lián)合Image-Pro Plus軟件定量分析，可以獲得大尺寸微粒的具體信息，如表2和圖3、圖4所示。雖然大尺寸微粒的數(shù)目相似，但具體尺寸的大小卻不盡相同。

5 討論

藥物球囊的開發(fā)過程中，轉(zhuǎn)載率是關(guān)乎產(chǎn)品有效性的重要指標，不管球囊表面初始負載的藥物密度如何，也不論涂層配方中使用了何種添加劑，或使用了何種藥物涂覆工藝，真正起到抑制平滑肌細胞增生和遷移作用的，是轉(zhuǎn)載到血管表面并被血管組織攝取的藥物。而在球囊導(dǎo)管輸送及擴張的使用過程中，都不可避免地產(chǎn)生了大量的微粒，脫落的微粒隨血流沖刷至下游血管，可能造成血管堵塞。因此，微粒脫落是藥物球囊產(chǎn)品安全性的重點評估項目。大多數(shù)研究者都意識到了上述二個重要研究內(nèi)容，然而筆者發(fā)現(xiàn)文獻報道的一些體外評估方法都有著不同的缺陷，該文嘗試解決這些問題并帶來一些益處，具體如下：

表1 光阻法微粒測試數(shù)據(jù)的對比圖Tab.1 Comparison of particle test data using the light obscuration particle count test

表2 顯微法聯(lián)合Image-Pro Plus測試微粒數(shù)據(jù)Tab.2 Microscopic combined Image-Pro Plus particle count test data

圖3 配方2微粒測試顯微法圖片F(xiàn)ig.3 Formulation 2 microscopic combined Image-Pro Plus particle test image

圖4 配方3微粒測試顯微法圖片F(xiàn)ig.4 Formulation 3 microscopic combined Image-Pro Plus particle test image

（1）部分研究的體外轉(zhuǎn)載試驗使用了硅膠管作為模擬血管，而硅膠管與在體狀態(tài)的血管的性能差異很大，特別是血管內(nèi)皮對藥物涂層的吸附能力、血管的彈性、血管的解剖結(jié)構(gòu)等。另外體外模擬研究多使用F-2394-07模型，這與產(chǎn)品實際作用部位不同。這都會導(dǎo)致體外評估的藥物轉(zhuǎn)載能力與真實轉(zhuǎn)載能力有較大的差異。本單位使用新鮮的豬冠脈血管作為體外模擬測試的模擬血管，并采用自制的外周體外測試模型開展體外測試，該方法與產(chǎn)品實際使用情況更加接近，模擬程度更高，因而結(jié)果更加可靠。

（2）對于體外藥物釋放過程，大多研究者只關(guān)注了輸送過程損失率，藥物轉(zhuǎn)載率和藥物殘留率。而藥物球囊導(dǎo)管到達靶部位以后，從開始擴張到與血管壁接觸的過程中，仍然會有藥物脫落。真正有機會被血管攝取的藥物，是在球囊與血管壁接觸瞬間前，球囊表面所攜帶的藥物。擴張的過程雖然很短，但擴張過程損失的藥量不可忽視。另外，球囊回撤過程期間，亦會有藥物涂層脫落。忽視了這二個細節(jié)，將導(dǎo)致很難做到物料平衡。該文除了評估輸送過程的藥物損失、轉(zhuǎn)載率和殘留率以外，還評估了擴張過程和回撤過程的藥物損失，解決了藥物球囊使用過程涂層的物料平衡問題。

（3）按文獻報道的通道設(shè)置測試的微粒結(jié)果稍單一，只有大于10 μm和25 μm的微粒數(shù)目。該文細化微粒測試的通道，進一步細分50 μm，100 μm等通道的微粒，同時采用顯微法，并輔助利用Image-Pro Plus軟件，自動測算每一個微粒的尺寸參數(shù)。相比于公開的數(shù)據(jù)，該文開發(fā)的評價方法，獲得的數(shù)據(jù)更加詳實，對微粒的粒徑分布、形態(tài)的描述更加細致。

然而，該研究仍然存在一些局限性，比如：①體外轉(zhuǎn)載測試所使用的血管，測試時成自然伸長狀態(tài)，與體內(nèi)真實的立體結(jié)構(gòu)仍有差異；體外的即時轉(zhuǎn)載率并沒有與動物體內(nèi)試驗做對比，不能完全代表產(chǎn)品在體內(nèi)的有效性。②對微粒的體外描述比較詳實，但并沒有深入研究不同尺寸涂層微粒在體內(nèi)的行為變化。

6 結(jié)論

使用自制的股髂動脈模型，且遠端連接豬冠脈血管，用于評估藥物球囊體外轉(zhuǎn)載能力的方法可行，相對于使用硅膠管作為模擬血管，該方法的分辨率更高。對于模擬使用過程藥物釋放的研究顯示，球囊擴張和回撤階段釋放的藥物總量不可忽視，研究擴張和回撤過程的藥物釋放情況，有助于更深入地掌握藥物球囊的釋放行為。光阻法結(jié)合顯微法用于表征微粒脫落的水平，并結(jié)合Image-Pro Plus軟件實現(xiàn)自動計數(shù)，比單純使用光阻法獲得的信息更加細致。以上針對藥物釋放及微粒脫落的研究方法與思路，特別適合于產(chǎn)品開發(fā)期間配方篩選、工藝優(yōu)化、質(zhì)量控制方面。

[1] Tepe G, Zeller T, Albrecht T, et al. Local delivery of paclitaxel to inhibit re-stenosis during angioplasty of the leg[J]. N Engl J Med, 2008, 358(7): 689-699.

[2] Liistro F, Grotti S, Porto I, et al. Drug-eluting balloon in peripheral intervention for the superf i cial femoral artery: the DEBATE-SFA randomized trial[J]. Jacc Cardiovasc Intervent, 2013, 6(12): 1295-1302.

[3] Werk M, Langner S, Reinkensmeier B, et al. Inhibition of restenosis in femoropopliteal arteries: paclitaxel-coated versus uncoated balloon: femoral paclitaxel randomized pilot trial[J]. Circulation, 2008, 118(3): 1358-1365.

[4] BS EN ISO 12417-1:2015, Cardiovascular implants and extracorporeal systems - Vascular device-drug combination products[S]. BSI Standards Publication, 2015.

[5] Seidlitz A, Kotzan N, Nagel S, et al. In vitro determination of drug Transfer from drug-coated balloons[J]. PLOS ONE, 2013, 8(12): e83992.

[6] Kelsch B, Scheller B, Biedermann M, et al. Dose response to paclitaxel-coated balloon catheters in the porcine coronary overstretch and stent implantation model[J]. Invest Radiol, 2011, 46(4): 255-263.

[7] Kaule S, Minrath I, Stein F, et al. Correlating coating characteristics with the performance of drug-coated balloons-a comparative in vitro investigation of own established hydrogel-and ionic liquidbased coating matrices[J]. PLOS ONE, 2015, 10(3): e0116080.

In Vitro Evaluation Method for Drug Release and Particle Release from Drug Coated Balloon

drug coated balloon, drug release, particle release, drug transfer, in vitro evaluation

R965

A

10.3969/j.issn.1671-7104.2017.02.017

1671-7104(2017)02-0140-04

2016-10-13

深圳市科技創(chuàng)新委員會戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)（生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展）專項資金（CXZZ20140813102720940）；國家食藥監(jiān)總局創(chuàng)新醫(yī)療器械特別審批綠色通道項目（2015061）

宋精忠，E-mail: songjingzhong@lifetechmed.com

龍漢，E-mail: longhan@lifetechmed.com