婁序笙，胡京紅，葛東宇，魯衛(wèi)星△

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(北京100029),2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心(北京100029)

金銀花對(duì)病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶的影響*

婁序笙1，胡京紅2，葛東宇2，魯衛(wèi)星1△

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科(北京100029),2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心(北京100029)

目的： 探討金銀花對(duì)于CVB3 病毒感染小鼠心肌損傷模型的保護(hù)作用。方法：將CVB3病毒在HeLa細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一段時(shí)間后測(cè)定細(xì)胞的半數(shù)感染量，將CVB3病毒培養(yǎng)液接種在小鼠腹腔內(nèi)，借此創(chuàng)建VMC模型。小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組，模型組，金銀花低劑量組、金銀花高劑量組，灌胃給藥3周。應(yīng)用酶聯(lián)免疫法檢測(cè)各組感染小鼠體內(nèi)3 種心肌酶(磷酸肌酸激酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶)在血清中的釋放量;并將其心肌組織進(jìn)行HE染色，觀察其形態(tài)學(xué)病理變化。結(jié)果：金銀花低劑量組、高劑量組對(duì)于血清LDH、AST、CK含量具有明顯抑制作用(P<0.05)，金銀花能減小心肌炎癥對(duì)周圍的浸潤(rùn)范圍，有效抑制心肌炎病情的惡化，保護(hù)心肌組織。結(jié)論：金銀花可以有效抑制機(jī)體內(nèi)VMC 病毒的擴(kuò)散, 對(duì)防治感染程度較輕的小鼠VMC具有一定的效果。

病毒性心肌炎(Viral myocarditis ,VMC) 系病毒在臨床上主要會(huì)誘發(fā)心肌局灶性或彌漫性病變,而感染范圍最大的嗜心肌病毒為柯薩奇B3 病毒(CVB3)[ 1-2 ]?？滤_奇B3 病毒感染以心衰和心律失常為主要的臨床表現(xiàn),心肌炎癥多屬于慢性疾病，嚴(yán)重者可引起擴(kuò)張型心肌病。 VMC發(fā)病有增多趨勢(shì),尤其在兒童及青壯年中發(fā)病率高?，F(xiàn)階段，治療VMC多以采取支持療法和綜合療法為主,包括輔酶Q10治療、補(bǔ)充維生素 C、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、營(yíng)養(yǎng)心肌等。但西藥治療VMC存在費(fèi)用高、副作用大、療效不確切的缺點(diǎn)，雖有成效，效果卻差強(qiáng)人意。目前臨床上尚未研發(fā)出治療VMC的特效藥，也無有效的治療手段。最新研究成果表明，對(duì)VMC采用中藥療法具有一定的效果,因此尋找并提取中藥中抗CVB3 的有效活性成分,成為治療VMC 的最新趨勢(shì)[ 3-4 ]。

金銀花為忍冬科Caprifoliaceae 植物忍冬Lonicera japonica Thunb等的干躁花蕾或帶初開的花[1]，其制劑味甘、性寒，主要經(jīng)入肺、胃、大腸經(jīng)發(fā)揮療效。通常采自其尚未完全開放的花蕾，經(jīng)晾后炒用，是一味常見中藥材，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功效，金銀花可沖泡亦可煎汁服用，自古以清熱解毒之良藥廣為稱道,其水煎劑對(duì)很多病毒均有一定的抑制作用。例如，將比例為1∶20的金銀花水煎劑用于人體腎原上皮細(xì)胞的組織培養(yǎng)，可抑制皰疹病毒和流感病毒的復(fù)制與擴(kuò)散。本文擬探討金銀花對(duì)病毒性心肌炎小鼠血清心肌酶的影響。

材料與方法

1 材 料

1.1 將CVB3Nancy病毒株設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)株, 置于-80 ℃冰箱中保存, 實(shí)驗(yàn)前活化病毒，并在HeLa 細(xì)胞中至少進(jìn)行3 次傳代凍融,將復(fù)蘇增殖后的病毒用Reed-Muench 微量法滴定,實(shí)驗(yàn)用100 T CID50/ ml的滴度。

1.2 藥品與試劑：采用南京建成生物工程研究所生產(chǎn)的血清肌酸激酶測(cè)定試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)20041012)、乳酸脫氫酶測(cè)定試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)20041013)與天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒(產(chǎn)品批號(hào)20041017)中藥金銀花購(gòu)自北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院中藥房，藥品批號(hào)1102023，金銀花煎液:將中藥房金銀花常規(guī)煎煮3次,過濾去渣,混合,再濃縮配成0. 5kg/L 和1 kg/L的煎液。

1.3 動(dòng)物與儀器：純種BALB/ c 小鼠,雄性,鼠齡4～6周,體重14～16g ,飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)飼養(yǎng)室。

實(shí)驗(yàn)儀器：電子天平，日本東京A&D company，型號(hào)ER-182A；全自動(dòng)生化分析儀，日立公司，型號(hào)7600；低溫離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf AG 型號(hào)：centrifuge5810 R； Tecan Safire2型自動(dòng)酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，瑞士TECAN公司。

2 方 法

2.1 動(dòng)物分組及給藥：隨機(jī)取180只實(shí)驗(yàn)小鼠分成四組，每組45只，分別設(shè)為金銀花低劑量組、高劑量組、模型對(duì)照組和正常對(duì)照組，除正常對(duì)照組外每組小鼠每只腹腔無菌注射 0.1 ml 1. 0 ×10-5CVB3病毒 , 誘導(dǎo)小鼠VMC 模型,在隔離實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)。正常對(duì)照組小鼠每只腹腔無菌注射不含CVB3的MEM Eagle’s 液0.1 ml，飼養(yǎng)于常規(guī)實(shí)驗(yàn)室。接種病毒0.5小時(shí)采用灌胃法給藥，金銀花低劑量組以0. 5 kg/L 金銀花煎液灌胃;金銀花高劑量組以1 kg/L的金銀花煎液灌胃; 模型對(duì)照組及正常對(duì)照組均以1 kg/L生理鹽水灌胃。各組按0.025 ml /g灌胃, 1次/d,連續(xù)21d。每組于接種病毒后7d、14d、21d處死。取心臟和血清標(biāo)本。

2.2 一般觀察：觀察記錄實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物的興奮性，糞便情況，進(jìn)食進(jìn)水量，毛發(fā)狀態(tài)和呼吸系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等生理狀況，并統(tǒng)計(jì)小鼠死亡數(shù)量。

2.3 血清心肌酶測(cè)定:接種病毒時(shí)間定為第0天，至第7天、第14天、第21天時(shí)隨機(jī)從各組取15只小鼠，于眼眶采血后處死小鼠留取心臟，將血1 500 r/min 離心15 min ,收血清采用HITACHI-7600全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定3 種心肌酶(磷酸肌酸激酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶)在血清中的釋放量。按試劑盒說明書操作。

2.4 組織病理學(xué)檢查:各組小鼠處死后留取心臟，稱重后沿左心室長(zhǎng)軸切開，用10%甲醛固定后石蠟包埋切片，對(duì)組織切片進(jìn)行HE染色,并觀察組織損傷、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及心肌細(xì)胞損傷的程度。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，兩組計(jì)量結(jié)果比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 小鼠一般狀態(tài)觀察，在活動(dòng)度、毛色及造模后開始死亡的最早時(shí)間方面，金銀花治療組明顯好于模型組,兩組金銀花治療組之間比較,差別不明顯,見表1。

表1 各組小鼠總實(shí)驗(yàn)數(shù)整體觀察記錄

注：活動(dòng)度：話動(dòng)頻繁，攀籠；話動(dòng)，攀籠少；活動(dòng)．有蜷縮；+活動(dòng)少，蜷縮。毛色：光滑致密；偶見疏松；+疏松不澤

2 各組小鼠血清心肌酶CK、AST、LDH含量測(cè)定結(jié)果 各組小鼠在第7天、第14天、第21天模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較，CK、AST、LDH含量均升高，金銀花治療組與模型對(duì)照組比較，以上指標(biāo)含量均降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而金銀花治療進(jìn)行組間比較，結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05),見表2。

表2 各組小鼠第7天、第14天、第21天血清心肌酶CK、AST、LDH含量測(cè)定結(jié)果(U/L)

注：與正常對(duì)照組比較，*P<0.05;與模型對(duì)照組比較，△P<0.05

3 心肌組織病理學(xué)觀察 3.1 HE染色顯示：模型對(duì)照組，小鼠心肌細(xì)胞從第7天出現(xiàn)腫脹，胞質(zhì)染色嗜酸性增強(qiáng)，細(xì)胞橫紋模糊，以及間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，核碎裂的病理變化。第14天病理檢測(cè)結(jié)果示部分心肌細(xì)胞的胞質(zhì)染色嗜酸性增強(qiáng)、均質(zhì)化。心肌組織壞死范圍加大，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)加重，出現(xiàn)心肌細(xì)胞邊界模糊，心肌組織嚴(yán)重出血的現(xiàn)象，病理變化達(dá)最高峰；第21天病理檢測(cè)示炎性病灶開始吸收，代之以纖維化。金銀花治療組，第7、14天心肌細(xì)胞輕度變性，周圍有散在炎細(xì)胞浸潤(rùn)；心肌細(xì)胞變性壞死程度比模型對(duì)照組減輕；第21天心肌細(xì)胞固縮，壞死，纖維化少見。金銀花治療組心肌炎癥及壞死程度減輕。見圖1。

圖1 各組心肌組織病理學(xué)觀察 (HE染色,40×)

中醫(yī)文獻(xiàn)中對(duì)于VMC的命名并無明確的記載，在《國(guó)標(biāo)·中醫(yī)臨床診療術(shù)語(yǔ)疾病部分》中的記載中有名為“心癉”的疾病，臨床表現(xiàn)和發(fā)病機(jī)理與VMC相似，也有一些學(xué)者將本病歸到“胸痹”“心悸”的范疇。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明金銀花能使心肌酶濃度下降，可保護(hù)心肌細(xì)胞免受損傷。本次研究主要檢測(cè)存在于心肌酶中的CK-MB、CK及LDH的含量。CK在動(dòng)物的肌肉、心臟及腦組織中廣泛存在，在人體能量代謝中發(fā)揮重要的作用。CK在VMC病發(fā)過程中最早出現(xiàn)并迅速升高，是檢測(cè)心肌損傷程度的指標(biāo)。CK存在于心肌中的同工酶CK-MB 也可以反映心肌損傷程度，可借此對(duì)心肌損害進(jìn)行早期早期診斷。LDH是一種糖酵解酶，在機(jī)體組織細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)廣泛存在，其中在腎臟含量較高。

金銀花治療后小鼠心肌標(biāo)本采樣病理評(píng)分較模型對(duì)照組下降明顯，金銀花高劑量組比金銀花低劑量組病理評(píng)分下降明顯，證明金銀花可有效保護(hù)心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能，減輕病毒感染的破壞程度。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明金銀花對(duì)VMC小鼠有很好的治療作用，為進(jìn)一步提取有效成分打下基礎(chǔ)。

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(收稿：2016-11-09)

Effect of honeysuckle on serum myocardial enzyme in mice with viral myocarditis

Lou Xusheng，Hu Jinghong，Ge Dongyu，et al.

Department of Cardiology,The 3rd Hospital Affiliated Beijing University of Chinese Medicine (Beijing 100029)

Objective：To investigate the protective effect of honeysuckle on the myocardial injury model of CVB3 virus infection in mice . Methods: CVB3 virus was cultured in HeLa cell culture medium. After a period of time, the amount of half of the cells was measured. The CVB3 virus was inoculated into the abdominal cavity of mice, which was created by VMC. The mice were randomly divided into normal control group, model group, low dose group and high dose group of honeysuckle, and 3 weeks of administration of the drug. Mice were detected by enzyme-linked immunosorbent assay in 3 infected myocardial enzymes (creatine kinase and aspartate aminotransferase, lactate dehydrogenase) release in the serum were collected;and the myocardial tissue HE staining to observe the morphological and pathological changes. Results:The honeysuckle low dose group and high dose group has obvious inhibitory effect on serum LDH, AST and CK content (P< 0.05), can reduce the inflammatory infiltration of honeysuckle in the surrounding area, effectively inhibit the deterioration of myocarditis condition, myocardial protection.Conclusion:It has been demonstrated that honeysuckle could control the activities about LDH , AST , and CK,have potent antivirus activities against CVB3 in vivo.

Myocarditis/traditional chinese medicine thearpy Flos Lonicerae Japonicae Adenoviruses Animal experimentation Mice

*北京中醫(yī)藥大學(xué)中青年教師資助項(xiàng)目(2011JYBZZJS-030)

心肌炎/中醫(yī)藥療法 金銀花 病毒 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠

R542.21

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.04.062

△通訊作者