于春娣，邵澤平，張燕，王碩，*

（1.教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津300457；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

模擬體系中Ph IP的產(chǎn)生規(guī)律及抑制作用研究

于春娣1，2，邵澤平1，張燕1，王碩1，*

（1.教育部食品營(yíng)養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué)，天津300457；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島266109）

雜環(huán)胺（Heteryclic Aromatic Amines，HAAs）是富含蛋白質(zhì)的食物在烤、炸、煎等熱加工過程中產(chǎn)生的一類有害物質(zhì)，在Ames實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出潛在的致突變性和致癌性。以日常熱加工肉類食品中產(chǎn)生量最多的雜環(huán)胺PhIP（2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine）為研究對(duì)象，考察了在溶液模擬體系中，不同摩爾量的前體物質(zhì)，加熱溫度和加熱時(shí)間下PhIP的產(chǎn)生規(guī)律。采取超聲波輔助提取了甘薯葉中的黃酮類物質(zhì)，提取物對(duì)模擬體系中PhIP生成具有明顯的抑制作用，抑制率為67.31%。其抑制率大小高于槲皮素、蘆丁、甘草素和葛根素。

模擬體系；雜環(huán)胺；甘薯葉；黃酮類物質(zhì)

近年來，人們對(duì)食品安全的關(guān)注程度不斷提升，不僅關(guān)注食品中的農(nóng)藥殘留和獸藥殘留等各種化學(xué)性危害，食品加工過程中所帶來的安全問題也逐漸進(jìn)入人們的視野，其中，在高溫加熱肉類食品時(shí)出現(xiàn)的一類具有潛在強(qiáng)致癌性和致突變性的物質(zhì)——雜環(huán)胺，最近三十年受到全世界科學(xué)家們的關(guān)注[1]。雜環(huán)胺是一類帶雜環(huán)的伯胺，主要是由含蛋白質(zhì)豐富的食物（尤其是肉類食品）在烤、炸、煎過程中，蛋白質(zhì)和氨基酸發(fā)生熱解反應(yīng)產(chǎn)生的，至今，在烹調(diào)的各類食品中發(fā)現(xiàn)并分離鑒定出超過30種的雜環(huán)胺[1]。雜環(huán)胺類化合物具有致突變性和致癌性的特殊毒性作用，是目前通過Ames實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到的最有突變活力的化合物，致突變能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于多環(huán)芳烴（PAHs），其中有大多數(shù)已被證明可致使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的器官組織生成多種腫瘤[2]。國(guó)際腫瘤研究機(jī)構(gòu)（IARC）把雜環(huán)胺2-amino-3，8-dimethylimidazo[4，5-f]quinoxaline（MeIQx）和PhIP劃分為可能致癌物（2B）[3]。

在人類的日常飲食生活中，幾乎每天都會(huì)食用高溫加工的肉類食品，雜環(huán)胺的攝入就無法避免，因此，如何減少人類日常飲食中雜環(huán)胺的產(chǎn)生，以及如何避免雜環(huán)胺的攝入引起的人類健康隱患，成為目前迫切需要解決的食品安全問題。在PhIP的模擬體系中添加黃酮類物質(zhì)是一種簡(jiǎn)單實(shí)用的抑制PhIP形成的方法。黃酮類物質(zhì)來源廣泛，主要來自于水果、蔬菜、茶、葡萄酒、植物的種子或是植物根，獲得方法也較為簡(jiǎn)單。黃酮類物質(zhì)作為天然抗氧劑的一種，對(duì)雜環(huán)胺的生成影響比較大。近年來，國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有許多研究人員報(bào)道了在肉類食品加工過程中加入黃酮類物質(zhì)可以有效抑制雜環(huán)胺的形成。Ka-Wing Cheng等[4]實(shí)驗(yàn)證實(shí)了柚皮素對(duì)PhIP具有抑制作用，我們研究小組也發(fā)現(xiàn)了幾種黃酮類物質(zhì)對(duì)PhIP的生成具有抑制作用[5]。

甘薯葉大多數(shù)被廢棄，但是，甘薯葉中含有大量的黃酮類物質(zhì)，這些物質(zhì)具有抗氧化、抗癌、抗突變、增強(qiáng)免疫力等作用?；诟适砣~黃酮類物質(zhì)的這些作用，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取了甘薯葉中的黃酮類物質(zhì)，以日常熱加工肉類食品中產(chǎn)生量最多的PhIP為研究對(duì)象，考察了在溶液模擬體系中，甘薯葉黃酮類物質(zhì)對(duì)其生成量產(chǎn)生的影響，并與槲皮素，蘆丁，甘草素和葛根素對(duì)PhIP的生成量影響進(jìn)行了比較。為進(jìn)一步開發(fā)利用甘薯葉這一資源提供科學(xué)的理論依據(jù)，為實(shí)現(xiàn)食品熱加工過程中PhIP的有效控制提供應(yīng)用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

PhIP標(biāo)準(zhǔn)品：加拿大Toronto公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：日本TCI公司；色譜純甲醇：德國(guó)Merck公司；槲皮素、葛根素、甘草素、甲酸和甲酸銨：百靈威科技有限公司（上海）；乙酸銨、二甘醇、肌酐和苯丙氨酸：美國(guó)sigma公司；乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁和亞硝酸鈉等均購(gòu)于天津國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

甘薯葉購(gòu)于山東省萊陽(yáng)市一農(nóng)家（2013年9月），將新鮮的甘薯葉洗凈后，曬干，粉碎，用80目篩過后置于干燥器內(nèi)，待用。

HyperSep C18（200mg/5mL）：美國(guó)Thermo Scientific公司；丙磺酸陽(yáng)離子交換柱（200mg/5mL）：加拿大SILICYCLE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent6410三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（電噴霧離子源ESI）：美國(guó)Agilent公司；Milli-Q純水儀：美國(guó)Millipore公司；干浴加熱器（SBH200D/3）：英國(guó)BIBBY公司；固相萃取儀：美國(guó)SUPELCO公司；紫外可見分光光度計(jì)：上海尤尼柯儀器有限公司；酸度儀：瑞士METTLER-TOLEDO公司。

1.3 甘薯葉黃酮類物質(zhì)的提取與含量測(cè)定方法

在王玫等[6]的提取甘薯葉中的黃酮方法的基礎(chǔ)上，進(jìn)行了改動(dòng)，主要步驟為：稱取5.0 g甘薯葉粉末于250mL具塞錐形瓶中，加入200mL 80%乙醇溶液，浸泡過夜，超聲波輔助提取40min后，靜置離心分離，上清液用AB-8大孔樹脂柱層析，洗脫液采用鋁鹽顯色——可見分光光度法，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，測(cè)定甘薯葉中的總黃酮含量。測(cè)完總黃酮含量后，洗脫液冷凍干燥4℃保存。

1.4 PhIP液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）定量分析方法

參照Z(yǔ)hang等的方法[7]，采用丙磺酸陽(yáng)離子交換柱和C18柱串聯(lián)的固相萃取方法，對(duì)模擬體系反應(yīng)液中的PhIP進(jìn)行分離，凈化和富集。固相萃取最后洗脫液氮?dú)獯蹈珊?，?mL色譜純甲醇復(fù)溶，離心，過0.22μm有機(jī)微孔過濾膜，置于液相進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)行HCLCMS/MS分析測(cè)定PhIP的含量。HCLC-MS/MS分析條件：使用Zorbax Eclipse Plus C18液相色譜柱（2.1× 150mm），柱溫箱控制在25℃，流動(dòng)相由乙腈（A）和甲酸銨/甲酸（B）溶液（pH 3.5）組成，流速為0.2mL/min，采用梯度洗脫程序：第0min時(shí)，A占10%；第10min時(shí)，A升至60%；第14min時(shí)，A降到10%。后運(yùn)行時(shí)間為9min。離子源為ESI；采用正離子掃描和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）模式。主要工作參數(shù)為：霧化氣（氮?dú)猓毫?0 psi；毛細(xì)管電壓為4 000 V。干燥氣（氮?dú)猓┝魉俸蜏囟确謩e為10 L/min和350℃；駐留時(shí)間為90ms。

1.5 溶液模擬體系中PhIP的產(chǎn)生規(guī)律

采用肌酐和苯丙氨酸為前體物質(zhì)，二甘醇水溶液為溶劑建立PhIP的模擬體系，通過單因素實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)考察反應(yīng)前體物質(zhì)比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)PhIP生成量的影響。

1.6 模擬體系中黃酮類物質(zhì)對(duì)PhIP形成的影響

在PhIP的模擬體系中，添加等量（5mg）的槲皮素，蘆丁，甘草素，葛根素和提取的甘薯葉黃酮類物質(zhì)，以不添加黃酮類物質(zhì)的模擬體系為空白對(duì)照組，用預(yù)熱后的干浴加熱器130℃加熱2 h。LC-MS/MS測(cè)定其PhIP含量，與無黃酮類物質(zhì)的空白對(duì)照組產(chǎn)生的PhIP含量進(jìn)行比較，計(jì)算出各黃酮類物質(zhì)對(duì)PhIP的抑制率，通過抑制率比較各黃酮類物質(zhì)對(duì)PhIP形成的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯葉總黃酮類物質(zhì)的提取率

采用乙醇為提取溶劑，超聲波輔助提取，優(yōu)化提取時(shí)間，提取溫度，料液比等提取條件，制得總黃酮粗提物，進(jìn)一步采用AB-8大孔樹脂柱層析純化得甘薯葉黃酮類物質(zhì)提取物。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，鋁鹽顯色——可見分光光度法測(cè)定甘薯葉總黃酮含量，以吸光度值為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程為：Y=0.121 2X+0.002，R2= 0.999 6。實(shí)驗(yàn)所制備的甘薯葉總黃酮的提取率為8.32%，純度達(dá)62.15%。

2.2 溶液模擬體系下PhIP的產(chǎn)生規(guī)律

2.2.1 前體物質(zhì)的量對(duì)PhIP形成的影響

2.2.1.1 肌酐的量對(duì)PhIP形成的影響

在3mL二甘醇水溶液（含水14%）中，固定苯丙氨酸的量為0.1mmol，肌酐的量分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mmol，130℃加熱2 h，研究肌酐的量對(duì)溶液模擬體系中PhIP形成的影響，每個(gè)肌酐濃度下重復(fù)3次試驗(yàn)，通過單向方差分析和鄧肯檢驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果有顯著差異（P＜0.05），如圖1所示。

圖1 肌酐的量對(duì)溶液模擬體系中Ph IP形成的影響Fig.1 Theeffectof creatinineon the form ation of Ph IP in solutionmodelsystem

研究發(fā)現(xiàn)（圖1），隨著肌酐量的增加，PhIP的生成量先增加后減少，當(dāng)肌酐和苯丙氨酸的量都為0.1mmol時(shí)，PhIP產(chǎn)生量最多；肌酐的量從0.1mmol增加到0.2mmol時(shí)，PhIP的生成量出現(xiàn)明顯的降低；再增加肌酐的量時(shí)，PhIP的生成量基本保持不變。

2.2.2.2 苯丙氨酸的量對(duì)溶液模擬體系中PhIP形成的影響

設(shè)定苯丙氨酸的量分別為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mmol，固定肌酐的量為0.1mmol，將苯丙氨酸和肌酐加入到3mL二甘醇水溶液（含水14%）中，130℃加熱2 h，研究苯丙氨酸的量對(duì)模型體系中PhIP形成的影響，每個(gè)苯丙氨酸濃度下重復(fù)3次試驗(yàn)，通過單向方差分析和鄧肯檢驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)結(jié)果有顯著差異（P＜0.05），如圖2所示。

圖2 苯丙氨酸的量對(duì)溶液模擬體系中Ph IP形成的影響Fig.2 Theeffectof phenylalanineon the form ation of Ph IP in solutionmodelsystem

通過圖2研究發(fā)現(xiàn)，隨著苯丙氨酸的量的增加PhIP的生成量先增加，而后基本不變，當(dāng)苯丙氨酸和肌酐的量都為0.1mmol時(shí)，PhIP產(chǎn)生量最多。

2.2.2 加熱溫度對(duì)PhIP形成的影響

選擇苯丙氨酸和肌酐為0.1mmol，加熱時(shí)間為2h?？疾觳煌訜釡囟龋?00、130、160、180、200℃），溶液模擬體系中PhIP形成的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 加熱溫度對(duì)溶液模擬體系中Ph IP形成的影響Fig.3 Theeffectofheating tem peratureon the formation of Ph IP in solutionmodelsystem

由圖3可知在模擬體系中加熱溫度對(duì)PhIP的生成量有顯著的影響，當(dāng)加熱溫度從100℃升高到200℃之間，隨著溫度的升高，PhIP的生成量不斷增加，反應(yīng)溫度低于130℃時(shí)，PhIP的生成速度緩慢；當(dāng)溫度大于130℃時(shí)，PhIP的生成量增加迅速。

2.2.3 加熱時(shí)間對(duì)PhIP形成的影響

綜合考慮實(shí)際烹調(diào)溫度，選擇130℃加熱，分別考察不同加熱時(shí)間（30、60、90、120、150min）對(duì)PhIP形成的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 加熱時(shí)間對(duì)溶液模擬體系中Ph IP形成的影響Fig.4 Theeffectof heating timeon the form ation of Ph IP in solutionmodelsystem

結(jié)果表明，PhIP的生成量隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增加，其中加熱時(shí)間從1 h增加到2 h時(shí)，PhIP的生成量增加迅速，當(dāng)加熱時(shí)間超過2 h后，PhIP的生成量增加緩慢。

2.3 甘薯葉黃酮對(duì)PhIP形成的影響

采用0.1mmol肌酐和0.1mmol苯丙氨酸，溶于3mL的二甘醇-水溶液（含水14%）中，130℃加熱2 h的模擬體系，研究甘薯葉黃酮提取物對(duì)抑制PhIP的抑制作用，同時(shí)與槲皮素、蘆丁、甘草素、葛根素的抑制作用進(jìn)行比較。結(jié)果見表1。

表1 五種黃酮類物質(zhì)（5mg）對(duì)Ph IP的抑制率（n=3）Table1 The inhibition of Ph IPwith five flavonoids（5mg）（n=3）

在溶液模擬體系中加入相同質(zhì)量（5mg）的五種黃酮類物質(zhì)，對(duì)PhIP的產(chǎn)生均有不同程度的抑制作用，五種黃酮類物質(zhì)對(duì)PhIP的抑制率順序是：甘薯葉黃酮類物質(zhì)＞蘆?。鹃纹に兀靖什菟兀靖鸶亍｜S酮抑制PhIP的作用早有研究報(bào)道，不同的黃酮結(jié)構(gòu)不同，其抗氧化能力、清除自由基能力不同，因此對(duì)PhIP的抑制率有所不同。研究發(fā)現(xiàn)，在所研究的五種黃酮類物質(zhì)中，實(shí)驗(yàn)制備的甘薯葉黃酮對(duì)PhIP的抑制率最高（67.31± 1.56）%，表現(xiàn)出很強(qiáng)的PhIP抑制能力，這可能是由于甘薯葉黃酮為多種黃酮類物質(zhì)的混合物，不同活性組分協(xié)同作用的結(jié)果，可進(jìn)一步分離鑒定甘薯葉黃酮組分，明確單組分對(duì)PhIP的抑制活性。

3 結(jié)論與討論

本研究通過考察反應(yīng)前體物質(zhì)比例、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)PhIP生成量的影響，研究了模擬體系下PhIP產(chǎn)生的產(chǎn)生規(guī)律：在3mL的二甘醇水溶液（含水14%）中，當(dāng)肌酐和苯丙氨酸的量都為0.1mmol，在130℃下加熱2 h時(shí)PhIP的產(chǎn)生量最多。溶液模擬體系接近于實(shí)際肉類食品體系，簡(jiǎn)化了PhIP的分析過程，排除了肉類食品中其他成分對(duì)雜環(huán)胺生成的影響，為后期研究雜環(huán)胺的生成和抑制機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。

許多研究表明，黃酮類物質(zhì)對(duì)PhIP有明顯的抑制作用，例如，Weisburger等[9]研究表明，大豆苷元和染料木素均可以抑制PhIP的形成；Oguri等[10]證實(shí)了表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素等黃酮類物質(zhì)減少了80%的PhIP的生成，Cheng等[11]綜合考察了多種黃酮類物質(zhì)對(duì)模擬體系和牛肉餅中PhIP的抑制效果，發(fā)現(xiàn)柚皮素、根皮苷和槲皮素能明顯抑制PhIP的生成，這些與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。本試驗(yàn)提取的甘薯葉黃酮類物質(zhì)，其對(duì)PhIP的抑制率明顯高于蘆丁，槲皮素，甘草素和葛根素，主要是因?yàn)樘崛∥锸嵌喾N物質(zhì)的混合物，這些物質(zhì)中有對(duì)PhIP的抑制作用更強(qiáng)的黃酮類物質(zhì)存在，有待于進(jìn)一步對(duì)提取物進(jìn)行分離純化，為甘薯葉黃酮的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

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The Study of Formation Rule and Inhibitory Effect on Ph IP in M odel System

YUChun-di1，2，SHAO Ze-ping1，ZHANGYan1，WANGShuo1，*
（1.Key Laboratoryof Food Nutrition and Safety，Ministry of Education ofChina，Tianjin University ofScience and Technology，Tianjin 300457，China；2.Collegeof Food Scienceand Engineering，Qingdao Agricultural University，Qingdao266109，Shandong，China）

Heterocyclic aromatic amines（HAAs）are a kind ofharmful substances generated in protein-rich foods during high-temperature cooking（e.g.baking，frying and grilling），and the potentialmutagenicity has been demonstrated in Amesexperiments.In thispaper，2-amino-1-methyl-6-phenylimidazo[4，5-b]pyridine（PhIP）whichwas themostabundantHAAsgenerated in daily cookingwas chose as the research target，the effectof differentmolar amount of creatinine and phenylalanine，and the influence of different heating time and temperaturewere studied，and established the optimal solution model system of PhIP formation.The total flavonoid in sweetpotato leaveswasextracted by ultrasonicmethod，the extracthad inhibitory effecton the formation of PhIP，the inhibition ratiowas67.31%，more than quercetin，rutin，liquiritigenin and puerarin.

modelsystem；PhIP；sweetpotato leaves；flavonoid

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.005

2016-05-15

于春娣（1979—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品安全檢測(cè)技術(shù)和食品加工過程安全控制。

*通信作者