楊冬萍 楊曉旭 俞洋

【摘要】目的：觀察高溫對體外培養(yǎng)的兔視網(wǎng)膜色素上皮（retinal pigment epithelial cells，RPE）細(xì)胞的影響。方法：以體外培養(yǎng)的兔RPE細(xì)胞為研究對象，采用55℃水浴加熱法對細(xì)胞進(jìn)行不同時間（3、5、8min）加溫處理，處理結(jié)束后立即進(jìn)行CCK-8法檢測細(xì)胞活性、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡、透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：55℃水浴各時間組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），且55℃水浴各時間組組間差異也均較顯著（P<005）。對照組（37℃）細(xì)胞凋亡率為（592±087）%，55℃水浴3min組細(xì)胞凋亡率為（1328±061）%，55℃水浴5min組細(xì)胞凋亡率為（5082±372）%，55℃水浴8min組細(xì)胞凋亡率為（6490±059）%。與對照組比較，55℃水浴各時間組細(xì)胞凋亡率均明顯增高，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），在溫度恒定的前提下，表現(xiàn)為隨著水浴時間的延長，兔RPE細(xì)胞凋亡率越來越高。透射電鏡能明顯看到細(xì)胞凋亡形態(tài)的改變。結(jié)論：55℃水浴加熱3、5、8min均可造成兔RPE細(xì)胞凋亡，水浴時間越長，細(xì)胞凋亡率越高。

【關(guān)鍵詞】水浴加熱；兔RPE細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號】R44663【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2017）07-0035-04

Effect of High Temperature on Cultured Rabbit Retinal Pigment Epithelium Cells

YANG Dongping1YANG Xiaoxu1YU Yang1，2*

1 Traditional Chinese Medical College of Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China

2 Key Laboratory of Ministry of Education to the Modernization of Hui Medicine Department， Yinchuan 740004，China

Abstract：Objective To observe the effect of high temperature on cultured rabbit retinal pigment epithelial cells Methods Rabbit retinal pigment epithelial cells were cultured in vitro by heating at 55 ℃ for 3 min， 5 min and 8 min The cell viability was measured by CCK-8 method immediately after the treatment，cell apoptosis was determined by flow cytometry，morphological changes of cells were observed by transmission electron microscopy（TEM）Results 55℃water bath OD value was significantly lower than the control group，the difference was statistically significant，and between 55℃ water bath each time group group differences was statistically significant difference （P<005）The control group （37℃） cell apoptosis rate was （592±087）%， 55℃ 3min group cell apoptosis rate was （1328±061）%， 55℃ 5min group cell apoptosis rate was （5082±372）%， 55 C 8min group cell apoptosis rate was （6490±059）% Compared with the control group， the apoptotic rate of the 55 ℃ water bath group was significantly higher than that of the control group （P<005） Under the constant temperature condition， with the prolongation of water bath time， Retinal pigment epithelial cell apoptosis rate is getting higher and higherTEM can clearly see the changes apoptotic morphologyConclusion The apoptosis of retinal pigment epithelial cells can be induced by heating at 55 ℃ for 3min， 5min and 8min， water bath time is longer， the higher the rate of cell apoptosis

Keywords：Water Bath； Retinal Pigment Epithelial Cells； Apoptosis

“凋亡（Apoptosis）”概念早在20世紀(jì)70年代初就由Kerr[1]等提出。隨著生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，國內(nèi)外學(xué)者對有關(guān)細(xì)胞凋亡的探索已經(jīng)深入到基因、分子水平。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是由基因調(diào)控的、細(xì)胞主動有序死亡的一個過程，它主要參與機(jī)體內(nèi)細(xì)胞數(shù)目的精準(zhǔn)調(diào)節(jié)，以及機(jī)體的發(fā)育，細(xì)胞分化和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。一旦機(jī)體內(nèi)外環(huán)境因素發(fā)生紊亂，便會引起細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)失衡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，許多因素（如缺氧、激光照射、藥物等）可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其中，激光作為一種新型光源，因其具有單色性強(qiáng)、發(fā)散角小、相干性好、能量高等優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于軍事、醫(yī)學(xué)、工業(yè)等各種領(lǐng)域[2]。眼底激光作為眼底病治療的重要手段，應(yīng)用甚廣，激光與眼部組織發(fā)生作用時，以光熱效應(yīng)最為常見，光子在被生物組織吸收后，轉(zhuǎn)化為熱能，使局部組織溫度上升，導(dǎo)致組織性質(zhì)發(fā)生變化，即產(chǎn)生光熱效應(yīng)。Gabay等[3]認(rèn)為光能主要被視網(wǎng)膜色素上皮吸收，少部分被脈絡(luò)膜毛細(xì)血管吸收，其余則被脈絡(luò)膜大血管吸收，或被鞏膜散射，故熱損傷常發(fā)生在視網(wǎng)膜色素上皮和局部脈絡(luò)膜組織。因此，本研究以兔RPE細(xì)胞為研究對象，觀察55℃水浴加熱不同時間（3、5、8min）對細(xì)胞的影響。

1儀器與材料

11材料CCK-8試劑（日本同仁化學(xué)），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（上海貝博生物有限公司），兔RPE細(xì)胞（賽齊（上海）生物工程有限公司）。

12儀器E680酶聯(lián)免疫檢測儀（BIO-RAD公司）；流式細(xì)胞儀（美國BD公司）；電熱恒溫水浴鍋（紹興木可橋醫(yī)療器械廠）。

2方法

21兔RPE細(xì)胞的培養(yǎng)兔RPE細(xì)胞培養(yǎng)條件為：10% DMEM完全培養(yǎng)基（含100U/mL青霉素，100mg/L鏈霉素），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

22細(xì)胞處理取若干瓶對數(shù)生長期的兔RPE細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)液，溫PBS洗滌2遍，025%胰蛋白酶消化約3min，鏡下觀察細(xì)胞回縮變圓、變亮，立即終止消化，用吸管吸取部分培養(yǎng)液，輕輕將細(xì)胞從瓶壁吹打下來，分別移入若干離心管中。

23實(shí)驗(yàn)分組①對照組，細(xì)胞不做任何處理；②55℃水浴3min組；③55℃水浴5min組；④55℃水浴8min組。

24CCK-8法測定細(xì)胞活性將加溫處理的各管細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μL，再避光加入CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4h后，在酶標(biāo)儀上測量其OD值。酶標(biāo)儀的內(nèi)置檢測波長為450nm。

25Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡上述各組細(xì)胞于處理時間結(jié)束后，1000rpm，低速離心5min，棄上清；預(yù)冷PBS洗滌1次，輕輕混勻成單細(xì)胞懸液，1000rpm，5min離心后，棄上清，此步驟重復(fù)2次；將細(xì)胞懸浮于400μL Annexin-V結(jié)合液中，避光加入5μL FITC，4℃放置15min，上機(jī)前5min避光加10μL PI，在1h內(nèi)完成流式細(xì)胞儀檢測。

26透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡收集對照組及各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，2%戊二醛固定過夜（4℃），后進(jìn)行常規(guī)的電鏡脫水、包埋、雙鉛染色、超薄切片，透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。

27統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS170軟件處理，以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）表示，行t檢驗(yàn)，P<005表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果與分析

31CCK-8法測定細(xì)胞活性55℃水浴各時間組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），且55℃水浴各時間組組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。

32Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測將每組測試細(xì)胞區(qū)分成4個細(xì)胞亞群，分別為機(jī)械損傷或壞死細(xì)胞、正常活細(xì)胞、中晚期凋亡及繼發(fā)性壞死細(xì)胞、早期凋亡細(xì)胞。這里主要分析早期凋亡細(xì)胞和中晚期凋亡以及繼發(fā)性壞死兩個指標(biāo)。對兔RPE細(xì)胞進(jìn)行55℃水浴加熱3min、5min、8min后，對照組（37℃）細(xì)胞凋亡率為（592±087）%，55℃水浴3min組細(xì)胞凋亡率為（1328±061）%，55℃水浴5min組細(xì)胞凋亡率為（5082±372）%，55℃水浴8min組細(xì)胞凋亡率為（6490±059）%。與對照組比較，55℃水浴各時間組細(xì)胞凋亡率均明顯增高，組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），在溫度恒定的前提下，表現(xiàn)為隨著水浴時間的延長，兔RPE細(xì)胞凋亡率越來越高。見表1、圖1。

33透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡正常對照細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，胞質(zhì)內(nèi)有大量黑色素顆粒，核染色質(zhì)分布均勻（圖2）。而經(jīng)過55℃水浴各時間處理過的細(xì)胞體積明顯變小，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器變少或消失，有大量的空泡，核染色質(zhì)聚集成團(tuán)，邊聚、分散，或裂解成碎片（圖3）。

4討論

細(xì)胞凋亡是指機(jī)體通過清除自身組織中無用的、有害的以及異常的細(xì)胞，以維持機(jī)體自身的穩(wěn)定，是一種由基因調(diào)控的、細(xì)胞自主有序的死亡，是維護(hù)多細(xì)胞生物體內(nèi)平衡的關(guān)鍵機(jī)制。細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是單個細(xì)胞的消亡過程，不引起炎癥反應(yīng)[4]。在許多視網(wǎng)膜疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的凋亡起著重要的作用，研究證實(shí)，在眼病中，細(xì)胞死亡的最終途徑是細(xì)胞凋亡的結(jié)果[5]。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK-8法進(jìn)行細(xì)胞活性檢測、流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡、透射電鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，主要探討了55℃水浴加熱不同時長（3、5、8min）對兔RPE細(xì)胞的影響。其中，CCK-8法細(xì)胞活性檢測結(jié)果顯示，55℃水浴各時間組OD值明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），且55℃水浴各時間組組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005）。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，對照組（37℃）細(xì)胞凋亡率為（592±087）%，55℃水浴3min組細(xì)胞凋亡率為（1328±061）%，55℃水浴5min組細(xì)胞凋亡率為（5082±372）%，55℃水浴8min組細(xì)胞凋亡率為（6490±059）%。與對照組比較，55℃水浴各時間組細(xì)胞凋亡率均明顯增高，且組間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<005），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，55℃高溫可誘導(dǎo)細(xì)胞細(xì)胞發(fā)生凋亡，這與文獻(xiàn)相符[6-7]，且在一定的溫度下，兔RPE細(xì)胞凋亡率與加溫時間成正比。透射電鏡結(jié)果顯示：正常對照細(xì)胞呈圓形或橢圓形，細(xì)胞膜完整，胞漿內(nèi)細(xì)胞器豐富，可見線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器，胞質(zhì)內(nèi)有大量黑色素顆粒，核染色質(zhì)分布均勻。經(jīng)過55℃水浴各時間處理過的細(xì)胞體積明顯變小，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器變少或消失，有大量的空泡，核染色質(zhì)聚集成團(tuán)，邊聚、分散，或裂解成碎片。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高溫可造成RPE細(xì)胞損傷，且以凋亡為主，而這種損傷與加熱的溫度和時間密切相關(guān)。

激光醫(yī)學(xué)作為現(xiàn)代科技發(fā)展的一門新興醫(yī)學(xué)，其應(yīng)用只有四十多年的歷史，故中醫(yī)在激光性視網(wǎng)膜損傷發(fā)病機(jī)理以及治療作用方面報道甚少，但隨著激光醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，激光光熱效應(yīng)所造成的視網(wǎng)膜損傷已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一個不可忽視的問題。岳紅云等[8]發(fā)現(xiàn)，中藥毓明方（羚羊角、枸杞、當(dāng)歸、白芍、川芎、防風(fēng)、黃連、草決明等）可有效改善激光光凝治療區(qū)視野視點(diǎn)的平均視閾值，對治療性視網(wǎng)膜損傷具有一定的防治作用。其中，毓明方中羚羊角為君藥，黃連、防風(fēng)、草決明為佐藥，傅仁宇[9]曰：“防風(fēng)，黃連羚角，草決明散滯瀉熱，解結(jié)明目也，陰弱不能配陽之病，并宜服之”。激光作為一種高能量的單色光，可辨為熱毒外邪，傅仁宇認(rèn)為“六陽賊火上炎”為其發(fā)病機(jī)理，故治以“清心滋腎為先”。詹宇堅等[10]用具有健脾益氣、活血化瘀的精明Ⅱ號丸治療激光光凝兔視網(wǎng)膜病變，發(fā)現(xiàn)精明Ⅱ號丸可很好的促進(jìn)視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視細(xì)胞的修復(fù)。

目前，激光已廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)療等領(lǐng)域，隨著激光暴露普遍化，激光眼損傷光熱效應(yīng)也受到越來越多的關(guān)注。如在傳統(tǒng)光凝治療中，眼組織溫度一般升高40～60℃，導(dǎo)致視網(wǎng)膜全層損傷，并可累及到脈絡(luò)膜[11]。因此，在利用激光的光熱效應(yīng)治療眼部疾病時，必須嚴(yán)格監(jiān)控視網(wǎng)膜溫度和時間的變化，從而達(dá)到安全有效的治療目的。對于從事激光工業(yè)的工作人員，須自覺加強(qiáng)自我保護(hù)意識，戴好防護(hù)眼鏡和防護(hù)眼罩等，避免由激光光熱效應(yīng)引發(fā)的RPE細(xì)胞凋亡。

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（收稿日期：2017-01-24編輯：程鵬飛）