任文娟,汪 貞,楊先海,劉濟寧①,楊 倩,陳英文,沈樹寶

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院,江蘇 南京 211816;2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所,江蘇 南京 210042)

雙酚A及其類似物對斑馬魚成魚及胚胎的急性毒性

任文娟1,2,汪 貞2,楊先海2,劉濟寧2①,楊 倩1,2,陳英文1②,沈樹寶1

(1.南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院,江蘇 南京 211816;2.環(huán)境保護部南京環(huán)境科學研究所,江蘇 南京 210042)

雙酚B(BPB)、雙酚F(BPF)、雙酚AP(BPAP)、雙酚AF(BPAF)、雙酚Z(BPZ)、雙酚P(BPP)和雙酚S(BPS)作為雙酚A(BPA)的替代品被廣泛使用,但其毒性數(shù)據(jù)非常有限。將BPA、BPB、BPF、BPZ、BPP、BPAP、BPAF和BPS暴露于斑馬魚成魚及胚胎,通過24、48、72和96 h死亡率等指標比較8種化合物的急性毒性。結果顯示,雙酚A及其類似物對斑馬魚成魚及胚胎毒性具有線性相關性。根據(jù)GB 30000.28—2013《化學品分類和標簽規(guī)范 第28部分:對水生環(huán)境的危害》對受試物的急性水環(huán)境毒性的分級標準,判定BPP為毒性Ⅰ級,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF為毒性Ⅱ級,根據(jù)Verhaar分類方法,雙酚A及其類似物屬于麻醉致毒機制的化學品,其毒性大小與疏水基團相關。

雙酚A及其類似物;急性毒性;半致死濃度(LC50);畸形

雙酚A(bisphenol A,BPA)用于制造環(huán)氧樹脂(epoxyresin)、聚碳酸酯(polycarbonate)以及精細化工產(chǎn)品(如農(nóng)藥、橡膠防老劑、嬰兒奶瓶和瓶蓋等)[1],是應用最廣泛的工業(yè)化學品之一。研究表明,BPA具有干擾內分泌等毒性作用,對雄性生殖系統(tǒng)有一定的損害[2],可能會引起性早熟[3],對胚胎也會有一定的影響[4]。在低濃度長時間暴露的情況下,BPA對親代和子代生殖系統(tǒng)、腦和神經(jīng)系統(tǒng)及免疫系統(tǒng)等有不良影響,可能會引發(fā)癌癥、肥胖、糖尿病、生殖障礙和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂等多種疾病?？紤]到BPA的潛在低劑量效應,尤其是對嬰幼兒等敏感人群[5-6],部分國家已經(jīng)開始限制含BPA塑料制品的使用,近年來越來越多的國家采取了禁用措施。為了應對這些限制,一些雙酚類似物如雙酚B(bisphenol B,BPB)、雙酚S(bisphenol S,BPS)和雙酚F(bisphenol F,BPF)等被用來替代BPA用于環(huán)氧樹脂、塑料、熱敏紙和食品包裝材料等的生產(chǎn)[7-9]。

常見的雙酚A類似物有BPB、BPF、BPAP、BPAF、BPZ、BPP和BPS等,其CAS號及分子結構圖如表1所示。雙酚A類似物與雙酚A具有相似的分子結構,都具有2個羥苯基,但2個羥苯基之間碳橋上的取代基不同,由于這類化合物具有性質較穩(wěn)定、耐高溫、延展性好、制作工藝簡單和成本低等優(yōu)點,因此被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)[10-12]。FIEGE等[13]研究發(fā)現(xiàn)BPS是酚醛樹脂和電鍍溶劑等的組分,可增加物質的硬度和耐用度,已被用于道路和橋梁建設中。LIAO等[14]研究發(fā)現(xiàn)熱敏紙中存在BPS。隨著雙酚A類似物的大量使用,污染物大量排入空氣中,許多研究表明雙酚A分子可以從嬰兒奶瓶或瓶體脫離,進入水或食物中危害人體健康[15],并可與食物結合進入生物體[16],造成內分泌系統(tǒng)紊亂,而且具有易富集和不易降解等特點,因此對自然界生物體及人體帶來越來越多的傷害[17]。

表1 雙酚A及其類似物的基本信息

Table 1 Basic information of bisphenol A and its analogues

中文名稱 CAS號 分子結構圖雙酚A80-05-7雙酚B77-40-7雙酚F620-92-8雙酚AP1571-75-1雙酚AF1478-61-1雙酚Z843-55-0雙酚P1100-88-5雙酚S80-09-1

現(xiàn)階段,對雙酚A類似物已經(jīng)有一些生物體效應方面的研究。SONG等[18]以斑馬魚的胚胎和幼魚為模式生物研究了3種鹵代雙酚A化合物(TBBPA、TCBPA和BPAF)的發(fā)育毒性,半致死濃度值(LC50)的計算結果表明這幾種物質的毒性由高到低為TCBPA、TBBPA和BPAF;KURUTO-NIWA等[19]將雄性和雌性斑馬魚暴露在BPS質量濃度為0.5～50 μg·L-1的水樣中 21 d后,雌性和雄性斑馬魚血漿中的雌二醇含量顯著升高,而雄性斑馬魚血漿中的睪酮含量則顯著降低。李圓圓等[20]研究了BPA、BPS和BPF對黑斑蛙胚胎及蝌蚪的急性毒性,發(fā)現(xiàn)BPA的急性毒性與BPF相當,但高于BPS。雖然已有雙酚A類似物對水生生物急性毒性的研究報道,但鮮見對幾種檢出率較高的雙酚A類似物的系統(tǒng)研究,為了更好地說明8種雙酚A及其類似物對生物的急性毒性效應,筆者采用模式生物斑馬魚及其胚胎來評價8種受試物對水生生物的潛在毒性效應,以期為雙酚A類似物的生態(tài)風險評價提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 受試生物

試驗所用斑馬魚(AB型)購于堯舜禹生物科技有限公司,平均體長(3.2±0.4) cm,平均體重0.15 g。斑馬魚胚胎購于堯舜禹生物科技有限公司,胚胎期斑馬魚暴露試驗以囊胚期開端(即受精后2 h,2hpf)的胚胎作為起始。

1.1.2 試劑

BPA、BPB、BPF、BPAP、BPAF、BPZ、BPP和BPS購自百靈威科技有限公司(上海),以丙酮(色譜純,德國 Merck公司)作溶劑配制成質量濃度為103～105mg·L-1的貯備液(置于4 ℃冰箱避光保存)。試驗所有梯度稀釋操作時均用丙酮作溶劑(丙酮體積分數(shù)為0.01%～0.5%),去離子水由Mini-Q 超純水機制備(美國Miliipore公司)。

1.1.3 儀器設備

硬度計(16900型,美國哈希公司),多功能水質參數(shù)測定儀(HQ40d,美國哈希公司),溶解氧測定儀(HQ30d,美國哈希公司),電子分析天平(AG135,美國Mettler Toledo公司),生態(tài)培養(yǎng)箱(CLIMACELL型,德國MMM公司)。

1.2 試驗方法

斑馬魚成魚及胚胎急性毒性試驗方法參照文獻[21-22]進行。

1.2.1 受試物濃度設置

在正式試驗之前先對8種物質進行較大范圍濃度系列(0.1、1、10、100和1 000 mg·L-1)的預試驗,先在玻璃缸中裝入經(jīng)曝氣處理的水3 L,加入受試物貯備液,不設平行組,各試驗容器放10尾斑馬魚,試驗期間不換水、不喂食,觀察記錄魚死亡數(shù)。

根據(jù)預試驗得出的結果,斑馬魚成魚及胚胎正式試驗濃度梯度設置見表2。

表2 正式試驗中雙酚A及類似物的濃度設置

Table 2 Concentrations of bisphenol A and its analogues set in the formal test

受試物成魚暴露質量濃度/(mg·L-1)胚胎暴露質量濃度/(mg·L-1) BPA1、2、4、6、8、10、12、140.05、0.25、1.25、2、4、6、8、10、12、14BPB1、2、4、6、8、100.05、0.25、1.25、2、4、6、8、10BPF1、2、4、6、8、10、12、140.05、0.25、1.25、2、4、6、8、10、12、14BPAP0.5、1、2、2.5、3、4、50.25、0.5、1、2、3、4BPAF1、2、2.5、3、4、5、60.25、0.5、1、2、3、4BPZ1、2、3、4、5、60.25、0.5、1、2、3、4BPP0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、10.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1BPS50、100、200、300、400、500150、200、250、300、350、400、450

1.2.2 水質參數(shù)測定

試驗期間(0～96 h)試驗用水硬度(以CaCO3計)為180～190 mg·L-1,pH值為7.0～7.2,溶解氧質量濃度為7.68～7.98 mg·L-1。

1.2.3 試驗操作

將斑馬魚成魚置于循環(huán)水玻璃缸中馴養(yǎng)2周,溫度設置為(23±0.5) ℃,光照周期為t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h,每天投喂2次豐年蝦(Artemiasalina),7 d內死亡率小于5%,可用于后續(xù)試驗。

將斑馬魚成魚隨機放入含3 L藥液的玻璃缸中,每個缸中放入10條已馴養(yǎng)斑馬魚,每個受試物濃度設3個平行,所有玻璃缸放到恒溫水槽中,水槽溫度設置為(23±0.5) ℃,光照周期為t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h。分別在6、24、48、54、72和96 h時記錄斑馬魚死亡數(shù),觀察斑馬魚的異常行為,及時清除死魚。

將斑馬魚受精卵放入50 mL小燒杯中,每個燒杯20粒,每個受試物濃度設3個平行,將燒杯置于生態(tài)培養(yǎng)箱,設定[光]照度為50 lx,光照周期為t(光照)∶t(黑暗)=16 h∶8 h,溫度為(23±0.5) ℃。每天統(tǒng)計胚胎死亡數(shù),用顯微鏡觀察畸形情況,及時清除死亡胚胎。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用美國環(huán)境保護局修正的斯皮爾曼-卡伯分析軟件(Trimmed Spearman-Karber Method)計算LC50及95%置信區(qū)間,通過Origin 8.0軟件擬合濃度-效應曲線。

2 試驗結果

2.1 成年斑馬魚及胚胎的中毒現(xiàn)象

斑馬魚中毒時一般表現(xiàn)為側翻、身體扭曲、串游和上浮等,死亡一段時間后沉入缸底。500 mg·L-1BPS試驗組中,6 h內出現(xiàn)死亡現(xiàn)象;5、6 mg·L-1的 BPAF、BPZ和8、10 mg·L-1BPB試驗組中,16 h內出現(xiàn)全部死亡現(xiàn)象;4、5 mg·L-1BPAP,12、14 mg·L-1BPA和14 mg·L-1BPF試驗組中,24 h內出現(xiàn)全部死亡現(xiàn)象。1 mg·L-1BPP試驗組中,30 h內出現(xiàn)全部死亡現(xiàn)象。

在高濃度暴露下早期階段的受精卵顏色出現(xiàn)變化,由透明變成白色半透明并死亡。胚胎中毒后出現(xiàn)畸形或身體由半透明變?yōu)椴煌该鞑⑺劳觥Ｗ恤~中毒后出現(xiàn)畸形或無呼吸無心臟跳動死亡(圖1)。

2.2 雙酚A及類似物的毒性效應

表3是成魚24、48、72和98 h的LC50及95%置信區(qū)間。圖2是試驗96 h時8種受試物暴露下成年斑馬魚的死亡率曲線圖,對于同一種受試物,隨著暴露濃度的升高死亡率也逐漸升高。8種受試物中BPP的死亡率首先達到100%,然后依次是BPAP、BPAF、BPB、BPA、BPF和BPS。

根據(jù)GB 30000.28—2013《化學品分類和標簽規(guī)范 第28部分:對水生環(huán)境的危害》對受試物的急性水環(huán)境毒性的分級標準(96 h的LC50:≤1 mg·L-1為Ⅰ級,>1～10 mg·L-1為Ⅱ級,>10～100 mg·L-1為Ⅲ級)[23],結合圖2和表3,判定BPP為毒性Ⅰ級,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF為毒性Ⅱ級。

圖3是8種受試物暴露96 h時斑馬魚胚胎的死亡率曲線。隨著受試物濃度升高,死亡率也逐漸升高,這與成魚的試驗結果一致。8種受試物比較而言,BPP的效應濃度最低,BPS的效應濃度最高,BPAF和BPAP對胚胎的濃度-效應曲線比較接近,說明它們對胚胎的急性毒性強度較接近,隨后依次為BPZ、BPB、BPA和BPF。

表4是胚胎24、48、72和96 h的LC50及95%置信區(qū)間。結合圖3和表4,判定BPP為毒性Ⅰ級,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF為毒性Ⅱ級。

a—6 h時發(fā)育正常的卵;b—6 h時的卵凝結;c—6 h時發(fā)育異常的卵;d—20 h時發(fā)育正常的卵;e—20 h時發(fā)育阻滯的胚胎;f—78 h時發(fā)育正常的胚胎;g—78 h時發(fā)育阻滯的胚胎;h—78 h時脊柱彎曲的胚胎;i、j、k、l—96 h時發(fā)育畸形的胚胎。ce—心包水腫;cv—卵黃囊腫;sc—脊柱彎曲;cf—顱面畸形。

表3 雙酚A及其類似物對斑馬魚成魚的半致死濃度(LC50)

Table 3 Half lethal concentration (LC50)of bisphenol A and its analogues for adult zebrafish

受試物ρ(LC50)/(mg·L-1)24h48h72h96hBPA9.51(8.96～10.08)9.31(8.85～9.80)8.09(7.21～9.08)8.09(7.21～9.08)BPB5.07(4.75～5.42)4.64(4.18～5.15)4.15(3.54～4.87)4.15(3.54～4.87)BPF10.10(9.37～10.81)9.86(9.19～10.6)9.51(8.96～10.10)9.51(8.96～10.10)BPAP3.04(2.78～3.32)2.70(2.48～2.94)2.42(2.28～2.58)2.28(2.00～2.37)BPAF3.15(2.93～3.39)2.64(2.45～2.84)2.47(2.32～2.64)2.47(2.32～2.64)BPZ3.43(3.16～3.72)2.72(2.46～3.01)2.63(2.40～2.87)2.63(2.40～2.87)BPP0.70(0.60～0.83)0.46(0.38～0.45)0.40(0.33～0.48)BPS343(316～372)343(316～372)343(316～372)343(316～372)

括號內數(shù)據(jù)為95%置信限。

暴露時間為96 h。

暴露時間為96 h。

表4 雙酚A及類似物對斑馬魚胚胎的半致死濃度(LC50)

Table 4 Half lethal concentration (LC50)of bisphenol A and its analogues for zebrafish embryo

受試物ρ(LC50)/(mg·L-1)24h 48h 72h 96h BPA8.04(6.95～9.31)7.85(6.78～9.09)7.74(6.68～8.98)5.82(4.61～7.36)BPB7.18(6.45～8.00)6.54(5.77～7.42)4.53(3.58～5.72)3.88(3.06～4.91)BPF9.13(8.29～10.10)8.93(8.11～9.48)8.56(7.80～9.39)7.40(6.61～8.29)BPAP2.84(2.59～3.12)2.61(2.33～2.93)2.57(2.29～2.89)2.29(2.02～2.61)BPAF3.89(3.34～4.54)3.49(3.20～3.81)2.04(1.77～2.36)BPZ3.39(3.02～3.80)3.25(2.88～3.67)2.98(2.67～3.34)BPP0.81(0.77～0.85)0.66(0.62～0.70)0.40(0.36～0.44)0.37(0.34～0.41)BPS361(350～372)346(331～361)331(317～346)323(308～339)

括號內數(shù)據(jù)為95%置信限。

斑馬魚成魚和胚胎96 h時的LC50對比如圖4所示。從圖4可知,8種受試物對成魚和胚胎的LC50相差不大。斑馬魚成魚(x)和胚胎(y)的毒性相關性見圖5,24 h時毒性回歸方程為y=-0.476+1.052x,R2為0.999 89;48 h時毒性回歸方程為y=0.164+1.004x,R2為0.999 9;72 h時毒性回歸方程為y=0.274+0.963 3x,R2為0.999 98;96 h時毒性回歸方程為y=-0.430 96+0.942 89x,R2為0.999 94。由圖5可以看出,當某種受試物對成年斑馬魚的LC50高時,則該受試物對胚胎的LC50也較高,說明雙酚A及其類似物對斑馬魚成魚與胚胎的毒性效應有高度的一致性。

圖4 斑馬魚成魚和胚胎96 h時的半致死濃度(LC50)Fig.4 96 h LC50 of bisphenol A and its analogues for adult zebrafish and embryo

y—胚胎ρ(LC50)；x—成魚ρ(LC50)。

3 討論

雙酚A是被研究較多的環(huán)境內分泌干擾物,關于雙酚A及其類似物的毒性比較研究較少,該試驗對BPA及其7種類似物BPB、BPF、BPAP、BPAF、BPZ、BPP、BPS進行了比較研究,發(fā)現(xiàn)BPP對斑馬魚成魚及胚胎的毒性最大,BPS毒性最小,根據(jù)GB 30000.28—2013對受試物的急性水環(huán)境毒性的分級標準[23],判定BPP為毒性Ⅰ級,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF為毒性Ⅱ級。

根據(jù)Verhaar分類方法,具有麻醉致毒機制的化合物,其毒性與化合物的辛醇-水分配系數(shù)KOW(lgKOW值由EPI Suit 4.1軟件計算)具有較好相關性。圖6顯示了8種受試物的KOW與96 h的LC50的線性關系,可以看出兩者擬合度較好,說明這些受試物的毒性與本身的疏水性密切相關。它們具有相似的分子結構,都具有2個羥苯基,但2個羥苯基之間碳橋上的取代基不同,取代基的疏水性大小決定了其毒性大小,疏水性越大毒性越大。例如BPA的碳橋上連了2個甲基,而BPP比BPA多2個甲基和1個苯環(huán),所以BPP的疏水性大,毒性大于BPA。BPA比BPF多2個甲基,所以BPA的疏水性大,毒性大于BPF。BPS的碳橋被硫氧基取代,所以疏水性變小,毒性比BPA小。綜上可知,8種雙酚A及其類似物是具有麻醉致毒機制的化合物。

y—-lg ρ(LC50)；x—lg Kow。

這些雙酚類有毒物質在水體中被廣泛檢出,GONG等[24]測得珠江水ρ(BPA)為0.04～0.64 μg·L-1。WU等[25]測得黃浦江ρ(BPA)平均值為22.93 ng·L-1。YANG等[26]對浙江杭州灣嘉興段BPAF生產(chǎn)區(qū)的河水研究發(fā)現(xiàn),除了ρ(BPAF)較高(254.59 ng·L-1)以外,還檢測出了不同濃度的BPS、BPF和BPA;SONG等[27]對BPAF制造廠周圍不同環(huán)境介質的分析發(fā)現(xiàn),大部分環(huán)境介質中均檢測到不同濃度的BPAF,其中,河水中質量濃度為<最低檢測限(LOD)～1.53×104ng·L-1,雖然在水環(huán)境中的檢出量小于效應值,但由于雙酚A及其類似物很難降解,會在水生生物體內不斷積累,造成長期影響,所以仍需持續(xù)關注。

魚類對污染物的暴露特別敏感,有較多的毒性研究試驗都以成年斑馬魚或稀有鮈鯽作為模式生物,以胚胎作為受試生物的研究較少,通過毒性相關性分析得知成魚和胚胎毒性效應呈線性相關關系,因此傳統(tǒng)的成魚毒性試驗可以被胚胎毒性試驗所代替,魚類胚胎毒性測試可用于化學品的急性毒性研究。

4 結論

(1) 通過對斑馬魚成魚及胚胎96 h的急性毒性試驗,發(fā)現(xiàn)BPS的毒性比BPA、BPB、BPF、BPAP、BPAF和BPZ低2個數(shù)量級,比BPP毒性低3個數(shù)量級。BPP對斑馬魚成魚及胚胎的的毒性效應最大,需要加強防范。

(2) 根據(jù)GB 30000.28—2013對受試物的急性水環(huán)境毒性的分級標準,判定BPP為毒性Ⅰ級,BPA、BPB、BPF、BPZ、BPAP和BPAF為毒性Ⅱ級;雙酚A及其類似物是具有麻醉致毒機制的化合物,其毒性大小與疏水性密切相關,疏水性越大毒性越大。

(3) 雙酚A及其類似物對斑馬魚成魚與胚胎的毒性效應有一致性。

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(責任編輯： 許 素)

Acute Toxicity Effect of Bisphenol A and Its Analogues on Adult and Embryo of Zebrafish.

RENWen-juan1,2,WANGZhen2,YANGXian-hai2,LIUJi-ning2,YANGQian1,2,CHENYing-wen1,SHENShu-bao1

(1.School of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering， Nanjing Tech University, Nanjing 211816, China;2.Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China)

Little is known so far about toxicities of bisphenol B(BPB), bisphenol F(BPF), bisphenol AP(BPAP), bisphenol AF(BPAF), bisphenol Z(BPZ), bisphenol P(BPP), bisphenol S (BPS), although they have been used widely as BPA substitutes. A comparative study was done by exposing adults and embryos of zebrafish to the 8 kinds of chemicals for 24, 48, 72 and 96 hours to determine half lethal concentration (LC50) and fatality rate at different time intervals. Results show that the toxicities of bisphenol A and its analogues to adult zebrafish were linearly related to their respective ones to zebrafish embryos. According to the criteria for grading of toxicity in “Rules for Classification and Labeling of Chemicals, Part 28：Hazardous to the Aquatic Environment”, BPP is sorted into Grade Ⅰ in toxicity and BPA, BPB, BPF, BPZ, BPAP and BPAF into Grade Ⅱ, while according to the Verhaar classification system, bisphenol A and its analogues belong to the category of chemicals with anesthetic toxication mechanism and degree of their toxicities is related to hydrophobic groups.

bisphenol A and its analogue; acute toxicity; median lethal concentration (LC50); deformity

2016-05-24

江蘇省自然科學基金(BK20151100)

X592

A

1673-4831(2017)04-0372-07

10.11934/j.issn.1673-4831.2017.04.011

任文娟(1989—)，女，山東荷澤人，碩士生，主要從事化學品生態(tài)毒理學研究。E-mail: rwj123123@126.com

① 通信作者E-mail: ljn@nies.org

② 共同通信作者E-mail: ywchen@njtech.edu.cn