胡艷紅 雷洪濤 王淑艷 于 雪 張 賽 蘇 靖 馬家寶姜昭妍 張 凡 萬亮琴 臧妍妍 李芳赫 李衛(wèi)紅

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京，100700)

缺血再灌注損傷腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Necroptosis模型的建立

胡艷紅1雷洪濤2王淑艷1于 雪1張 賽1蘇 靖1馬家寶1姜昭妍1張 凡1萬亮琴1臧妍妍1李芳赫1李衛(wèi)紅1

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029； 2 中國中醫(yī)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，北京，100700)

目的：采用擬缺血再灌注損傷結(jié)合z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone，z-VAD-FMK)干預(yù)，探索一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs)Necroptosis模型。方法：首先利用原代大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，采用氧糖剝奪及復(fù)氧復(fù)糖方法，篩選出擬缺血再灌注損傷時(shí)間點(diǎn)。在擬缺血再灌注模型基礎(chǔ)上，予Casepase抑制劑z-VAD-FMK 20 μmol/L干預(yù)，采用CCK-8檢測細(xì)胞活性；透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；Annexin V-FITC/PI(Propidium Iodide)雙染色法檢測細(xì)胞死亡方式。結(jié)果：確定氧糖剝奪2 h復(fù)氧復(fù)糖8 h，作為擬缺血再灌注時(shí)間點(diǎn)；z-VAD-FMK作用于擬缺血再灌注損傷BMECs后，細(xì)胞活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；z-VAD-FMK干預(yù)組在電鏡下呈現(xiàn)明顯的Necroptosis特征；流式檢測顯示，各象限細(xì)胞比率無明顯變化，但Necroptosis特異性抑制劑Nec-1可顯著降低Q2象限細(xì)胞比率，提示z-VAD-FMK干預(yù)抑制了細(xì)胞晚期凋亡，誘導(dǎo)了Necroptosis的發(fā)生。結(jié)論：z-VAD-FMK可誘導(dǎo)擬缺血再灌注腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生Necroptosis，為以后研究缺血性腦中風(fēng)necroptosis機(jī)制提供了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞；Necroptosis；z-VAD-FMK；缺血再灌注損傷

腦中風(fēng)是嚴(yán)重影響人類身體健康，甚至威脅生命的疾病。在我國，位列疾病死因第一位，每年發(fā)生腦中風(fēng)的患者達(dá)200萬，其中缺血性腦中風(fēng)所占的比率為70%～80%[1]。缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion Injury，IRI)是該病的重要病理生理過程，缺血再灌注損傷形式有多種，其中細(xì)胞死亡是主要損傷形式之一。除傳統(tǒng)的凋亡和壞死外，近些年又發(fā)現(xiàn)一種新的細(xì)胞死亡形式—Necroptosis。已有證據(jù)表明，缺血缺氧模型的心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞以及腫瘤存在Necroptosis[2-4]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Brain Microvascular Endothelial Cells，BMECs)作為血腦屏障的主要構(gòu)成細(xì)胞，其功能受損和死亡參與了腦缺血的病理演變過程，但目前關(guān)于缺血誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Necroptosis的研究甚少。本實(shí)驗(yàn)利用原代培養(yǎng)的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，在氧糖剝奪誘導(dǎo)缺血再灌注損傷的基礎(chǔ)上，選用目前應(yīng)用最為廣泛的caspase廣譜性蛋白抑制劑z-VAD-FMK(Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone)進(jìn)行處理，以建立一種腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Necroptosis體外模型，為今后深入研究腦缺血后腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Necroptosis的發(fā)生機(jī)制及血管保護(hù)藥物的療效靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 采用本課題組已建立的大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)[5]，對20 g左右雄性SD大鼠進(jìn)行細(xì)胞取材、培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)中使用的第3代內(nèi)皮細(xì)胞，其純度達(dá)到98%以上[6]。

1.1.2 試劑與儀器 z-VAD-FMK(美國Enzo Life Sciences公司)，Nec-1(美國Enzo Life Sciences公司)，DMSO(美國Sigma公司)，胎牛血清(excell bio南美血緣胎牛血清)，D-MEM/F-12培養(yǎng)基干粉(美國Gibco公司)，內(nèi)皮細(xì)胞生長添加劑(ECGS，中科邁晨(北京)科技有限公司)，明膠(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Sigma公司)，膠原酶Ⅱ型(美國Sigma公司)，CCK-8試劑盒(日本同仁化學(xué)研究所)，Annexin V-FITC and PI雙染試劑盒(美國BD公司)，倒置相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，X-Mark型酶標(biāo)儀(美國BIO-RAD公司)，流式細(xì)胞儀(美國BD公司)，透射電子顯微鏡(日本H7650公司)。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將傳至第3代的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分成3組：正常組、IRI組和IRI+z-VAD-FMK組。篩選和制備擬缺血再灌注模型：在本室已建立的擬缺血損傷模型的基礎(chǔ)上，重新篩選氧糖剝奪時(shí)間和復(fù)糖復(fù)氧時(shí)間，以制備穩(wěn)定的擬缺血再灌注模型。第3代BMECs鋪滿瓶底約80%～90%時(shí)，吸出培養(yǎng)瓶內(nèi)原培養(yǎng)液，用D-Hank′s洗滌兩遍，換成無糖Kreb′s液，放置37 ℃含1%O2、95%N2和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h或3 h，然后取出培養(yǎng)瓶棄掉上清，換成D-MEM/F-12基礎(chǔ)培養(yǎng)基，放進(jìn)37 ℃、21.7%O2和5% CO2正常培養(yǎng)箱分別孵育0、4、8、12 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)立正常對照組。造模結(jié)束后用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞活性，篩選合適的氧糖剝奪時(shí)間和復(fù)糖復(fù)氧時(shí)間，建立擬缺血再灌注損傷模型。

1.2.2 干預(yù)方法 除正常組外，其余2組按上述篩選出的擬缺血再灌注模型進(jìn)行造模。IRI+z-VAD-FMK組，造模前30 min及造模過程中按20 μmol/L濃度加入z-VAD-FMK。造模及處理結(jié)束后，進(jìn)行下列指標(biāo)檢測。

1.2.3 檢測指標(biāo)與方法 CCK-8檢測各組細(xì)胞活性：造模完成后棄上清，加入D-MEM/F-12培養(yǎng)基，每孔再加入10 μL CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后，用酶標(biāo)儀測定各組的吸光光度值，檢測波長為450 nm，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)：造模結(jié)束后，消化并收集細(xì)胞，用D-Hank′s洗滌細(xì)胞2次，將細(xì)胞懸液置于1.5 mL EP管中，200 g水平離心10 min。用預(yù)冷2.5%戊二醛(pH 7.3)1 mL/管進(jìn)行固定，PBS漂洗，之后用1%鋨酸固定。以不同濃度的丙酮順次脫水，環(huán)氧樹脂包埋，光鏡下進(jìn)行修塊，超薄切片機(jī)切成60 nm的薄片，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，放于電子顯微鏡下觀察并拍片。Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞死亡方式：因細(xì)胞發(fā)生Necroptosis與晚期凋亡染色特征相似，因此本實(shí)驗(yàn)在上述3組的基礎(chǔ)上，增加IRI+z-VAD-FMK+Nec-1(Necstatin-1，Necroptosis特異性阻滯劑)組，即在造模前30 min及造模過程中加入20 μmol/L z-VAD-FMK和10 μmol/Lnecstatin-1。造模結(jié)束后，用不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，200 g離心5 min，棄上清；用預(yù)冷的D-Hank′s洗滌細(xì)胞兩次，400 g離心5 min；每管加500 μL 1×Binding Buffer、5 μL Annexin V-FITC吹打混勻，室溫避光放置15 min后，在檢測前5 min加入10 μLPI后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果

2.1 確定擬缺血及再灌注時(shí)間 圖1為氧糖剝奪2 h，復(fù)氧復(fù)糖不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果。造模前，正常組和模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，氧糖剝奪2 h時(shí)，細(xì)胞活性開始下降，但組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；復(fù)氧復(fù)糖4 h時(shí)，細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01)，復(fù)氧復(fù)糖8 h時(shí)，細(xì)胞活性持續(xù)下降(P<0.01)，復(fù)氧復(fù)糖12 h時(shí)，細(xì)胞活性降低，但與復(fù)氧復(fù)糖8 h組比較，變化不大。

圖1 缺氧缺糖2 h，復(fù)氧復(fù)糖不同時(shí)間點(diǎn)BMECs活性的變化

注：與正常組比：△△P<0.01。

圖2為氧糖剝奪3 h，復(fù)氧復(fù)糖不同時(shí)間點(diǎn)的結(jié)果。造模前，正常組和模型組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，氧糖剝奪3 h時(shí)，細(xì)胞活性明顯下降(P<0.05)；復(fù)氧復(fù)糖4 h時(shí)，細(xì)胞活性顯著下降(P<0.01)，復(fù)氧復(fù)糖8 h和12 h時(shí)，細(xì)胞活性變化不大。

圖2 缺氧缺糖3 h，復(fù)氧復(fù)糖不同時(shí)間點(diǎn)BMECs活性的變化

注：與正常組比：△P<0.05，△△P<0.01。

從圖1和圖2綜合來看，BMECs氧糖剝奪2 h后，細(xì)胞活性稍有下降，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，復(fù)氧復(fù)糖4～8 h是細(xì)胞明顯損傷期。而氧糖剝奪3 h及復(fù)氧復(fù)糖各時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞活性均顯著下降，復(fù)氧復(fù)糖0～4 h是細(xì)胞明顯損傷期，該損傷更接近于急性缺血性損傷。我們認(rèn)為，氧糖剝奪2 h復(fù)氧復(fù)糖8 h，細(xì)胞損傷主要發(fā)生在再灌注過程中，更符合缺血再灌注損傷的特征，因此確定了氧糖剝奪2 h復(fù)氧復(fù)糖8 h來制備擬缺血再灌注損傷模型，以下實(shí)驗(yàn)均采用此條件造模。

2.2 CCK-8檢測各組的細(xì)胞活性 如表1結(jié)果所示，IRI組OD值較正常組顯著降低(P<0.01)，提示IRI組細(xì)胞活性顯著下降；與IRI組比較，IRI+z-VAD-FMK組OD值變化不明顯。這一結(jié)果顯示加入z-VAD-FMK后，細(xì)胞活性沒有明顯升高，與本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證z-VAD-FMK可能會誘導(dǎo)另一種細(xì)胞死亡形式相一致。

表1 各組BMECs活性的變化

注：與正常組比：△△P<0.01。

2.3 透射電鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 如圖3所示，在透射電鏡下，正常的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜完整，細(xì)胞核呈橢圓形，染色質(zhì)均勻，細(xì)胞器狀態(tài)良好(圖3a)。IRI組大多細(xì)胞核固縮或破裂，染色質(zhì)凝聚，但細(xì)胞膜基本完整(圖3b、3c)。IRI+z-VAD-FMK組(圖3d、e、f)：細(xì)胞膜完整性被破壞和內(nèi)容物從胞內(nèi)釋放，細(xì)胞器腫脹，線粒體內(nèi)脊消失呈空泡化，細(xì)胞核基本完整，這些變化與Necroptosis的形態(tài)特征相符合，提示z-VAD-FMK可誘導(dǎo)擬缺血再灌注損傷BMECs發(fā)生Necroptosis。

圖3 透射電鏡觀察各組細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)

注：a：正常組；b、c：IRI組；d、e、f：IRI+z-VAD-FMK組。

2.4 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞死亡方式 如圖4結(jié)果所示：與正常組相比，IRI組Q1、Q2、Q4象限細(xì)胞比率均顯著升高(Q2、Q4象限P<0.01)，Q3象限細(xì)胞比率顯著降低(P<0.01)，提示擬缺血再灌注損傷造成BMECs早期凋亡、晚期凋亡以及壞死率均顯著增加；與IRI組相比，IRI+z-VAD-FMK組Q1、Q2、Q3和Q4象限細(xì)胞比率變化不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為了證明Q2象限細(xì)胞為Necroptosis，我們另設(shè)了IRI+z-VAD-FMK+Nec-1組，即在上述處理的基礎(chǔ)上，利用Necroptosis抑制劑Nec-1進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果顯示，與IRI+z-VAD-FMK組相比，IRI+z-VAD-FMK+Nec-1組Q2象限細(xì)胞比率顯著降低(P<0.05)，Q3象限比率顯著升高(P<0.01)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明Nec-1可顯著降低Q2象限細(xì)胞比率，提示OGD+z-VAD-FMK組Q2象限細(xì)胞死亡形式可能是Necroptosis。

組別NQ1Q2Q3Q4正常組346±0452±15892±1010±07IRI組3123±74148±54△△671±41△△58±20△△IRI+z?VAD?FMK組3131±66138±41668±2162±77IRI+z?VAD?FMK+Nec?1組380±3682±22▲804±13▲▲34±22

圖4 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測細(xì)胞死亡方式

注：與正常組比：△△P<0.01；與IRI+z-VAD-FMK組比：▲P<0.05，▲▲P<0.01。Q1:壞死細(xì)胞象限；Q2：晚期凋亡細(xì)胞象限；Q3：正常細(xì)胞象限；Q4：早期凋亡細(xì)胞象限。

3 討論

腦缺血后公認(rèn)的細(xì)胞死亡類型包括缺血核心區(qū)即刻發(fā)生的細(xì)胞壞死，以及隨后再灌注過程中的細(xì)胞凋亡。因此以往關(guān)于缺血再灌注損傷的研究多集中在細(xì)胞凋亡。2005年由哈佛大學(xué)課題組發(fā)現(xiàn)一種新型的細(xì)胞死亡形式，命名為Necroptosis，在國內(nèi)被翻譯為程序性壞死或壞死性凋亡，但以前者更被認(rèn)可[7]。研究表明，Necroptosis是由死亡受體介導(dǎo)的，被一系列信號傳導(dǎo)通路所調(diào)控的caspase非依賴性細(xì)胞死亡方式，同時(shí)具有壞死和凋亡的特征。在形態(tài)學(xué)方面，Necroptosis具有明顯的壞死特征，主要表現(xiàn)為細(xì)胞器腫脹、細(xì)胞膜完整性破壞，細(xì)胞核完整等[8]。此外，在Necroptosis過程中，會釋放大量損傷相關(guān)分子，引發(fā)嚴(yán)重的局部炎性反應(yīng)，導(dǎo)致大量炎性反應(yīng)細(xì)胞浸潤和激活[9]；而在其發(fā)生機(jī)制方面類似于凋亡，由特定因子啟動(dòng)，依賴于死亡受體并按照一定信號通路和程序發(fā)生，可以對其過程進(jìn)行調(diào)控，但其過程不依賴于caspase系統(tǒng)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)Necroptosis與腦缺血再灌注損傷關(guān)系十分密切，在缺血性腦中風(fēng)發(fā)病機(jī)制中占有重要地位，現(xiàn)已成為研究的熱點(diǎn)[10]，這也為研制開發(fā)神經(jīng)保護(hù)藥物提供了新的靶點(diǎn)。

為了深入研究抑制Necroptosis對缺血性腦損傷的意義，人們探索了一些體外誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生Necroptosis的方法，其中最常用的是在誘導(dǎo)凋亡的基礎(chǔ)上加用z-VAD-FMK進(jìn)行干預(yù)[11]。其原理為細(xì)胞的死亡受體激活后，如果凋亡通路活化則誘導(dǎo)凋亡，凋亡過程是依賴caspase的，在caspase活性被抑制時(shí)會啟動(dòng)Necroptosis。z-VAD-FMK是一種人工合成的廣譜caspase抑制劑，能夠抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生過程中多種caspase酶的活性，因此可以誘導(dǎo)Necroptosis的發(fā)生。

本實(shí)驗(yàn)采用擬缺血再灌注損傷結(jié)合z-VAD-FMK，探索了腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞Necroptosis模型。首先用cck-8篩選了缺血再灌注時(shí)間，由于實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)氧糖剝奪6 h時(shí)，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生急性缺血性損傷，因此本次實(shí)驗(yàn)從氧糖剝奪5 h以內(nèi)摸索缺氧缺糖時(shí)間，再摸索再灌時(shí)間。結(jié)果缺氧4 h和5 h時(shí)，細(xì)胞損傷已很嚴(yán)重(數(shù)據(jù)未顯示)，最后棄掉，只做了缺氧缺糖2 h和3 h不同再灌時(shí)間點(diǎn)的模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示缺氧缺糖2 h再灌注8 h時(shí)，細(xì)胞損傷明顯，且損傷主要發(fā)生在再灌后4～8 h，比較符合缺血再灌注損傷特點(diǎn)，因此確定該時(shí)間點(diǎn)作為模擬缺血再灌注損傷的時(shí)間點(diǎn)，建立了穩(wěn)定的IRI模型。

然后，在IRI的基礎(chǔ)上利用z-VAD-FMK進(jìn)行誘導(dǎo)，cck-8結(jié)果顯示IRI組OD值降低，IRI+z-VAD-FMK組與IRI組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能的原因?yàn)閦-VAD-FMK在抑制凋亡的同時(shí)誘導(dǎo)了另一種細(xì)胞死亡形式Necroptosis的發(fā)生，因此該組細(xì)胞活性總體沒有明顯升高。為了進(jìn)一步揭示z-VAD-FMK誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡形式，本實(shí)驗(yàn)又用Annexin V-FITC/PI雙染色法通過流式細(xì)胞儀來檢測，結(jié)果顯示z-VAD-FMK干預(yù)后各象限細(xì)胞比率變化不大。這一結(jié)果可能與Annexin V-FITC/PI雙染色法的原理和Necroptosis的細(xì)胞形態(tài)變化特征有關(guān)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，Annexin V-FITC可與外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，因此Annexin V-FITC陽性被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。PI是一種核酸染料，它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完整的細(xì)胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。z-VAD-FMK主要通過阻斷caspase來抑制凋亡，對早期凋亡影響不大；Q2象限為Annexin V和PI染色均為陽性的細(xì)胞，一般代表晚期凋亡細(xì)胞，z-VAD-FMK阻斷caspase后，通過磷酸化RIP3誘導(dǎo)Necroptosis的發(fā)生，Necroptosis細(xì)胞Annexin V和PI染色也表現(xiàn)為雙陽性，因此，z-VAD-FMK抑制了晚期凋亡，但增加了Necroptosis的發(fā)生，使得Q2象限細(xì)胞比率變化不明顯。為了證明Q2象限細(xì)胞的死亡方式為Necroptosis，我們另設(shè)了IRI+z-VAD-FMK+Nec-1組，即在上述處理的基礎(chǔ)上，增加了Necroptosis特異性抑制劑Nec-1干預(yù)，結(jié)果顯示Nec-1可有效降低Q2象限細(xì)胞比率，證明了Q2象限的細(xì)胞發(fā)生Necroptosis。該結(jié)果在投射電鏡中再次被證實(shí)，IRI+z-VAD-FMK組細(xì)胞膜破壞明顯，線粒體腫脹，內(nèi)脊消失呈空泡化，細(xì)胞核基本完整，這些變化符合Necroptosis的形態(tài)特征?？傊?，綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了：z-VAD-FMK可誘導(dǎo)擬缺血再灌注腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生Necroptosis，為以后研究缺血性腦中風(fēng)發(fā)生Necroptosis提供了細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

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(2016-08-16收稿 責(zé)任編輯：徐穎)

世界中醫(yī)藥大會第三屆夏季峰會暨大健康產(chǎn)業(yè)博覽會

由世界中醫(yī)藥學(xué)會聯(lián)合會主辦的“世界中醫(yī)藥大會”是全球中醫(yī)藥領(lǐng)域規(guī)模大、參與廣、層次高的學(xué)術(shù)盛會，至今已經(jīng)成功舉辦十三屆。為進(jìn)一步擴(kuò)大世界中醫(yī)藥大會的學(xué)術(shù)影響力，世界中聯(lián)特決定在境內(nèi)召開世界中醫(yī)藥大會夏季峰會，至今已經(jīng)成功主辦兩屆。世界中醫(yī)藥大會第三屆夏季峰會，將于2017年6月10—12日在安徽合肥召開，本次大會主題為“聚焦中醫(yī)藥大健康，助力‘一帶一路’發(fā)展”，現(xiàn)誠摯邀請來自世界各國(地區(qū))的中醫(yī)藥相關(guān)專家、學(xué)者與會，交流中醫(yī)藥理論研究、臨床經(jīng)驗(yàn)、科研成果以及新技術(shù)、新療法，聚焦大健康產(chǎn)業(yè)發(fā)展。大會將制作《世界中醫(yī)藥大會第三屆夏季峰會特刊》，收錄具備一定資質(zhì)的機(jī)構(gòu)和個(gè)人的相關(guān)宣傳資料，將贈與參會人員及我會67個(gè)國家的251個(gè)會員團(tuán)體、各國駐華使館、我國駐外使館及有關(guān)國際組織和相關(guān)機(jī)構(gòu)收藏。大會將制作大會論文集，論文截稿日期2017年5月20日，歡迎大家積極投稿。

報(bào)名聯(lián)系人：鄒建華、關(guān)濤、焦云洞、劉香玉、劉曉婷、陳安

電話：010-58650042/0043，010-58650242,傳真：010-58650043

報(bào)名網(wǎng)站：http://wccmss2017.medmeeting.org/cn

聯(lián)系郵箱：wfcmsxshb@vip.163.com

The Establishment of Necroptosis Model on Mimic Ischemic Reperfusion Injury in Brain Microvascular Endothelial Cells

Hu Yanhong1, Lei Hongtao2, Wang Shuyan1, Yu Xue1, Zhang Sai1, Su Jing1, Ma Jiabao1, Kang Soyeon1, Zhang Fan1, Wan Liangqin1, Zang Yanyan1, Li Fanghe1, Li Weihong1

(1BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China; 2MedicalResearchCenterofChineseAcademyofTraditionalChineseMedicine,Beijing100700,China)

Objective:To explore a model of necroptosis in brain microvascular endothelial cells (BMECs) by mimic ischemia-reperfusion injury combined with z-VAD-FMK (Benzyloxyearbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketone, z-VAD-FMK). Methods:First, primary rat BMECs were cultured in oxygen-glucose deprivation (OGD) and reintroduction conditions for various time points to screen a time of mimic ischemia-reperfusion injury. Then, z-VAD-FMK, the casepase inhibitor, was administrated at 20 μmol/L concentration on the ischemia-reperfusion injured BMECs. The cell activity was detected by CCK-8. The ultra-stucture was observed using the transmission electron microscope. The death mode of BMECs was detected using cell ultrastructure; Annexin V-FIT C/PI (propidium iodide) double staining to detect the type of cell death. Results:OGD 2 h and reintroduction 8 h was determined to be the time point of mimic ischemia-reperfusion injury. After z-VAD-FMK was administrated on ischemia-reperfusion injuried BMECs, the cells viability didn′t change significantly. The necroptosis characteristic was presented under transmission electron microscope. The flowcytometry results showed that ratio of cells in each quadrant had no significant change. However, Nec-1, a specific inhibitor of necroptosis, could significantly decrease the ratio of cells in quadrant Q2, suggesting that intervention of z-VAD-FMK inhibited the late apoptosis and induced necroptosis occurrence. Conclusion:The necroptosis may be induced by z-VAD-FMK in ischemia-reperfusion injured BMECs, which provides the cell experimental model for researching necroptosis mechanism in the ischemic stroke in the future.

Brain microvascular endothelial cells; Necroptosis; z-VAD-FMK; Ischemia-reperfusion injury

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81273885)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：7144223)

胡艷紅(1988.12—)，女，在讀碩士研究生，研究方向：中藥復(fù)方治療腦病的配伍機(jī)制研究

李衛(wèi)紅(1973.05—)，女,醫(yī)學(xué)博士,副教授，研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥治療腦病的基礎(chǔ)研究，E-mail:liweihong.403@163.com

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.04.043