水豪杰 王井玲

1 浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院 浙江 寧波 315100 2 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

基于酸性磷酸脂酶和淀粉酶活性測定的浙貝母道地性研究

水豪杰 王井玲

1 浙江省寧波市鄞州區(qū)第二醫(yī)院 浙江 寧波 315100 2 浙江中醫(yī)藥大學 浙江 杭州 310053

目的：比較不同產(chǎn)地浙貝母的酸性磷酸脂酶（ACP）和淀粉酶(AMY)活性。方法：采用對硝基酚比色法測定ACP活性，采用3,5-二硝基水楊酸比色法測定AMY活性，采用聚類分析方比較研究不同產(chǎn)地浙貝母ACP和AMY活性。結(jié)果：不同產(chǎn)地浙貝母的ACP和AMY活性存在較大差異，磐安冷水產(chǎn)的浙貝母兩酶活性最高，而江蘇浙貝母兩酶最低。結(jié)論：ACP和AMY活性比較研究可作為浙貝母來源鑒定的依據(jù)之一。

浙貝母 酸性磷脂酸酶 對硝基酚比色法 淀粉酶 3,5-二硝基水楊酸 聚類分析

浙貝母是百合科植物浙貝母Fritillatia thunbergii Miq.的干燥鱗莖，是浙江的道地藥材。目前，市場上的浙貝母多來源于浙江鄞州、新渥等地，江蘇、安徽等浙江附近省會也有生產(chǎn)。不同產(chǎn)地浙貝母藥用價值有顯著差異，但至今還未見關(guān)于不同產(chǎn)地浙貝母酸性磷酸酯酶（ACP）和淀粉酶（AMY）活力比較研究方面的報道。本文比較來源于冷水、新渥、永康、縉云、東陽、龍觀、鄞州、章村、江蘇等9個不同產(chǎn)地浙貝母中ACP和AMY的活性，以期為浙貝母來源鑒定提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 材料：樣品浙貝母購于冷水、新渥、永康、縉云、東陽、龍觀、鄞州、章村、江蘇等9個不同地區(qū)；經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學藥學院俞冰老師鑒定，均為百合科貝母屬植物浙貝母的干燥鱗莖，符合中國藥典2015年版的規(guī)定。

1.2 儀器與試劑：分述如下。

1.2.1 儀器：KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JH-09-03紫外分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；DS-1高速組織搗碎機（上海標本模型廠制造）；BCD-216F伊萊克斯冰箱（湖南長沙伊萊克斯電器有限公司）。

1.2.2 試劑：三羥甲基氨基甲烷（生化試劑，批號：F20090611，國藥集團化學試劑有限公司），對硝基酚（分析純，批號：20120329，上海凌風化學試劑有限公司），麥芽糖(生化試劑，批號：20090305，上海伯奧生物科技有限公司)，淀粉(分析純，批號：20110325，上海申汕實業(yè)有限公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 供試樣品的制備：取浙貝母樣品洗凈，稱重后勻漿，加入10mmol·L-1Tris HCl緩沖液（含0.15mol·L-1NaCl，pH7.4）100ml，置4℃下浸提24h，4600r·min-1離心30min，吸取上清液lml，10000r·min-1離心5min，上清液0.22μm濾膜濾過，即得測定用樣品，放入4℃冰箱儲存。

2.2 酸性磷酸酯酶活力測定：分述如下。

2.2.1 對硝基酚標準曲線的繪制：取7支干凈的具塞刻度試管，編號，分別取對硝基酚標準溶液（60μmol·L-1）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml依次加入到試管中，用0.02mol·L-1NaOH補至6ml，混勻。以1號管作為空白調(diào)零點，在405nm波長下測定各管吸光度。以對硝基酚含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2.2 酶活力測定：將樣品用蒸餾水配制成濃度為0.1mg·ml-1的酶液，取0.5ml 0.02mol·L-1對硝基苯磷酸二鈉，1.5ml pH4.6乙酸緩沖液，于試管中混合后，在37℃預熱5min，加入0.5ml酶液，立即混勻并記時，37℃準確保溫20min，加入lml 0.5mol·L-1NaOH終止酶反應(yīng)，以先加入NaOH后再加酶液作為空白，然后于405nm處測吸光度。

2.2.3 不同產(chǎn)地酸性磷酸酯酶活力值：根據(jù)吸光度在對硝基酚標準曲線上查出相應(yīng)的對硝基酚含量。一個酶活力單位定義為：單位時間內(nèi)（1min）每毫升酶液反應(yīng)產(chǎn)生1nmol對硝基酚為1個酶活力單位。

2.3 淀粉酶活力測定：分述如下。

2.3.1 麥芽糖標準曲線測定：取7支干凈的具塞刻度試管，編號，分別取麥芽糖標準溶液(1mg·ml-1)0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0ml依次加入到試管中，用蒸餾水補足至2ml，向各試管中加入2ml DNS，搖勻，置沸水浴中煮沸5min。取出后流水冷卻，加蒸餾水定容至20 ml。以l號管作為空白調(diào)零點，在540nm波長下測定吸光度。以麥芽糖含量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2.3.2 酶活力測定：取測定樣品用蒸餾水配制成濃度為0.02mg·ml-1的酶液，取1ml酶液，置于40℃恒溫水浴中保溫10min，加入lml 1%淀粉溶液，在40℃恒溫水浴中準確保溫5min，加入2ml DNS，在沸水浴中加熱5min，迅速用冷水沖洗冷卻，加蒸餾水定容至20ml，以第一次保溫前加入DNS試劑作為對照，540nm處測吸光度。

2.3.3 不同產(chǎn)地淀粉酶活力值：根據(jù)吸光度在麥芽糖標準曲線上查出相應(yīng)的麥芽糖含量，淀粉酶活力以單位時間內(nèi)(1min)每毫升酶液催化反應(yīng)所得1mg麥芽糖為一個酶活力單位。比活力為每毫克蛋白所含的酶活力單位數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)分析：對9個產(chǎn)地樣品進行分析。取不同產(chǎn)地浙貝母的酸性磷酸酯酶酶活力平均值作為變量，運用SPSS l8.0軟件對其進行系統(tǒng)聚類分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 對硝基酚標準曲線繪制：以對硝基酚濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得到線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)R2，y=0.0182x-0.0019，R2=0.9998吸光度在0～0.36A范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2 麥芽糖標準曲線繪制：在540nm處測定吸光度值下，以吸光度(y)對濃度(x)進行線性回歸，得回歸方程y=5.2422x+0.001，R2=0.9994。實驗結(jié)果表明，麥芽糖在0.0～0.1mg/ml濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

3.3 不同產(chǎn)地浙貝母的酸性磷酸酯酶活力值比較：見表1。不同產(chǎn)地浙貝母中酸性磷酸酯酶活力大小均有差異，冷水地區(qū)活力最高，江蘇地區(qū)活力最低，冷水地區(qū)浙貝母的酸性磷酸酯酶最大活力值是江蘇地區(qū)的最小活力值的近兩倍。

表1 不同產(chǎn)地浙貝母的酸性磷酸酯酶活力值

3.4 不同產(chǎn)地浙貝母的淀粉酶活力值比較：見表2。不同產(chǎn)地浙貝母中淀粉酶活力大小均有差異，冷水浙貝母活力最高，江蘇活力最低。冷水和新渥以及永康在數(shù)值上較為接近，縉云、東陽、龍觀、鄞州的浙貝母活力值相近。

表2 不同產(chǎn)地浙貝母淀粉酶活力值

3.5 聚類分析：9個樣品大致可以分為4類（見圖1）。冷水、新渥地區(qū)浙貝母樣品聚為Ⅰ類，兩者樣品中2種酶的活力最大?？N云、永康、東陽地區(qū)浙貝母樣品聚為Ⅱ類。龍觀、章村、鄞州地區(qū)浙貝母樣品聚為Ⅲ類，主要是這些樣品中3種酶的活力均接近，活力較低。江蘇地區(qū)浙貝母樣品單獨聚為Ⅳ類，與其他3類距離最遠，其酶活力明顯低于其他3類。以上結(jié)果可以為浙貝母來源鑒定提供依據(jù)。

圖1 9個不同產(chǎn)地浙貝母樣品聚類圖

4 討論

本研究結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地浙貝母中酸性磷酸酯酶和淀粉酶活力均存在差異。冷水、新渥屬磐安縣，永康、東陽屬金華市，龍觀、鄞州、章村都屬寧波市。這種差異可能是因為不同地區(qū)的溫度、光照、濕度等環(huán)境生長因素不同造成的，確切原因有待進一步研究。以上結(jié)果可以為浙貝母來源鑒定提供依據(jù)。

2016-07-25