王青華 朱敏豐

浙江省湖州市中醫(yī)院 浙江 湖州 313000

實(shí)驗(yàn)研究

補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制的初步研究

王青華 朱敏豐

浙江省湖州市中醫(yī)院 浙江 湖州 313000

目的：考察自擬補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行初步探討。方法：MTT法檢測(cè)不同濃度自擬補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒分別在24、48、72小時(shí)對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)細(xì)胞周期的影響，Western Blot法檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)。通過進(jìn)一步檢測(cè)HeLa細(xì)胞內(nèi)源性活性氧及氧化還原實(shí)驗(yàn)，考察補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)源性活性氧（ROS）分泌、超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，還原型谷胱甘肽（GSH）的含量影響。結(jié)果：自擬補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的生長具有抑制作用；能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生變化，將細(xì)胞阻滯在G0期，抑制細(xì)胞增殖；能夠劑量依賴性地激活Caspase-3蛋白，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡；另外，還能夠通過增加細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶（劑）SOD和GSH的活性，降低CAT的活性，來增加細(xì)胞內(nèi)ROS的自分泌，調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)。結(jié)論：自擬補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖有一定的抑制作用，對(duì)其凋亡有一定的誘導(dǎo)作用，這種作用可能與其改變細(xì)胞內(nèi)部的氧化還原狀態(tài)有關(guān)。

補(bǔ)腎抗癌方 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 Caspase-3 氧化還原 實(shí)驗(yàn)研究

自擬補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒由知母、生地黃、黃柏、墨旱蓮、重樓、澤瀉、白花蛇舌草組成，本文旨在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的方法，初步觀察自擬補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖及凋亡的作用，并初步探討其可能機(jī)制，以期為藥品研究開發(fā)和臨床治療應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)及理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑：分述如下。

1.1.1 試驗(yàn)藥物：補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒：知母（批號(hào)1511002S）5g，生地黃（批號(hào)1511001W）5g，黃柏（批號(hào)1511001S）3g，墨旱蓮（批號(hào)1511001W）10g，重樓（批號(hào)1511001W）7.5g，澤瀉（批號(hào)1511002W）5g，白花蛇舌草（批號(hào)1511001S）15g。全部藥物均由華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。給藥前，將一劑補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒加入50.5ml磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH=7.0）溶解，通過0.22μm的微孔濾膜，配制成1g/ml的母液備用。

1.1.2 試劑：RPMI-1640培養(yǎng)基（Gibco公司，批號(hào)8111024）；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，批號(hào)NVW0526）；噻唑藍(lán)（MTT）（碧云天生物技術(shù)研究所，批號(hào)C0007）；二甲基亞砜（DMSO）（Sigma公司，批號(hào)D8419）；胰蛋白酶細(xì)胞消化液（碧云天，批號(hào)CD202）；碘化丙啶（PI）（碧云天，批號(hào)ST512）；RNA酶（碧云天，批號(hào)9001-99-4）；β-acting（Santa Cruz Biotechnology，批號(hào)D0212）；Caspase-3抗體（Cell SignalingTechnology公司，貨號(hào)14220）；HRP標(biāo)記山羊抗小鼠（中杉金橋，批號(hào)107936）；HRP標(biāo)記山羊抗兔（中杉金橋，批號(hào)108093）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天，貨號(hào)P0015）；細(xì)胞裂解液（碧云天，貨號(hào)P0014B）；Caspase-3單克隆抗體（Cell SignalingTechnology公司，貨號(hào)14220）；魯米諾（Nerck公司，批號(hào)2304331）；超氧化物歧化酶SOD試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150826）；谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20150923）；還原型谷胱甘肽試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20151016）

1.1.3 儀器：恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；CKX41倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；潔凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；水平搖床（北京市六一儀器廠）；電子天平（上海METTLER TOLEDO有限公司）；蛋白電泳系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；蛋白轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；電熱壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）；ECL凝膠成像系統(tǒng)（GE Healthcare公司）；流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter）；細(xì)胞培養(yǎng)皿（美國Corning公司）；0.22μm微孔濾膜（天津市科億隆實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理：人宮頸癌細(xì)胞（HeLa）購買自美國ATCC細(xì)胞庫。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%CO2、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，加入胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞的消化處理，之后將細(xì)胞懸液收集于10ml的離心管中，以1000～1200rpm離心5min，再將沉淀細(xì)胞用完全培養(yǎng)液進(jìn)行重懸，按1∶3在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行傳代培養(yǎng)，部分細(xì)胞用于如下細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 體外細(xì)胞增殖試驗(yàn)：采用MTT法檢測(cè)HeLa細(xì)胞增殖變化。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，以每孔約5～8×103個(gè)的細(xì)胞密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中；過夜貼壁后，分別加入終濃度為1、3、10mg/L方配方顆粒，每個(gè)藥物濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，空白對(duì)照組中加入相同體積的完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72h后，分別加入5mg/mlMTT（10μl/孔）溶液，4h后傾去培養(yǎng)液，每孔加入150μlDMSO溶液，振蕩10min使結(jié)晶充分溶解，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定570nm吸光度值（A）。細(xì)胞增殖抑制率=(A對(duì)照組－A藥物組)/A對(duì)照組×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞周期分布的測(cè)定：利用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞周期分布進(jìn)行監(jiān)測(cè)分析。取對(duì)數(shù)生長的HeLa細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105個(gè)/ml并接種于細(xì)胞板中。細(xì)胞貼壁生長后，分別加入不同濃度（1、3、10mg/L）配方顆粒，空白對(duì)照組給予等體積培養(yǎng)液；分別于培養(yǎng)24、48、72h時(shí)加入胰酶消化終止培養(yǎng)，收集細(xì)胞離心（1000rpm，5min），棄上清后用預(yù)冷的PBS反復(fù)洗滌細(xì)胞2次，再用70%冷乙醇使細(xì)胞懸浮固定，置于4℃過夜；檢測(cè)時(shí)，1500rpm離心5min去除乙醇，加入RNase置于37℃消化30min，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106個(gè)/ ml，加入PI混勻，室溫避光孵育30min進(jìn)行染色，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，采用Mod Fit 3.0軟件對(duì)細(xì)胞周期分布情況進(jìn)行分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 Caspase-3蛋白表達(dá)檢測(cè)：采用蛋白免疫印跡（Western Blot）方法對(duì)Caspase-3的蛋白表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。將藥物處理72h后的細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用PBS將細(xì)胞清洗3遍；加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min后收集細(xì)胞，4℃、12000rpm離心15min；吸取上清液，利用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將變性的細(xì)胞蛋白經(jīng)12%分離膠和4%濃縮膠SDS-PAGE凝膠電泳進(jìn)行分離，轉(zhuǎn)移印跡至PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶室溫輕搖封閉1h，用PBS-T漂洗，放入一抗（1:1000）中4℃輕搖孵育過夜；PBS-T清洗3遍，加入二抗（1:5000）室溫輕搖孵育1h，漂洗后加ECL顯色液進(jìn)行顯色，利用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯色曝光。

1.6 細(xì)胞自分泌總活性氧（ROS）測(cè)定：用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定ROS的水平。收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液，使用不含酚紅的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml，預(yù)熱至37℃，加入魯米諾發(fā)光試劑，置于恒溫37℃的發(fā)光儀測(cè)定室中，測(cè)定1min內(nèi)的發(fā)光強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞內(nèi)SOD活性檢測(cè)：用堿性二甲基亞楓—魯米諾化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。利用SOD標(biāo)準(zhǔn)品繪制SOD標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定時(shí)，將細(xì)胞制成密度為1×106個(gè)/ml懸液，將細(xì)胞破碎并冷凍離心，取上清液加入到測(cè)量管中，加入20μl鄰苯三酚，用魯米諾緩沖液定容至1ml。立即測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。

1.8 細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）含量的檢測(cè)：采用分光光度法測(cè)定。收集細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液（1×106個(gè)/ ml），將細(xì)胞破碎處理后加入300μl25%偏磷酸沉淀蛋白。取100μl上清液加到試管中，再加入1.8mlPBS和100μlOPT，混勻，室溫反應(yīng)15min。測(cè)定420nm處的熒光值。

1.9 細(xì)胞內(nèi)過氧化氫酶（CAT）活性檢測(cè)：利用紫外分光光度法測(cè)定CAT活性。首先測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)OD值。收集細(xì)胞上清液0.5ml，加入過氧化氫在冰水浴中反應(yīng)3min，再加入1ml硫酸反應(yīng)3min，最后加入7ml高錳酸鉀反應(yīng)1min，在480nm處測(cè)定吸光度值。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響：24h時(shí)，3、10mg/L配方顆粒能夠顯著抑制細(xì)胞增殖，48h和72h時(shí)，所有濃度藥物均能抑制，與空白對(duì)照組比較，具有顯著性差異（P＜0.05）；同一時(shí)間點(diǎn)隨濃度的增加，抑制作用增強(qiáng)；同一濃度下，隨時(shí)間的延長，抑制率增加。表明配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。見表1。

2.2 補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞周期分布的影響：經(jīng)配方顆粒處理后，所有時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞中G0/G1期和G2/M期細(xì)胞所占比例均發(fā)生顯著改變（P＜0.05）。在同一時(shí)間點(diǎn)，隨著藥物濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞所占比例增加，S和G2/M期細(xì)胞均減少；在同一濃度藥物作用下，隨作用時(shí)間延長，G0/G1期細(xì)胞有所增加，而S和G2/M期細(xì)胞所占比例均減少。結(jié)果表明配方顆?？墒笹0期細(xì)胞增多（P＜0.05），M期細(xì)胞減少（P＜0.05），將細(xì)胞阻滯在G0期，并縮短有絲分裂期，抑制細(xì)胞增殖，并且呈現(xiàn)時(shí)間和劑量上的依賴性。見表2。

表1 不同濃度配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制作用（±s,n=6）

表1 不同濃度配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞的生長抑制作用（±s,n=6）

注：與空白對(duì)照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

抑制率（%）0 8.3 12.9*20.9**0 14.8*23.8***29.1***0 11.5*24.9**34.9***A570藥物濃度（mg/L）組別空白對(duì)照藥物作用24h 0 1 3 1空白對(duì)照藥物作用48h 0 0 1 3 1空白對(duì)照藥物作用72h 0 0 1 3 1 0 0.517±0.011 0.474±0.047 0.450±0.043 0.409±0.039 0.652±0.034 0.555±0.022 0.497±0.035 0.462±0.030 0.862±0.040 0.763±0.014 0.647±0.024 0.561±0.040

表2 射線照射和配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響（±s,n=3）

表2 射線照射和配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響（±s,n=3）

注：與空白對(duì)照比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別 各期細(xì)胞所占百分比藥物濃度（mg/L）S空白對(duì)照藥物作用24h藥物作用48h -1 3 1 1 3 1藥物作用72h G2/M 25.3±2.85 16.0±0.98*12.9±1.33**15.8±1.67*15.7±0.77*15.6±1.70*15.7±1.11*12.0±0.18**12.1±1.88**9.5±1.42**0 1 3 1 0 G0/G152.3±1.03 67.0±2.10*73.4±2.09**74.4±1.19**67.5±2.09*68.0±2.22*74.7±1.50**75.0±2.17**75.1±2.30**75.7±1.48**22.4±1.24 17.1±3.38 13.7±1.07 9.8±2.32*16.8±3.97 16.4±1.48 9.7±2.80 13.1±3.28 12.9±1.07 15.5±2.85

2.3 補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白表達(dá)的影響：配方顆粒作用于HeLa細(xì)胞后72h采用Western Blot測(cè)定蛋白表達(dá)量。隨著濃度劑量增加，酶原形式的Caspase-3表達(dá)量逐漸減少，切割形式的Caspase-3表達(dá)量增加，說明配方顆粒能夠激活HeLa細(xì)胞內(nèi)Caspase-3，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。見圖1。

圖1 補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)Caspase-3的影響

2.4 補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞自分泌總ROS的影響：與空白對(duì)照組比較，在不同時(shí)間點(diǎn)，不同濃度的配方顆粒均能顯著抑制HeLa細(xì)胞內(nèi)總ROS的自分泌（P＜0.05）。在同一時(shí)間點(diǎn)，增大配方顆粒的濃度，則抑制率升高，呈劑量依賴性；對(duì)于同一濃度，隨作用時(shí)間延長，抑制作用也隨之增加，呈時(shí)間依賴關(guān)系。表明配方顆粒能夠時(shí)間和劑量依賴性地抑制HeLa細(xì)胞總ROS的自分泌。見表3。

表3 配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞自分泌總ROS的影響

2.5 補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒對(duì)HeLa細(xì)胞抗氧化酶（劑）活性的影響：藥物作用24h時(shí)，10mg/L的配方顆粒能顯著引起SOD活性增強(qiáng)和CAT活性降低（P＜0.05）；48h時(shí)所有劑量藥物都能顯著增強(qiáng)SOD活性，而3和10mg/L的藥物能夠降低CAT活性和GSH含量（P＜0.05）；72h時(shí)所有劑量藥物都能顯著增強(qiáng)SOD活性和GSH含量，同時(shí)降低CAT活性（P＜0.05）。在同一劑量的配方顆粒作用下，隨著作用時(shí)間延長，能夠增加HeLa細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶SOD和GSH活性，降低CAT活性；在同一時(shí)間內(nèi)，隨著藥物濃度增加，SOD和GSH活性隨之增強(qiáng)，但CAT活性降低。表明配方顆粒能夠增強(qiáng)SOD和GSH活性并降低CAT活性，且以上指標(biāo)均具有時(shí)間和劑量依賴性。見表4。

表4 配方顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)源抗氧化酶（劑）的影響（±s)

表4 配方顆粒對(duì)細(xì)胞內(nèi)源抗氧化酶（劑）的影響（±s)

注：與空白對(duì)照比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

GSH (A/106cells) 0.49±0.01 0.49±0.04 0.48±0.06 0.48±0.02 0.49±0.01 0.53±0.01*0.55±0.05*0.50±0.03*0.53±0.02*0.57±0.04**組別空白對(duì)照藥物作用24h藥物濃度（mg/L）0 1 3 1藥物作用48h 0 1 3 1藥物作用72h 0 1 3 1 0 SOD (U/106cells) 533±96 574±62 652±69 846±161*702±155*843±83*1194±151**1057±78**1194±144**1600±216***CAT (K/106cells) 0.74±0.01 0.71±0.03 0.64±0.06 0.46±0.02**0.67±0.05 0.61±0.01*0.37±0.05**0.41±0.02**0.37±0.05**0.26±0.05***

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明補(bǔ)腎抗癌方配方顆?？赡芫哂兄委煂m頸癌的潛力。它能使細(xì)胞周期的分布發(fā)生變化，導(dǎo)致大多數(shù)細(xì)胞停滯于G0期，阻滯向G1期的轉(zhuǎn)化，從而降低了DNA的合成和有絲分裂的進(jìn)程，減慢了細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞的分化。能夠促使Caspase-3激活，劑量依賴性地增加Caspase-3從酶原形式轉(zhuǎn)變成為活化狀態(tài)的小片段，從而發(fā)揮誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用。能夠降低HeLa細(xì)胞內(nèi)總ROS的自分泌，同時(shí)上調(diào)SOD活性和GSH的含量，降低CAT活性，表明補(bǔ)腎抗癌方配方顆?？赡苁峭ㄟ^改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，從而調(diào)節(jié)ROS的動(dòng)態(tài)平衡。綜上所述，本研究證實(shí)補(bǔ)腎抗癌方配方顆粒具有抑制HeLa細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)抗氧化酶活性，從而改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)在氧化還原狀態(tài)有關(guān)。

2016-10-12