王 健， 張升敏， 吳佳勉， 盧卓才， 楊建榮， 巫泓生， 陳 浩， 林 波， 許榮華， 曹天生△

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬花都人民醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510800； 2海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科，海南 海口 570102)

基于癌癥基因圖集數(shù)據(jù)庫(kù)與免疫組織化學(xué)方法分析SMARCB1對(duì)肝細(xì)胞癌早期診斷及預(yù)后的作用*

王 健1， 張升敏1， 吳佳勉1， 盧卓才1， 楊建榮1， 巫泓生1， 陳 浩1， 林 波1， 許榮華2△， 曹天生1△

(1南方醫(yī)科大學(xué)附屬花都人民醫(yī)院普外科，廣東 廣州 510800；2海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤外科，海南 海口 570102)

目的： 通過(guò)研究SMARCB1在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)組織的表達(dá)，闡明其對(duì)HCC的早期診斷及預(yù)后的作用。方法: 在癌癥基因組圖集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出SMARCB1基因，運(yùn)用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)技術(shù)和TCGA分析SMARCB1在HCC組織和正常組織的表達(dá)情況，闡述其在HCC發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中的作用。 結(jié)果: IHC結(jié)果證實(shí)，與正常肝組織相比，HCC中SMARCB1的蛋白表達(dá)量顯著上升(P<0.01)。IHC的結(jié)果顯示SMARCB1的蛋白表達(dá)量與原發(fā)腫瘤分期呈正相關(guān)(P<0.05)，即SMARCB1表達(dá)量越高，原發(fā)腫瘤分期越趨向晚期。TCGA的結(jié)果顯示SMARCB1的高表達(dá)是HCC的獨(dú)立預(yù)后因素(P<0.05)。 結(jié)論:SMARCB1可能起著促癌基因的作用，臨床上根據(jù)其在組織中的表達(dá)差異，可鑒別早期的HCC及良性組織，并可能有效地進(jìn)行預(yù)后判斷。

肝細(xì)胞癌； SMARCB1； 診斷； 預(yù)后

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上第五大惡性腫瘤，病死率高居第3位[1-2]。我國(guó)是乙型肝炎大國(guó)，約有3 000萬(wàn)慢性病毒性肝炎患者，而慢性病毒性肝炎可逐漸演變?yōu)楦斡不?，其?0%左右的肝硬化患者晚期可合并HCC，我國(guó)已成為全世界HCC高發(fā)地區(qū)之一[3-4]。根據(jù)預(yù)后的不同，HCC患者可以采取切除，肝移植，姑息性治療等治療手段[5]。但臨床上，仍然沒(méi)有一種公認(rèn)臨床方法能準(zhǔn)確地診斷HCC腫瘤及預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后。

SMARCB1(SWI/SNF-related, matrix-associated,actin-dependent regulator of chromatin,subfamily b,member 1)位于22號(hào)染色體長(zhǎng)臂11區(qū)13帶。由于SMARCB1在惡性橫紋肌樣瘤組織中雙等位基因失活，SMARCB1被認(rèn)為屬于抑癌基因[6]。同時(shí)，作為一種結(jié)合蛋白，它能結(jié)合人類(lèi)免疫缺陷病毒1 整合酶(human immunodeficiency virus-1 integrase，HIV-1 INT;一種逆轉(zhuǎn)錄病毒的DNA整合到宿主細(xì)胞所必須的整合酶)，從而激活HIV-1 INT活性，使逆轉(zhuǎn)錄病毒雙鏈DNA整合至宿主DNA中[7]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)DNA整合入人類(lèi)肝細(xì)胞DNA與原發(fā)性HCC的發(fā)生密切相關(guān)[8-9]。然而，SMARCB1在HCC中臨床意義還沒(méi)有被詳細(xì)闡述。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 臨床組織芯片 免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry，IHC)分析所使用的組織芯片購(gòu)自西安艾麗娜生物科技有限公司，芯片編號(hào)為L(zhǎng)V809，點(diǎn)直徑為1.5 mm，該芯片包含70例HCC組織及8例正常肝組織，均已經(jīng)過(guò)病理確診。

1.2 癌癥基因組圖集(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫(kù) 為了在HCC患者中找到并確定與腫瘤進(jìn)展及診斷有關(guān)的候選基因，我們?cè)赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)(包括337例臨床樣本相應(yīng)的mRNA的高通量測(cè)序數(shù)據(jù))中篩選出具有生存期與生存狀態(tài)的134例HCC。應(yīng)用R語(yǔ)言軟件進(jìn)行對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)(log-rank test)分析所有的20 485個(gè)基因的表達(dá)量高低(以表達(dá)量中位數(shù)為分界點(diǎn))對(duì)患者生存時(shí)間的影響，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義挑選研究的目標(biāo)基因。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)庫(kù)中所有的134例患者都進(jìn)行了0～107個(gè)月(平均20個(gè)月)不等的隨訪。

2 臨床組織芯片的IHC分析

臨床標(biāo)本組織被切成厚度為4 μm的石蠟切片，二甲苯脫蠟后水化使之能夠進(jìn)行IHC-DAB染色，染色在DAKO EnVision 系統(tǒng)中進(jìn)行。簡(jiǎn)短地進(jìn)行蛋白酶消化和過(guò)氧化物酶阻斷后，按1∶400的比例稀釋 I 抗(Abcam)，將稀釋后的 I 抗孵育切片，4 ℃過(guò)夜。次日洗凈切片，用過(guò)氧化物標(biāo)記的多聚物及色原體基質(zhì)處理以發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白的染色情況。具體評(píng)分方法如下：取10個(gè)典型的顯微鏡下視野并數(shù)出陽(yáng)性染色細(xì)胞數(shù)，計(jì)算出陽(yáng)性細(xì)胞比例，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)，細(xì)胞質(zhì)染色即為陽(yáng)性。由于目標(biāo)蛋白染色的異質(zhì)性，對(duì)腫瘤切片評(píng)分采取半定量的方式。根據(jù)染色細(xì)胞的比例(<5%為0分; 6%～25%為1分; 26%～50%為2分; 51%～75%為3分; >75%為4分)及染色的深度(陰性為0分; 弱陽(yáng)性為1分; 中等陽(yáng)性為2分; 強(qiáng)陽(yáng)性為3分)來(lái)評(píng)定每一個(gè)腫瘤組織切片目的蛋白表達(dá)水平。染色細(xì)胞比例評(píng)分及染色深度評(píng)分相乘構(gòu)成了最終的免疫反應(yīng)評(píng)分(immunoreactivity score，IRS)。

3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件包處理。IHC評(píng)分的所有2×2表格進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)，非2×2表格進(jìn)行Pearson卡方檢驗(yàn)，TCGA數(shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，使用Kaplan-Meier方法和log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析，Cox危險(xiǎn)因素回歸模型用于分析單因素和多因素的生存分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 SMARCB1在HCC臨床組織標(biāo)本中表達(dá)上調(diào)

我們?cè)诎琀CC組織(70例)和正常肝組織(8例)的組織芯片中進(jìn)行SMARCB1的IHC檢測(cè)。在HCC組織中，SMARCB1在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)較強(qiáng)；在正常肝組織中，SMARCB1表達(dá)較弱；IRS結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，HCC組織內(nèi)SMARCB1的蛋白表達(dá)量上升(P<0.01)，見(jiàn)圖1。

此外，2×2表格統(tǒng)計(jì)分析的結(jié)果顯示SMARCB1在HCC組織內(nèi)蛋白表達(dá)量上升(P<0.01)，在原發(fā)腫瘤分期晚期的HCC組織內(nèi)蛋白表達(dá)量亦上升(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2 SMARCB1表達(dá)量對(duì)于預(yù)后的作用

在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中我們使用Kaplan-Meier 圖表分析HCC患者總體生存率與SMARCB1表達(dá)量之間的聯(lián)系。SMARCB1高表達(dá)組比低表達(dá)組有更短的生存期(P<0.01)，見(jiàn)圖2。

隨后我們進(jìn)一步對(duì)SMARCB1在預(yù)后中的作用進(jìn)行分析。在單因素分析中，高表達(dá)組與低表達(dá)組在生存期上也表現(xiàn)出明顯差異(HR 為2.013， 95% CI為1.203～3.371，P<0.01)。此外，在多因素分析結(jié)果中，表達(dá)上調(diào)的SMARCB1(HR為 2.068, 95% CI 為1.015～4.214，P<0.05)是預(yù)后獨(dú)立的預(yù)測(cè)因子，見(jiàn)表2。

Figure 1.Immunohistochemical staining of cancer tissues and normal tissues. Mean±SD.**P<0.01vsnormal.

圖1 HCC組織及正常肝組織的免疫組化結(jié)果

表1 SMARCB1 IHC結(jié)果

Figure 2.The expression of SMARCB1 was associated with the overall survival in the HCC patients.

圖2 SMARCB1表達(dá)相關(guān)的總體生存率曲線

表2 COX風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型中SMARCB1表達(dá)量對(duì)預(yù)后的價(jià)值

Table 2.Association between overall survival and SMARCB1 expression in Cox regression model

AnalysisOverallsurvivalHazardratio(95%CI)PUnivariateanalysis Gender(malevsfemale)1.312(0.782-2.201)0.304 Age(≥60vs<60)0.654(0.382-1.121)0.123Tumorstage(T1-T2vsT3-T4)1.315(0.794-2.178)0.288 Nodestage(N0vsN1-N2)0.676(0.091-5.005)0.702 Metastasisstage(M0vsM1)2.917(0.879-9.674)0.080 SMARCB1(lowexpression vshighexpression)2.013(1.203-3.371)0.008Multivariateanalysis Gender(malevsfemale)1.521(0.705-3.284)0.285 Age(≥60vs<60)0.542(0.248-1.183)0.124Tumorstage(T1-T2vsT3-T4)1.584(0.764-3.283)0.216 Nodestage(N0vsN1-N2)1.291(0.161-10.330)0.810 Metastasisstage(M0vsM1)2.044(0.524-7.978)0.303 SMARCB1(lowexpression vshighexpression)2.068(1.015-4.214)0.045

討 論

HCC是一種高病死率的惡性腫瘤。由于大多數(shù)HCC患者有肝炎、肝硬化等基礎(chǔ)肝臟疾病，發(fā)病初期較隱匿，臨床診斷時(shí)多已發(fā)展至中晚期，且常伴有肝內(nèi)或肝外轉(zhuǎn)移，治療效果差[10]。近年來(lái)，隨著IHC等技術(shù)的發(fā)展，在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了有效的生物標(biāo)記物[11-12]。然而，仍然沒(méi)有一種有效的生物標(biāo)記物能準(zhǔn)確地診斷HCC腫瘤及預(yù)測(cè)HCC患者預(yù)后。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與正常肝組織相比，HCC組織中SMARCB1蛋白表達(dá)量明顯上升，SMARCB1蛋白表達(dá)量與原發(fā)腫瘤分期呈正相關(guān)，SMARCB1的mRNA表達(dá)量是HCC患者預(yù)后的獨(dú)立因素。

在前人的研究中，由于SMARCB1雙等位基因失活伴隨著惡性橫紋肌樣瘤的發(fā)生，并且在上皮樣肉瘤、腎髓質(zhì)癌和未分化肉瘤中檢測(cè)到SMARCB1表達(dá)缺失，SMARCB1被認(rèn)為屬于抑癌基因[6，13]。但我們的研究結(jié)果表明SMARCB1在HCC中可能具有促癌作用。SMARCB1致癌的機(jī)理可能與其參與逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合進(jìn)入宿主基因組的過(guò)程有關(guān)。在逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組整合進(jìn)入宿主基因組的過(guò)程中，SMARCB1參與組成改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)的SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物，并結(jié)合與激活HIV-1 INT等相關(guān)蛋白，從而使逆轉(zhuǎn)錄病毒整合進(jìn)入相應(yīng)位置，病毒整合可導(dǎo)致宿主染色體失穩(wěn)及DNA 重排, 基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)的異常不斷積累, 最終導(dǎo)致細(xì)胞表型改變及惡性轉(zhuǎn)化[14-15]。Kalpana等[14]的研究已經(jīng)證實(shí)，在酵母雙雜交系統(tǒng)中，SMARCB1能結(jié)合與激活HIV-1 INT，一種逆轉(zhuǎn)錄的病毒DNA整合到宿主細(xì)胞所必須的整合酶。張婷等[15]的研究則證實(shí)，HBV序列整合是HCC發(fā)生中的一個(gè)早期事件。我們的研究結(jié)果顯示，與正常肝組織相比，HCC組織內(nèi)SMARCB1的蛋白表達(dá)量顯著上升，這與上述研究結(jié)果相一致。

本研究表明SMARCB1可能在HCC發(fā)生預(yù)測(cè)中扮演重要角色，SAMRCB1的表達(dá)增加可能會(huì)有效地預(yù)測(cè)HCC患者的預(yù)后。這些研究結(jié)果在HCC基因診斷方面豐富了SMARCB1的意義和內(nèi)涵，不僅為認(rèn)識(shí)HCC提供了新的視角，也為臨床工作者提供針對(duì)HCC患者制定個(gè)性化的治療方案。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Effect of SMARCB1 on early diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma

WANG Jian1, ZHANG Sheng-min1, WU Jia-mian1, LU Zhuo-cai1, YANG Jian-rong1, WU Hong-sheng1, CHEN Hao1, LIN Bo1, XU Rong-hua2, CAO Tian-sheng1

(1DepartmentofGeneralSurgery,HuaduDistrictPeople’sHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510800,China;2DepartmentofOncologySurgery,TheAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege,Haikou570102,China.E-mail:sywang36@163.com;xu9.student@126.com)

AIM: To illuminate the effect of SWI/SNF-related, matrix-associated, actin-dependent regulator of chromatin, subfamily b, member 1 (SMARCB1) in early diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma (HCC) by determining the clinical expression of SMARCB1 in HCC tissue and benign liver tissue. METHODS: The specific target geneSMARCB1 was selected from these genes by using The Cancer Genome Atlas (TCGA). SMARCB1 expression in HCC tissue and benign liver tissue was measured by immunohistochemistry. Further statistical analysis of TCGA was performed to illuminate the role of SMARCB1 on HCC occurrence and progression. RESULTS: Compared with the benign liver tissue, immunohistochemical staining showed that SMARCB1 expression was significantly up-regulated in the HCC tissue (P<0.01). In addition, SMARCB1 expression was significantly associated with advanced tumor stage (P<0.05). The relation between SMARCB1 expression at mRNA level and clinical prognosis was analyzed. The results indicated that high SMARCB1 expression was an independent prognostic factor for HCC (P<0.05). CONCLUSION:SMARCB1 may play a part as a carcinogenic gene in tumorigenesis. We can distinguish primary HCC samples from non-malignant samples according to its different clinical expression. High SMARCB1 expression probably predicts poor outcome in HCC patients.

Hepatocellular carcinoma; SMARCB1; Diagnosis; Prognosis

1000- 4718(2017)04- 0754- 04

2016- 06- 22

2016- 12- 22

海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.ZDXM2015080； No.309063)； 廣州市花都區(qū)科技和信息化局項(xiàng)目(No.15-HDWS-012)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.04.030

△通訊作者 曹天生 Tel: 020-86823779； E-mail： sywang36@163.com; 許榮華 Tel: 0898-66528114； E-mail: xu9.student@126.com