于淑娟 李太鴻 郭曉明 王智明 艾超 郭筱兵

(1.華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院, 廣東 廣州 510640; 2.華南理工大學(xué) 廣東省天然產(chǎn)物綠色加工與產(chǎn)品安全實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510640)

果膠是位于高等植物細(xì)胞壁中的一類異質(zhì)性多糖,結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜[1].典型的果膠分子結(jié)構(gòu)至少包括聚半乳糖醛酸聚糖(HG)、I型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(RG-I)等特異性結(jié)構(gòu)區(qū)域,HG是由α-D-半乳糖醛酸單元經(jīng)α-1,4-糖苷鍵連接而成的聚糖,RG-I則是由半乳糖醛酸和鼠李糖交替重復(fù)的線性長鏈、鼠李糖殘基上的C- 4位分別以β-(1→4)糖苷鍵和α-(1→5)糖苷鍵與阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯吡喃糖殘基相連組成,其主要存在于果膠主鏈的毛發(fā)區(qū).側(cè)鏈由中性糖(阿拉伯糖、鼠李糖和半乳糖等)組成[2].甜菜果膠是一種新型的乳化型果膠,圍繞甜菜果膠分子結(jié)構(gòu)與功能、活性的研究受到廣泛關(guān)注[2- 3].研究證實(shí),甜菜果膠分子結(jié)構(gòu)尤其復(fù)雜,除了典型的果膠組成單元外,側(cè)鏈還含有酚酸、蛋白等單元[4].甜菜果膠中的酚酸、蛋白等物質(zhì)中存在碳碳雙鍵、羰基、苯基等官能團(tuán)[5].這些基團(tuán)能吸收特定波長的紫外可見光,是甜菜果膠潛在的生色基團(tuán).

果膠作為天然的食品添加劑,在食品行業(yè)中對果膠的需求也急劇增加.而色澤體現(xiàn)食品自身的美學(xué)價值,是消費(fèi)者認(rèn)知食物品質(zhì)的直觀印象.理想的商品化果膠應(yīng)該是白色或淡黃色的粉末.然而,甜菜果膠存在色澤較深的問題[6],從而影響了甜菜果膠的感官品質(zhì).因此,如何降低甜菜果膠的色澤已成為提高甜菜果膠品質(zhì)的關(guān)鍵問題[7- 8].目前果膠脫色的方法主要有4種:醇氨溶液脫色、活性炭吸附脫色、化學(xué)法脫色(雙氧水氧化)以及樹脂吸附法脫色[6].雖然這些方法能改善果膠的色澤,但難以從分子結(jié)構(gòu)上解釋果膠呈色物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征.文中評價物理方法(醇洗、透析)和化學(xué)方法(雙氧水氧化)對甜菜果膠的脫色效果,并利用色差儀、高效陰離子色譜(HPACE)、高效液相體積排阻色譜(HPSEC)等技術(shù)探討色澤與甜菜果膠結(jié)構(gòu)單元的相關(guān)性.此外,文中還比較了不同脫色工藝對果膠色值、結(jié)構(gòu)與乳化性能的影響,以期為甜菜果膠的脫色提供理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

甜菜果膠,自制;鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、半乳糖醛酸,分析純,美國Sigma公司出品;果膠酶(Rapidase? C80 MAX),酶活為750 U/mL,荷蘭DSM公司出品;三氟乙酸,分析純,上海Aladdin生化科技股份有限公司出品;氫氧化鈉,色譜純,德國Merck公司出品;其他試劑均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 甜菜果膠液的制備

稱取一定量的甜菜果膠干粉溶于蒸餾水中,配制成10 g/L的果膠溶液,在室溫下磁力攪拌4 h(500 r/min),轉(zhuǎn)速6 000 r/min，離心沉降10 min,收集上清液放入4 ℃冰箱儲存,備用.

1.2.2 脫色工藝

醇洗:分別取100 mL果膠儲備液于4個500 mL燒杯中,加入3倍體積的乙醇(95%,體積分?jǐn)?shù)，余同),靜置2 h后離心沉降,取果膠沉淀,再分別用60%、70%、80%的乙醇200 mL重復(fù)洗滌3次,靜置2 h,離心沉降.取果膠沉淀復(fù)溶于水后,將樣品凍干.

透析:分別將100 mL果膠儲備液裝于截留分子質(zhì)量為3 000、8 000、14 000 u的透析袋中,置于去離子水中,每隔6 h換一次水并用磁力攪拌攪動,透析48 h后,收集樣品凍干.

H2O2漂白:各取果膠溶液50 mL于燒杯中,調(diào)節(jié)pH為11,設(shè)置果膠溶液-雙氧水體積比為100∶1、100∶2、100∶3、100∶4,在磁力攪拌下(150 r/min),將雙氧水與果膠溶液混合均勻,室溫靜置不同時間.除非另行注明,果膠溶液的脫色時間固定為1 h.脫色結(jié)束后,采用1 mol/L的HCl溶液,迅速將pH調(diào)回到3.5以終止反應(yīng),并將樣品凍干.

1.2.3 不同脫色工藝脫色效果表觀

色澤觀察:每組分別取凍干后的樣品溶解為相同質(zhì)量濃度(5 g/L)的溶液,取10 mL于具塞比色管中進(jìn)行比色,數(shù)碼相機(jī)拍照后,對比不同溶液的色澤差異.

色差值的測定:將相同濃度、相同體積的果膠溶液分別倒入培養(yǎng)皿中,采用便攜式色差儀(CR- 400,日本Konica公司生產(chǎn))分別測量各組的色差值,各選取不同部位重復(fù)測定3次,記錄ΔL、Δa、Δb值.

色值A(chǔ)420的測定[9]:色值A(chǔ)420表征甜菜果膠液的褐色差異.將凍干后的樣品溶解為相同質(zhì)量濃度(5 g/L)的溶液,蒸餾水作為空白調(diào)零,用紫外分光光度計分別測定各組樣品的色值A(chǔ)420,每組測量3次.

1.2.4 甜菜果膠結(jié)構(gòu)特性分析

半乳糖醛酸(GalA)含量測定[10]:配置半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液(50 mg/L),分別取40、120、240、360和400 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液置入10 mL具塞試管中,再相應(yīng)加入去離子水補(bǔ)充到相同體積,在冰浴條件下加入2.5 mL硼砂硫酸溶液,渦旋振蕩使其充分混均后,100 ℃水浴中反應(yīng)5 min,隨后加入40 μL顯色劑,空白樣則加入40 μL 0.5% NaOH溶液,渦旋振蕩使其完全混合,以空白樣品校零,樣品管于520 nm波長下測定其吸光值.根據(jù)吸光度與樣品濃度關(guān)系,繪制半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=31.519x+1.418 6,r2=0.999 1);果膠樣品測定時稱取樣品5 mg,充分溶解后定容到100 mL,取0.4 mL的樣品到10 mL的具塞試管中,其余步驟同上,樣品平行測定3次.

中性糖(NS)含量測定:參考Garna等[11]的方法并略作改動.稱取5 mg果膠樣品于消化管中,加入1 mL果膠酶溶液,45 ℃酶解24 h.再往酶解液中加入1 mL 2 mol/L的三氟乙酸(TFA),油浴加熱至110 ℃,保溫4 h后,用氨水調(diào)節(jié)pH至中性,終止酸解反應(yīng).水解液用蒸餾水定容到100 mL,過0.45 μm濾膜后,采用 ICS-5 000 型高效離子色譜儀定量分析中性糖組分.色譜柱采用高效陰離子交換柱CarboPac PA1(4×250 mm,戴安公司) 和 CarboPac PA1保護(hù)柱(4×50 mm,戴安公司),檢測器采用脈沖安培檢測器,淋洗程序?yàn)?～25 min,10 mmol/L NaOH;25～35 min,500 mmol/L NaOH.流速為1 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為25 μL.繪制鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、半乳糖(Gal)、葡萄糖(Glc)和木糖(Xyl)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,采用外標(biāo)法測定各單糖的含量.

阿魏酸(FA)含量測定[12]:將適量果膠樣品溶解于碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液(pH=10,100 mmol/L)中,以緩沖液作為空白調(diào)零,在375 nm下測定溶液的吸光值,樣品平行測定3次.

分子質(zhì)量分布曲線的測定[13]:利用高效液相-體積排阻色譜法(HPSEC)測定果膠的分子質(zhì)量分布曲線.樣品質(zhì)量濃度為1 g/L.色譜條件:Ultrahydrogel 2 000和Ultrahydrogel 1 000(300 mm×7.5 mm,美國Waters公司)進(jìn)行串聯(lián)排阻;流動相為100 mmol/L NaNO3，內(nèi)含0.4 g/L NaN3;流速為0.6 mL/min;采用2 414示差折光射檢測器(美國Waters公司)檢測;柱溫為35 ℃.

1.2.5 甜菜果膠乳化性分析

乳化活性(AE)及乳化穩(wěn)定性(SE)的測定:在Dalev等[14]方法基礎(chǔ)上略作改動.準(zhǔn)確稱取一定量的果膠樣品,置于100 mL燒杯中,用濃度為0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液(pH=3.5)將其配制成5 g/L的果膠溶液.待果膠完全溶解后與中鏈脂肪酸按1∶1(體積比)混合,10 000 r/min均質(zhì)2 min,得均勻水包油乳液.再分別移取4 mL乳液于15 mL具有刻度的離心管中,每組3平行,放入水浴鍋中于50 ℃水浴加熱2 h,以加速乳液分層.分別測量乳液總體積(VW)和乳化層體積(VEL).將上述樣品放在室溫下保存7 d,再次測量乳化層體積(VEL7).乳化活性AE、乳化穩(wěn)定性SE的評價方法為

AE=VEL/VW×100%

(1)

SE=VEL7/VEL×100%

(2)

乳化液顯微觀察:將新鮮乳液用去離子水稀釋5倍后,在光學(xué)顯微鏡下觀察乳液的粒度,放大倍數(shù)為200倍,在清晰的視野下,采用數(shù)碼相機(jī)拍攝油滴照片,隨后分析油滴的粒徑.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同處理方法對果膠色澤的影響

如圖1所示,甜菜果膠溶液在H2O2氧化作用下,顏色迅速褪去,而經(jīng)醇洗和透析處理后,顏色未見明顯改善.Δb值指示甜菜果膠溶液的黃藍(lán)色差,數(shù)值越大,色澤越偏黃,反之則色澤越偏藍(lán)[15].與對照樣相比,經(jīng)醇洗和透析處理后的溶液Δb值無顯著變化(P>0.05);而H2O2氧化脫色后色差值從1.71降至-0.11,溶液的色澤也相應(yīng)由黃褐色變?yōu)槌吻逋该?上述結(jié)果表明,呈色物質(zhì)可能源于甜菜果膠內(nèi)源性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)單元,而非以包裹或物理吸附等方式存在于甜菜果膠中.

a—蒸餾水;b—3%H2O2氧化0.5 h;c—原樣;d—透析(3 000 u);e—透析(8 000 u);f—透析(14 000 u);g—醇洗(60%);h—醇洗(70%);i—醇洗(80%)

Fig.1 Effect of different treatments on color value of sugar beet pectin solution

2.2 H2O2漂白處理對果膠色值的影響

如圖2所示,H2O2的脫色效果與H2O2體積分?jǐn)?shù)、脫色時間有關(guān).在受試H2O2體積分?jǐn)?shù)范圍內(nèi)(1%～4%),果膠溶液色值在15 min內(nèi)從0.139急劇下降為0.058～0.081.反應(yīng)1 h后,果膠溶液的色值基本趨于平緩.H2O2濃度為1%～3%時,脫色效果隨著H2O2濃度的增加而增強(qiáng);當(dāng)H2O2體積分?jǐn)?shù)達(dá)到3%時,脫色效果最好.但當(dāng)H2O2體積分?jǐn)?shù)為4%時,果膠顏色反而加深,這可能是H2O2氧化作用過于劇烈導(dǎo)致甜菜果膠碳化[16].

圖2 不同濃度H2O2漂白處理后的A420

Fig.2 Absorbance(A420) after H2O2bleaching under different concentrations

2.3 H2O2漂白處理對甜菜果膠化學(xué)特性的影響

如表1所示,在H2O2的脫色作用下,果膠的化學(xué)成分發(fā)生了顯著的變化.脫色后,半乳糖醛酸含量由75.5%下降為49.9%～50.6%,可能是H2O2的強(qiáng)氧化作用破壞了果膠聚半乳糖醛酸基本結(jié)構(gòu)單元,導(dǎo)致半乳糖醛酸含量的降低.

表1 H2O2漂白處理對果膠化學(xué)組分的影響Table 1 Effect of H2O2 bleaching process on pectin chemical composition

原甜菜果膠的阿魏酸含量為0.38%,而脫色果膠中的阿魏酸幾乎為0.究其原因,一方面可能由于H2O2的氧化作用破壞了阿魏酸分子結(jié)構(gòu)中的共軛雙鍵;另一方面,脫色過程的堿處理水解阿魏酸與多糖間的糖苷鍵[17],從而導(dǎo)致阿魏酸含量減少.阿魏酸含有乙烯基、苯基,能吸收特定波長可見光,將阿魏酸從甜菜果膠分子上剝離后也可能導(dǎo)致果膠的色澤降低.

采用HPAEC-PAD分析甜菜果膠的單糖種類與含量.研究結(jié)果表明,H2O2脫色工藝對甜菜果膠中性糖含量具有顯著的影響(P<0.05).甜菜果膠中的鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖等的含量均有所下降,下降的幅度與單糖的種類、脫色時間有關(guān).脫色處理前期(0.0～0.5 h),鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖的含量迅速下降至原來的55%以下.隨著脫色時間的進(jìn)一步延長,這4種單糖的含量沒有顯著的下降(P>0.05)，而木糖總體下降幅度較小.對照樣中總中性糖含量較脫色果膠高,且游離的中性糖主要由阿拉伯糖和半乳糖組成.其原因是由于果膠側(cè)鏈其中一種結(jié)構(gòu) RG-I的骨架結(jié)構(gòu)是由交替的α-L-鼠李糖和α-D-半乳糖醛酸組成,RG-I側(cè)鏈則是通過鼠李糖C- 4連接一定量的α-L-阿拉伯糖聚糖和β-D-半乳糖聚糖等[18].總體上脫色會稍微降低果膠中性糖的含量,可能是由于在強(qiáng)氧化脫色條件下,部分單糖結(jié)構(gòu)被破壞,導(dǎo)致中性糖含量降低.

2.4 H2O2漂白處理對分子質(zhì)量分布的影響

為明晰脫色工藝對樣品大分子結(jié)構(gòu)的影響,采用HPSEC法分析了甜菜果膠的分子質(zhì)量分布曲線,如圖3(a)所示.結(jié)果表明,原樣的分子質(zhì)量分布曲線見峰1,相對出峰時間為30～37 min,從而表現(xiàn)出典型的寬分散性.經(jīng)脫色處理后,果膠的多分散程度增加,在原有基礎(chǔ)上新生成部分小分子物質(zhì)(如峰2),其出峰時間為37～39 min.小分子物質(zhì)的含量隨著脫色時間的增加而逐漸變高.可見H2O2漂白處理果膠時形成了分子質(zhì)量較小的果膠分子片段.這與Diaz等[19]研究發(fā)現(xiàn)在堿性條件下果膠易發(fā)生β-消除反應(yīng),使果膠發(fā)生降解的結(jié)論相符合.

圖3 H2O2漂白處理和透析對果膠分子質(zhì)量的影響

Fig.3 Effect of H2O2bleaching treatment and dialysis on the molecular weight of pectin

對比透析前后樣品的分子質(zhì)量分布曲線,結(jié)果如圖3(b)所示.原樣和透析樣品間的組分存在差異性.透析處理降低分子質(zhì)量分布曲線在36～38 min處的吸收強(qiáng)度,說明一些小分子質(zhì)量的物質(zhì)(<14 000 u)被除去.結(jié)合圖1結(jié)果可知,果膠色澤較暗的問題并非游離的小分子物質(zhì)呈色所致,而可能是果膠內(nèi)源性呈色物質(zhì)所致.

2.5 H2O2漂白處理對果膠乳化性能的影響

如表2所示,與對照樣相比(乳化活性83.3%),脫色果膠的乳化活性顯著降低(P<0.05)(66.7%～75.0%).隨著H2O2脫色時間的延長,果膠的乳化活性逐漸降低.研究證實(shí),糖鏈結(jié)合蛋白質(zhì)、阿魏酸基團(tuán)是賦予甜菜果膠乳化性的關(guān)鍵因子[20].在本研究中,堿性條件下的H2O2氧化作用可能破壞甜菜果膠中的蛋白質(zhì)和阿魏酸基團(tuán),最終降低果膠的乳化活性.

表2 H2O2漂白處理對乳化性的影響Table 2 Effect of H2O2 bleaching process on emulsification

甜菜果膠制備的乳液在室溫儲存7 d后,評價其乳化穩(wěn)定性.如表2所示,脫色果膠所在乳液的穩(wěn)定性顯著低于對照組(P<0.05).另外,脫色時間對乳化穩(wěn)定性并沒有顯著的影響.阿魏酸是決定甜菜果膠表面活性的重要結(jié)構(gòu)單元.JUNG等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，漆酶催化甜菜果膠阿魏酸發(fā)生交聯(lián)后,甜菜果膠的乳化性隨之增強(qiáng).然而,阿魏酸基團(tuán)在堿性條件下不穩(wěn)定[17],本研究采用的堿性H2O2脫色法反而導(dǎo)致阿魏酸基團(tuán)水解,這可能是脫色甜菜果膠乳化穩(wěn)定性降低的重要原因.

2.6 果膠乳液的微觀表征

為了觀察不同條件下甜菜果膠乳化液在形態(tài)特征上的變化,分別選取不同條件下的乳化液進(jìn)行顯微分析.從圖4可以看出,甜菜果膠乳化顆粒均呈較為規(guī)則的圓形.H2O2漂白處理后的果膠乳液的乳化顆粒數(shù)量減少,并且乳化顆粒體積增大,說明H2O2漂白處理后的果膠乳化活性降低,這與表2結(jié)果一致.JUNG等[21]還發(fā)現(xiàn)甜菜果膠大分子結(jié)構(gòu)對其乳化性起重要作用，隨著平均分子質(zhì)量和分子鏈螺旋直徑的降低,乳液粒徑及吸附果膠量明顯降低,在文中,H2O2在漂白甜菜果膠的同時也導(dǎo)致甜菜果膠的大分子組分水解成小分子片段,如圖3(a)所示,從而導(dǎo)致甜菜果膠的乳化性能下降.

圖4 不同條件下果膠乳化液的顯微圖片

Fig.4 Light microscopy images of pectin emulsion under diffe-rent conditions

3 結(jié)語

文中通過對甜菜果膠分別采用醇洗、透析和H2O2漂白3種方法進(jìn)行脫色,發(fā)現(xiàn)H2O2漂白處理效果明顯.當(dāng)H2O2體積分?jǐn)?shù)為3%、脫色時間為1 h時,脫色效果最好.文中還對H2O2漂白處理后果膠的結(jié)構(gòu)和乳化性能進(jìn)行了分析,發(fā)現(xiàn)H2O2漂白處理后果膠中的半乳糖醛酸含量明顯低于未處理果膠中的半乳糖醛酸含量,分別為50.1%和75.5%;中性糖含量稍微降低,分別為11.6%和23.3%,分子質(zhì)量和乳化活性也有所降低,這說明H2O2漂白工藝顯著修飾了果膠的分子結(jié)構(gòu).由此也說明隨著果膠分子質(zhì)量變小、支鏈減少,果膠分子不易被吸附在乳化顆粒表面,進(jìn)而導(dǎo)致乳化活性的降低.因此H2O2漂白雖然脫色效果顯著,但對果膠的組分和結(jié)構(gòu)完整性破壞較大,故尋找一種溫和而有效的脫色方法將是下一步研究的重點(diǎn).

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