張倩+鄭斐+秦偉捷 錢小紅

摘要 蛋白質組學通過規(guī)?；b定、分析從細胞、組織或有機體中提取的蛋白質，從而獲得蛋白表達、修飾、組成和定量的變化信息。在目前最為有效的“鳥槍法”蛋白質組學策略中，固定化酶試劑基質常用固相載體材料，該固定化酶試劑在酶解蛋白質時為異相體系，存在固液界面?zhèn)髻|阻力和空間位阻，限制了酶解效率和樣品處理通量。針對這一技術瓶頸，本研究利用溫敏聚合物對外界溫度變化的響應能力，制備了一種新型的基于可溶性溫敏聚合物的固定化胰蛋白酶試劑。該固定化酶特有的溫度敏感特性，使其具有“高溫均相酶解，低溫異相分離”的特色，且兼具酶切時間顯著縮短、酶可重復利用的優(yōu)勢。BSA1min固定化酶解產物肽段的氨基酸序列覆蓋率可達94%，高于傳統(tǒng)溶液酶解12h所得覆蓋率為（74%）。進一步將該固定化酶試劑應用于HeLa細胞全蛋白質組的酶解，其酶解效果與相同條件下溶液酶解12h相當。該固定化酶試劑對復雜蛋白質的快速、高效酶解充分證明其在蛋白質組學研究中的應用潛力。

關鍵詞固定化酶；溫度敏感型聚合物；質譜鑒定；蛋白質組學；快速酶解

1引言

蛋白質組學通過對從細胞、組織或有機體中提取的蛋白質進行規(guī)?；治鲨b定，系統(tǒng)性的獲得蛋白表達、修飾、組成和定量的變化信息[1，2＼]，已成為生物學和醫(yī)學研究中的熱點領域。目前，蛋白質組學中應用最為廣泛的研究策略是基于質譜的“鳥槍法”策略，該策略利用蛋白酶將蛋白樣品酶解為肽段混合物，然后通過液相色譜質譜聯(lián)用（LCMS）分析鑒定肽段樣品，最后將所得質譜數據在數據庫中搜庫檢索，從而獲得相應蛋白質的詳細信息[3，4＼]。在這一策略中，蛋白質的定性、定量信息都是通過對其酶解肽段產物進行分析鑒定得到的，因此，蛋白質的酶解成為該研究策略中至關重要的一步。在“鳥槍法”策略中，目前廣泛使用的溶液酶解方法所需時間過長（12～24h），嚴重限制了樣品的處理速度和通量。而且溶液酶解中的蛋白酶只能單次使用，無法回收，導致使用成本較高。固定化蛋白酶試劑可避免蛋白酶自身酶解效應，并且顯著提高了酶與底物的投料比，縮短了反應時間，提高了酶解效率；另外，固定化蛋白酶可回收重復使用，大大降低了蛋白酶的使用成本[5～7＼]。目前已報道了多種不同的蛋白酶固定化方法及固定化載體材料，如介孔材料[8，9＼]、毛細管石英柱[10，11＼]、芯片材料[12，13＼]、二氧化硅材料[14，15＼]或磁性納米顆粒[16，17＼]。但是，目前所使用的固定化載體多為固相材料，固定化蛋白酶與溶液中的蛋白質底物在異相體系中進行酶解反應，固液界面的傳質阻力和固相材料的空間位阻限制了固定化酶與底物的碰撞和酶解效率的進一步提高。

針對上述技術瓶頸，本研究提出并發(fā)展了基于溫敏聚合物載體的固定化蛋白酶，利用溫敏聚合物的溫度敏感特性，通過控制溫敏聚合物固定化蛋白酶所處環(huán)境溫度使其在溶解和不溶解間相互轉換，從而在溶液中呈現不同狀態(tài)，以達到“均相酶解，異相分離”的目的。溫度敏感型聚合物水溶液通常具有相轉變溫度，其中一類為最高臨界溶解溫度（UCST）型，當環(huán)境溫度高于其相轉變溫度時，聚合物在水溶液中呈完全溶解狀態(tài)；當環(huán)境溫度達到或低于該聚合物的相轉變溫度時，聚合物開始聚集，析出沉淀[18，19＼]。本研究以N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）為溫度響應基團，合成了具有UCST溫度響應能力的N丙烯酰甘氨酰胺共聚十一烯醛（poly（NAGAcoUnAl））溫敏聚合物，將該溫敏聚合物作為載體材料，制備得到新型可溶性溫敏固定化胰蛋白酶。通過控制反應體系溫度使固定化酶對蛋白質樣本實現了“高溫均相酶解，低溫異相分離”，消除了固定化蛋白酶酶解時的固液界面?zhèn)髻|阻力和空間位阻，大大縮短了酶解時間，提高了酶解效率。常用的固定化酶方法大多用固相載體制備，酶解均在異相體系反應；相較于此，本研究制備的固定化酶試劑，在37℃超聲溶解，與蛋白進行均相反應，置于冰水浴中，固定化酶試劑團聚沉淀，與酶解肽段分離，達到異相分離，酶解效率提高，酶解效果比固相載體高。此固定化蛋白酶試劑在標準蛋白和復雜樣本中均取得良好效果，證明其在蛋白質組學研究中的應用潛力。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

基質輔助激光解析飛行時間質譜（NewultrafleXtremeMALDITOF/TOFMS），EQUINOX55型傅里葉紅外光譜儀（FTIR）均購自德國Bruker公司；四極桿靜電場軌道阱組合高分辨串聯(lián)質譜儀（QExactivePlusOrbitrapMS），液相色譜（EasynLC1000），均購自美國ThermoFisherScientific公司。

牛血清白蛋白（BSA，98%）、胰蛋白酶（90%）、甘氨酰胺鹽酸鹽（98%）、丙烯酰氯（98%）、10十一烯醛（UnAl，95%）、氰基硼氫化鈉（99%）、偶氮二異丁腈（AIBN，99%），均購自美國SigmaAldrich公司；實驗用水為MilliQ去離子水。

2.2實驗方法

2.2.1N丙烯酰甘氨酰胺（NAGA）的合成溫敏單體NAGA的具體步驟參考文獻＼[18＼]。

2.2.2UCST溫敏型共聚物poly（NAGAcoUnAl）的合成

控制合成共聚物的單體的起始摩爾比為NAGAKG-3∶KG-5UnAl=4KG-3∶KG-51，利用自由基聚合反應，合成UCST溫敏型共聚物poly（NAGAcoUnAl）。步驟同文獻＼[18＼]。

2.2.3胰蛋白酶在poly（NAGAcoUnAl）上的固定將10mgpoly（NAGAcoUnAl）共聚物溶解于500μL磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）中，再依次加入4mg胰蛋白酶與5mg氰基硼氫化鈉，將混合體系在24℃下振蕩反應3h。將體系置于冰水浴中靜置2min，待體系出現明顯渾濁后，在4℃以10000r/min離心10min，收集上清液，將不溶物溶解于1mL50mmol/LNH4HCO3溶液中，再次置于冰水浴中降溫并高速離心進行分離，此過程重復3次，以洗去未固定的胰蛋白酶，得最終產物poly（NAGAcoUnAl）trypsin固定化酶。收集清洗過程中所有上清液，用于測定載體材料對胰蛋白酶的固載量。

2.2.4Poly（NAGAcoUnAl）trypsin固定化酶酶解標準蛋白將40μg牛血清白蛋白（BSA）溶解于50mmol/LNH4HCO3溶液中至1μg/μL，加入二硫蘇糖醇（DTT）至終濃度為10mmol/L，95℃下加熱10min，待冷卻后加入碘乙酰胺（IAA）至終濃度為50mmol/L，暗處放置1h。

將變性后的BSA溶液加入到poly（NAGAcoUnAl）trypsin中充分混合，置于37℃水浴中超聲酶解1min。然后迅速將混合物置于冰水浴中靜置2min后，在4℃以10000r/min離心10min，收集上清液，不溶物再用50μL水清洗，將上清液與第一次的溶液混合，脫鹽后用于質譜鑒定。不溶物用50mmol/LNH4HCO3溶液反復清洗后，于4℃保存。

2.2.5對標準蛋白BSA酶解產物和人宮頸癌細胞（HeLa）全蛋白的酶解的質譜鑒定使用MALDITOF/TOFMS對BSA酶解產物進行鑒定，并使用Moscot在線搜庫對所得數據進行肽指紋譜圖分析。

對HeLa細胞全蛋白的固定化酶解操作與上述對BSA的步驟相同。所得酶解產物使用LCQExactivePlusMS鑒定后由軟件ProteinDiscoverer1.3搜庫分析。

3結果與討論

本研究中的溫敏聚合物poly（NAGAcoUnAl）是通過N丙烯酰甘氨酰胺和十一烯醛的自由基聚合反應得到的。其中，N丙烯酰甘氨酰胺提供具有溫度敏感特性的官能團，十一烯醛提供醛基官能團，通過醛基與胰蛋白酶N端或氨基酸側鏈的氨基反應將胰蛋白酶固定到溫敏聚合物上。UCST溫敏共聚物固定化胰蛋白酶的制備流程如圖1所示。

本研究制備的UCST溫敏聚合物固定化胰蛋白酶對蛋白質的酶解過程如圖2所示。利用此溫敏聚合物的溫度響應特性，即在體系溫度高于UCST時處于溶解狀態(tài)，其與蛋白質樣本形成均相體系，消除了固液界面的傳質阻力，并降低了空間位阻，有效提高了固定化酶的酶解效率；在體系溫度低于其UCST時，團聚析出形成沉淀，便于與酶解產物的有效分離和酶的簡便回收，從而實現了“高溫均相酶解低溫異相分離”的固定化酶解新策略。

兩個紅外譜圖中均存在的1550和1650cm 1兩處強烈的吸收峰屬于NAGA側基上的JG（NZJYHJG）伸縮振動和JG（CZJLX，YOJG）伸縮振動；2930cm 1處的吸收峰屬于聚合物骨架上的JG（CH2ZJZ；YJG）伸縮振動；（b）中出現的2850cm 1處的吸收峰屬于醛基的JG（CZJYHJG）鍵特征吸收峰，表明在與UnAl共聚合之后，醛基被成功引入。上述結果證明所得聚合物由NAGA和UnAl兩種單體共聚所得，溫敏聚合物同時具備溫敏響應基團和可用于胰蛋白酶固定的醛基官能團。

3.1.2UCST溫敏共聚物的溫敏性能考察poly（NAGAcoUnAl）在水溶液中的溫敏性能如圖4所示，poly（NAGAcoUnAl）溫敏聚合物表現出了良好的UCST型溫度響應能力。

在溫度處于共聚物的UCST以上時，共聚物可完全溶解于水中，形成澄清透明的溶液（圖4a）；而當溫度冷卻至其UCST以下時，共聚物分子發(fā)生締合，從溶液中析出，

體系出現明顯的渾濁（圖4b）；經高速離心后與溶液分離（圖4c），從而達到“高溫均相溶解，低溫異相分離”的目的。JPPS01764.eps，Y，PZ#TS（（1HT5”SS

圖4溫敏聚合物poly（NAGAcoUnAl）在水中不同溫度下呈現的不同狀態(tài)（a）為加熱后形成的澄清透明溶液，（b）為溶液冰水浴后形成的乳狀懸濁液，（c）為乳狀懸濁液經高速離心后形成的團聚沉淀

3.1.3poly（NAGAcoUnAl）的胰蛋白酶固載能力測試為考察poly（NAGAcoUnAl）對胰蛋白酶的固載能力，采用超微量分光光度計測定胰蛋白酶

溶液在固定前、后溶液中A280處吸光值的變化，計算出胰蛋白酶固定前、后的濃度差，再進一步計算得出一定質量溫敏聚合物的胰蛋白酶固載量，測定poly（NAGAcoUnAl）對蛋白酶的固載能力為247.7μg/mg。

繼續(xù)考察溫敏聚合物固定化胰蛋白酶的酶活性，使用固定化酶酶解N苯甲酰L精氨酸乙酯（BAEE），通過測量不同時間酶解BAEE溶液的吸光度，得到溫敏聚合物固定化酶的酶活力為228.3U/mg，即單位質量的溫敏聚合物上負載的酶能夠酶解228.3UBAEE。

計算公式：其中，P為每1mg供試品中含胰蛋白酶的量；A1為直線上終止的吸光度；A2為直線上開始的吸光度；T為A1～A2的讀數時間（min）；W為測定液中含供試品的量（mg）；0.001為在上述條件下，1mL底物的吸收度1min改變0.001，即相當于1個BAEE單位（U）；V為底物體積（mL）。胰蛋白酶的單位定義為：以BAEE為底物，在一定反應條件下，每分鐘使ΔA253nm增加0.001的酶量為1UBAEE。

3.2UCST溫敏共聚物固定化胰蛋白酶的應用

3.2.1固定化胰蛋白酶的酶解效率本實驗分別使用UCST溫敏聚合物固定化胰蛋白酶及溶液酶對牛血清白蛋白（BSA）進行平行酶解實驗，來考察固定化酶的酶解效率。固定化酶酶解的操作過程如圖2所示。酶解產物使用MALDITOF/TOFMS進行鑒定，一級質譜圖如圖5所示。1min固定化酶解BSA，鑒定到84條肽段，氨基酸序列覆蓋率可達94%。而溶液酶解，雖然經過長達12h孵育，卻只能鑒定到68條肽段，達到74%的氨基酸序列覆蓋率，明顯低于固定化酶解的結果（表1）。相比于溶液酶解所需的孵育時間12h，

固定化酶酶解僅需1min即可完成酶解，具有極大的效率和通量優(yōu)勢。這是由于UCST溫敏共聚物固定化酶在37℃條件下可完全溶解于溶液中，

形成均相體系，消除了固液界面的傳質阻力并降低了空間位阻，有效促進了酶與底物蛋白的碰撞。同時，固定化酶具有超高的酶固載量，使得體系內的酶底物蛋白比例遠遠高于溶液酶解中酶與蛋白比，在等量蛋白底物存在的情況下，固定化酶的量遠遠高于溶液酶的量，在固定化酶解過程中，酶與底物蛋白的碰撞幾率成倍提高，從而大大加快了酶解反應的進行。

3.2.2固定化胰蛋白酶酶解的穩(wěn)定性和重現性稱量10mg溫敏聚合物poly（NAGAcoUnAl），將其固定上胰蛋白酶。將此固定化酶在一個月內重復15次酶解40μgBSA。每次所得BSA酶解產物經MALDITOF質譜鑒定，15次酶解所得氨基酸序列覆蓋率在82%～94%之間（均高于溶液酶解74%的序列覆蓋率），波動范圍小于10%，平均覆蓋率達89%，相對標準偏差（RSD）為3.9%，如圖6所示。結果表明，此固定化酶能夠多次重復使用，且表現出良好的穩(wěn)定性和重現性。

3.2.3HeLa細胞全蛋白酶解產物質譜鑒定本實驗對HeLa細胞全蛋白的固定化酶解操作與上述對BSA的步驟相同，固定化酶解產物以及溶液酶解產物均經LCQExactivePlusMS質譜鑒定一次，搜庫后結果如表2所示。經1min固定化酶解后鑒定到15012條肽段，歸屬于2659個蛋白。其中368條肽段含兩個漏切位點，含1個漏切位點的肽段有3191條。經12h溶液酶解后鑒定到16215條肽段，歸屬CM（20于2754個蛋白。其中566條肽段含兩個漏切CM）

位點，含1個漏切位點的肽段有3624條。綜上ZH（可知，固定化酶具備快速、高效酶解的能力，而且酶解產物鑒定蛋白和肽段數量與溶液酶解相當，但酶解時間縮短720倍，同時帶有漏切位點的肽段數量也有所降低。

通過合成poly（NAGAcoUnAl）溫敏聚合物，成功制備出UCST溫敏聚合物固定化胰蛋白酶。該溫敏聚合物特有的溫度響應特性，使制備的溫敏聚合物固定化胰蛋白酶具有“高溫均相酶解，低溫異相分離”的特色和優(yōu)勢，可以很好地滿足當前蛋白質組學研究中，快速、高效、高通量的鑒定需求；同時，作為一種新型通用型載體材料，其在固定化酶領域具有廣闊的應用前景。ZH）

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AbstractBymassivelyanalyzingproteinsextractedfromcells，tissuesandorganismsusingmassspectrometry，proteomicsiscapableofprovidinginformationaboutchangeinproteinsexpression，modification，compositionandquantification.However，mostimmobilizedenzymesusedinmassspectrometrybased"shotgun"proteomicstrategyarepreparedusingsolidmaterialsastheimmobilizationmatrixanddigestthesubstrateproteinsinheterogeneoussystem.Theinherentmasstransferresistanceinthesolidliquidinterfaceandsterichindranceofthesolidmatrixlimitsthedigestionefficiencyandsampleprocessingthroughput.Here，wepreparedanovelimmobilizedenzymeusingsolublethermosensitivepolymerasthematrixmaterialbyexploitingthethermoresponsiveabilityofthepolymertoenvironmentaltemperaturechanges.Thethermosensitiveimmobilizedtrypsinhadthefeatureof“homogeneousdigestionathightemperatureandheterogeneousseparationatlowtemperature”andtheadvantageofsignificantlyshorteneddigestiontimeandrecoverandreuseoftheenzyme.Anaminoacidsequencecoveringupto94%in1mindigestionwasobtained，whichwashigherthanthatof74%obtainedbyinsolutiondigestionfor12h.Finally，theimmobilizedtrypsinwassuccessfullyappliedtofastandhighlyefficientdigestionofcomplexproteomeextractedfromHeLacell.Theefficiencyofimmobilizeddigestionin1minwassimilartothatofsolutiondigestionin12h，whichsufficientlydemonstratedtheapplicationpotentialofthisthermosensitiveimmobilizedtrypsininproteomicsresearch.

KeywordsImmobilizedenzyme；Thermosensitivepolymer；Massspectrometry；Proteomics；Fastdigestion

HQWT6JY（Received10March2016；accepted11July2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalKeyProgramforBasicResearchofChina（Nos.2013CB911204，2016YFA0501403），theNationalKeyScientificInstrumentDevelopmentProgramofChina（No.2011YQ09000504），theNationalHighTechResearchandDevelopmentProgramofChina（No.2014AA020906），andtheNationalNaturalScienceFoundationofChina（Nos.21275005，21235001，21405175and21675172）.