梁鉅超 +屈穎 +于苗苗 +徐玲玲 +劉亞潔+孫占學(xué) 陳煥文

摘要 本研究以721礦和745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌為研究對(duì)象，采用常壓化學(xué)電離質(zhì)譜直接分析其代謝產(chǎn)物，分別考察了頂空采樣（Headspacesampling）、界面采樣（Interfacesampling）和中性解吸采樣（Neutraldesorptionsampling）3種進(jìn)樣方式對(duì)電離效果的影響。在優(yōu)化條件下，常壓化學(xué)電離質(zhì)譜對(duì)微生物純菌種和混合菌種的代謝產(chǎn)物均具有良好的分析能力，可根據(jù)獲得的代謝產(chǎn)物指紋譜圖結(jié)合主成分分析（PCA）方法和聚類分析（CA）方法區(qū)分2個(gè)放射性強(qiáng)弱不同區(qū)域共4類嗜酸性微生物樣品，并對(duì)主要胺類、酯類等代謝成分進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定，為耐輻射微生物的相關(guān)研究提供了一種可借鑒的分析方法。

關(guān)鍵詞嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌；常壓化學(xué)電離；代謝產(chǎn)物；質(zhì)譜分析

1引言

嗜酸性微生物是指可在極端酸性環(huán)境（pH<3.5）中生長(zhǎng)良好的微生物，多分布在酸性礦水、酸性熱泉、火山湖、地?zé)崛葮O端酸性環(huán)境中，含硫化物礦物環(huán)境中亦有較多分布[1～3＼]。大部分已知的嗜酸性微生物分離自上述酸性環(huán)境，并被用于生物濕法冶金，如氧化亞鐵硫桿菌（Acidithiobacillusferrooxidans，At.f）、氧化硫硫桿菌（Acidithiobacillusthioxidans，At.t）等，既是典型的嗜酸菌，也是典型的化能自養(yǎng)型微生物。這類微生物能氧化某種特定的無機(jī)物，并利用所產(chǎn)生的化學(xué)能還原二氧化碳和生成有機(jī)碳化合物[4～6＼]，At.f能將Fe2+氧化為Fe3+，獲得能量而生長(zhǎng)，而Fe3+又是冶金工藝中良好的氧化劑，At.t可以低價(jià)硫或單質(zhì)硫?yàn)槟茉床⑸闪蛩幔\(yùn)用于冶金工藝中可以降低酸耗，大大節(jié)約生產(chǎn)成本[7～9＼]。同時(shí)，由于貧礦、尾礦、品外礦的增加，微生物浸礦工藝已成為許多地區(qū)首選的浸礦技術(shù)。因此，通過微生物代謝產(chǎn)物研究生物冶金中目標(biāo)礦體環(huán)境中嗜酸性微生物特異性，對(duì)目標(biāo)菌種的篩選及構(gòu)建生物浸出體系中優(yōu)勢(shì)冶金菌群具有很重要的指導(dǎo)作用[10＼]。

基于代謝產(chǎn)物對(duì)微生物種類進(jìn)行識(shí)別鑒定具有快速無損的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)微生物代謝產(chǎn)物快速檢測(cè)的方法，已成為了熱門的研究課題。目前，微生物代謝產(chǎn)物的分析方法很多，傳統(tǒng)方法的包括化學(xué)傳感、光譜學(xué)、“電子鼻”、離子遷移譜等[11＼]。由于質(zhì)譜技術(shù)具有較高的化學(xué)特異性，得到越來越廣泛的應(yīng)用，但傳統(tǒng)的質(zhì)譜方法常與氣相色譜或液相色譜聯(lián)用，樣品預(yù)處理較復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)。直接質(zhì)譜分析技術(shù)能夠在無需樣品預(yù)處理的情況下對(duì)復(fù)雜基體樣品中痕量待測(cè)物進(jìn)行快速分析，因此得到了極大的關(guān)注和廣泛的應(yīng)用[12＼]。Liang等[13＼]利用常壓化學(xué)電離，無需任何預(yù)處理，對(duì)臨床上5種常見的致病菌進(jìn)行指紋譜圖分析，并得到其揮發(fā)性代謝產(chǎn)物生物標(biāo)志物作為快速識(shí)別的信號(hào)。Yang等[14＼]利用表面解吸常壓化學(xué)電離（SDAPCI）質(zhì)譜法，在無需樣品預(yù)處理的情況下，直接測(cè)定了奶粉中三聚氰胺，實(shí)現(xiàn)了奶粉中三聚氰胺的半定量和批量檢測(cè)。常壓化學(xué)電離質(zhì)譜法作為一種常用的直接質(zhì)譜分析技術(shù)，通過高電壓的針尖電暈放電，使空氣中某些中性分子電離，產(chǎn)生H3O+，N2+，O2+和O+等離子，這些離子與待測(cè)物分子發(fā)生離子分子反應(yīng)，使待測(cè)物分子離子化，反應(yīng)過程包括由質(zhì)子轉(zhuǎn)移和電荷交換產(chǎn)生正離子，質(zhì)子脫離和電子捕獲產(chǎn)生負(fù)離子等[15＼]。該方法對(duì)易揮發(fā)半極性的小分子化合物具有較高的靈敏度，特別適宜在環(huán)境監(jiān)測(cè)和生物表征中發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)以721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌及745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌為研究對(duì)象，比較了頂空、界面、中性解吸3種進(jìn)樣方式的特點(diǎn)，分析了嗜酸性微生物代謝成分，并結(jié)合主成分分析（PCA）和聚類分析（CA）對(duì)不同礦區(qū)的嗜酸性微生物進(jìn)行快速區(qū)分。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

常壓化學(xué)電離源為本實(shí)驗(yàn)室搭建[13＼]；LTQXL線性離子阱質(zhì)譜儀并配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)ThermoScientific公司）。

微生物樣品：721礦嗜酸性混合菌種分離自721礦生物堆浸浸出液；721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種由721礦嗜酸性混合菌種進(jìn)一步純化得到；745礦嗜酸性混合菌種富集分離自745礦生物堆浸礦渣；745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種由745礦嗜酸性混合菌種進(jìn)一步純化得到。

9k培養(yǎng)基：（NH4）2SO43.0g/L；KCl0.1g/L；K2HPO40.5g/L；MgSO4·7H2O0.5g/L；Ca（NO3）20.01g/L；FeSO4·7H2O25g/L；二次蒸餾水1000mL。菌種選育和樣品培育在東華理工大學(xué)鈾礦生物溶浸工藝實(shí)驗(yàn)室提供的幫助下完成。

2.2微生物培育

所有微生物樣品活化之后以20%接種至9k培養(yǎng)基，在35℃條件下120r/min搖床培養(yǎng)24h后取樣進(jìn)行質(zhì)譜分析。

2.3常壓化學(xué)電離實(shí)驗(yàn)參數(shù)

常壓化學(xué)電離質(zhì)譜裝置圖如圖1所示。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境為恒溫恒濕條件，溫度25℃，濕度45%。為使樣品分子最大限度地與初級(jí)帶電離子進(jìn)行碰撞并發(fā)生反應(yīng)，參考實(shí)驗(yàn)室氣體檢測(cè)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件為：放電針與進(jìn)樣口角度α=30°，樣品通道口與質(zhì)譜口水平距離為l=6mm。設(shè)置檢測(cè)模式為正離子模式，質(zhì)量范圍為100～400Da，放電針電壓為4kV，離子傳輸管溫度為150℃，樣品載氣（氮?dú)猓兌葹?9.99%），壓力為0.1MPa，其他條件為系統(tǒng)自動(dòng)優(yōu)化。

3結(jié)果與討論

3.1常壓化學(xué)電離3種采樣方式對(duì)電離效率影響

為了考察采樣方法對(duì)細(xì)菌代謝產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果的影響，分別采用了頂空采樣、界面采樣和中性解吸采樣等3種方式進(jìn)行代謝產(chǎn)物的檢測(cè)（圖1），3種方法均利用N2將培養(yǎng)體系中的物質(zhì)萃取出來進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)，區(qū)別之處在于培養(yǎng)瓶中N2進(jìn)氣口與液面間的距離不同。比較3種不同的進(jìn)樣方式的檢測(cè)結(jié)果，

以745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌為例得出其指紋圖譜如圖2所示，檢測(cè)出主要成分質(zhì)荷比m/z119，139，223，295等區(qū)別不大，尤其是頂空采樣與界面采樣，但是中性解吸采樣譜圖c與前兩種采樣方式譜圖相比，所得譜圖信號(hào)略有增加，可能是由于隨著N2進(jìn)樣口與液面間距離不斷縮短，氣體從培養(yǎng)基中萃取的物質(zhì)也越多，采取中性解吸采樣檢測(cè)到的可能不僅僅是揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，培養(yǎng)基和培養(yǎng)基中一些非揮發(fā)性的代謝產(chǎn)物也有可能被檢測(cè)到，所以得到了較多復(fù)雜的質(zhì)譜信號(hào)。

3.2嗜酸性微生物代謝產(chǎn)物指紋譜圖分析

分別對(duì)721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種、721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌混合菌種、745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種和745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌混合菌種代謝產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜分析，得到指紋譜圖如圖3所示。比較4種樣品指紋譜圖可知，4種微生物都存在明顯的m/z119，139，223，295等離子峰，說明4種微生物樣品都會(huì)產(chǎn)生一些相同的代謝產(chǎn)物，且相對(duì)強(qiáng)度較為一致。

對(duì)比721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種和混合菌種，混合菌種中在質(zhì)荷比m/z158，195，223，295等處質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度較721礦嗜酸性混合菌種均有不同程度的升高，且在m/z100～300之間出現(xiàn)了一些強(qiáng)度較小的離子峰，如m/z244等，而721純菌種則相對(duì)干凈。同樣的現(xiàn)象在745礦純菌種和混合菌種也存在?？赡艿脑蚴怯捎诨旌暇N中含有微生物種類較多從而產(chǎn)生的化學(xué)成分比較復(fù)雜，導(dǎo)致在此質(zhì)荷比區(qū)間差異明顯。而相比于745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種，721礦純菌種的m/z119，173信號(hào)強(qiáng)度更大，另外，721礦純菌種還出現(xiàn)m/z158，295，391質(zhì)譜信號(hào)峰，未見m/z301的質(zhì)譜信號(hào)峰。為了快速識(shí)別鑒定嗜酸性微生物的種類，選擇721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種中豐度較高的一些物質(zhì)如m/z119等離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。

圖4為通過碰撞誘導(dǎo)解離實(shí)驗(yàn)（CID）得到的串聯(lián)質(zhì)譜圖。m/z119離子的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4a所示，產(chǎn)生主要碎片離子m/z91，為母體離子丟失中性碎片C2H4形成的，可能與酯類物質(zhì)丟失碎片規(guī)律一致，推測(cè)m/z119為一酯類物質(zhì)，通過文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)品串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)一步確認(rèn)了m/z119為質(zhì)子化的乳酸乙酯＼[CH3CH（OH）COOCH2CH3+H＼]+。m/z151的二級(jí)質(zhì)譜圖如圖4b所示，產(chǎn)生主要碎片離子m/z133，掉落碎片18，同時(shí)產(chǎn)生m/z105離子碎片，由此推測(cè)其為質(zhì)子化苯甲酸乙酯，與參考文獻(xiàn)對(duì)比進(jìn)一步確認(rèn)該化合物[16＼]。m/z135的二級(jí)質(zhì)譜圖和三級(jí)質(zhì)譜圖如圖4c所示，產(chǎn)生主要碎片離子為m/z107，因此推測(cè)m/z135為酰胺物質(zhì)，然后通過標(biāo)準(zhǔn)品的三級(jí)質(zhì)譜圖和文獻(xiàn)對(duì)比進(jìn)一步確認(rèn)了m/z135為離子化的乙酰苯胺＼[CH3CONHC6H5＼]+。m/z136的二級(jí)譜圖和三級(jí)譜圖如圖4d所示，與m/z135的串聯(lián)譜圖類似，由乙酰苯胺質(zhì)子化之后得到＼[CH3CONHC6H5+H＼]+。

3.3常壓化學(xué)電離質(zhì)譜主成分分析（PCA）

主成分分析（PCA）在復(fù)雜樣品的分析檢測(cè)中已得到廣泛地應(yīng)用[17～20＼]。為了更直觀地揭示嗜酸性微生物之間的差異和進(jìn)一步論證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，本研究通過Matlab軟件將采集的大量質(zhì)荷比在m/z100～400范圍內(nèi)的一級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行規(guī)一化處理，利用“Princomp”函數(shù)對(duì)每一類樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，自動(dòng)得到各個(gè)主成分的得分圖及相應(yīng)的載荷圖。

對(duì)721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種和混合菌種指紋譜圖進(jìn)行PCA分析（圖5a），結(jié)果表明，兩類生物樣品可以得到很好的區(qū)分。由3個(gè)主成分載荷分布圖（圖5b）可見，m/z135，136，158，223，295，296等對(duì)區(qū)分兩種樣品的貢獻(xiàn)較大，說明這些物質(zhì)在兩種樣品中的含量存在有較大差異。同樣，對(duì)745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種和混合菌種指紋譜圖進(jìn)行PCA分析，得到主成分分析圖和載荷圖如圖5c和5d所示。從圖5c可見，PC1，PC2和PC3對(duì)方差貢獻(xiàn)率分別為51.5%，29.8%和7.1%，三者之和達(dá)到88.4%，因而這3個(gè)主成分包含了被分析樣品的絕大部分信息，同時(shí)兩種樣品能夠被明顯區(qū)分開。

3.4常壓化學(xué)電離質(zhì)譜聚類分析（CA）

聚類分析是一種靜態(tài)數(shù)據(jù)分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，目前已廣泛應(yīng)用于模式識(shí)別和圖像分析等領(lǐng)域。實(shí)驗(yàn)將正離子模式檢測(cè)下的嗜酸性微生物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)（已進(jìn)行PCA分析）導(dǎo)入Matlab軟件的聚類分析程序中進(jìn)行分析，結(jié)果如圖6所示。嗜酸性微生物樣本為120個(gè)，其中721礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種、721礦嗜酸性混合菌種、745礦嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌純菌種、745礦嗜酸性混合菌種各30個(gè)。

分析結(jié)果表明，721礦純菌種與745礦純菌種樣本具有一定的相似度，說明在不同礦區(qū)中同一純菌種代謝非常接近，而721礦混合菌種代謝產(chǎn)物中包含了部分純菌種代謝產(chǎn)物，表明混合菌種中包含有嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌。721礦混合菌種與745礦混合菌種差異較大，說明不同礦區(qū)的混合菌種代謝具有較大的差異。從圖6可見，A，B，C，D分別自聚成一類，反應(yīng)不同嗜酸性微生物樣品被區(qū)分開，這與PCA的分析結(jié)果相印證。

4結(jié)論

本研究采用常壓化學(xué)電離技術(shù)，在無需樣品預(yù)處理的情況下，直接快速分析不同礦區(qū)嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌代謝產(chǎn)物，從而高通量地實(shí)現(xiàn)對(duì)微生物的快速識(shí)別鑒定。尤其是對(duì)于化能自養(yǎng)型微生物的快速識(shí)別能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌種的篩選及構(gòu)建生物浸礦體系具有重要的指導(dǎo)作用，有望在生物冶金中得到很好地應(yīng)用。同時(shí)，本方法具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、分析速度快等特點(diǎn)，為微生物的快速識(shí)別和鑒定提供了一種可靠的途徑。

References

1（#XUWeiYun，LIUYaJie，XULingLing，SUNLiMin.J.ECUT.Nat.Sci.，2009，32（2）：147-151

徐蔚云，劉亞潔，徐玲玲，孫麗敏.HTK東華理工大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2009，32（2）：147-151

2SHENJunJian.StudyonScreeningandCulturingofBiometallurgicalMicroorganismsandTheirLeachingProcessinLowgradeTelluriumOre.ChengduUniv.Technol.，2013

沈俊劍.HTK低品位碲礦浸礦微生物選育及其浸出工藝研究.成都理工大學(xué)，2013

3ZHOUHongBo，MAOFeng，WANGYuGuang.Bull.Mineral.，Petrol.Geochem.，2015，34（2）：269-276

周洪波，毛峰，王玉光.HTK礦物巖石地球化學(xué)通報(bào)，2015，34（2）：269-276

4KellyD，WoodA.Int.J.Syst.Evol.Micr.，2000，50（2）：511-516

5ColmerA，HinkleM.Science，1947，106（2751）：253-256

6TempleK，ColmerA.J.Bacteriol.，1951，62（5）：605-611

7QIUGuanZhou.Biohydrometallurgy.CentralSouthUniversityPress，2011

邱冠周.HTK生物濕法冶金.中南大學(xué)出版社，2011

8AcevedoF.Electron.J.Biotechn.，2002，5（2）：196-199

9BoseckerK.FemsMicrobiol.Rev.，1997，20（3）：591-604

10YANGXianWan，SHENQingFeng，GUOYuXia.MicrobialHydrometallurgy，MetallurgicalIndustryPress，2003

楊顯萬，沈慶峰，郭玉霞.HTK微生物濕法冶金.冶金工業(yè)出版社，2003

11LIANGHuaZheng，ZHANGXie，RAOJun，CHENHuanWen.J.Chin.Biotechnol.，2008，28（1）：124-133

梁華正，張燮，饒軍，陳煥文.HTK中國(guó)生物工程雜志，2008，28（1）：124-133

12ChinginK，LiangJ，ChenH.Rsc.Adv.，2014，4（11）：5768-5781

13LiangJ，HangY，ChinginK，HuL，ChenH.Rsc.Adv.，2014，4（48）：25326-253269

14YANGShuiPing，HUBin，LIJianQian，HANJing，ZHANGXie，CHENHuanWen，LIUQing，LIUQingJun，ZHENGJian.ChineseJ.Anal.Chem.，2009，37（5）：691-694

楊水平，胡斌，李建強(qiáng)，韓京，張燮，陳煥文，劉清，劉清珺，鄭健.HTK分析化學(xué)，2009，37（5）：691-694

15CHENHuanWen，LAIJinHu，ZHOUYuFeng，HUANYanFu，LIJianQian，ZHANGXie，WANGZhiChang，LUOMingBiao.ChineseJ.Anal.Chem.，2007，35（8）：1233-1240

陳煥文，賴勁虎，周瑜芬，郇延富，李建強(qiáng)，張燮，王志暢，羅明標(biāo).HTK分析化學(xué)，2007，35（8）：1233-1240

16JIANGGuoFang，LEZhangGao，XIEZongBo.ChineseJ.Spectr.Lab.，2004，21（4）：782-784

姜國(guó)芳，樂長(zhǎng)高，謝宗波.HTK光譜實(shí)驗(yàn)室，2004，21（4）：782-784

17WEIYiPing，YANFeiYan，JIABin，DINGJianHua，PENGJinHua，CHENHuanWen，XUNJianJun.ChineseJ.Exp.Surg.，2011，28（3）：422-424

魏益平，鄢飛燕，賈濱，丁健樺，彭金華，陳煥文，徐建軍.HTK中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28（3）：422-424

LM18WANGJiang，LIQian，GUHaiWei，GUOXiaoTun，YANGShuiPing，WANGZhiHao.Chem.J.ChineseUniversities，2015，1（6）：1067-1073

王姜，李倩，顧海巍，郭曉暾，楊水平，王志豪.HTK高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào)，2015，1（6）：1067-1073

19LUOLiPing，WANGJiang，ZHANGWenJun，DAIXiMo，F(xiàn)ANGXiaoWei，ZHANGQian，LIUYaLi，CHENHuanWen.ChineseJ.Anal.Chem.，2013，41（7）：1050-1056

羅麗萍，王姜，章文軍，戴喜末，方小偉，張茜，劉亞麗，陳煥文.HTK分析化學(xué)，2013，41（7）：1050-1056

20ZHUZhiQiang，YANJianPing，WANGYu，CHENShunZong，CHENHuanWen.ChineseJ.Anal.Chem.，2013，41（6）：905-910

朱志強(qiáng)，閆建平，汪雨，陳瞬宗，陳煥文.HTK分析化學(xué)，2013，41（6）：905-910）

AbstractAmethodforrapiddeterminationofacidithiobacillusferrooxidans（At.f）metabolitesbyambientcoronadischargeionizationmassspectrometrywasestablished.Threeinjectionmodeswereappliedtostudytheeffectssuchasheadspacesampling，interfacesamplingandneutraldesorptionsampling.Undertheoptimizedexperimentalconditions，themetabolites，suchassmallmoleculeestersandaminesweredetectedbyambientcoronadischargeionizationmassspectrometryandconfirmedusingtandemmassspectrometry（MS/MS）.Furtherprincipalcomponentanalysis（PCA）andclusteranalysis（CA）ofthemassspectrometricresultsallowedaconfidentdiscriminationofdifferentbacterialsamples.Ambientcoronadischargeionizationmassspectrometryhastheadvantagesofnosamplepretreatment，convenientoperation，highsensitivityandhighanalyticalspeed，whichwillbeanattractivemethodtorapidlyidentificationofmicroorganisms.

KeywordsAcidithiobacillusferrooxidans；Ambientcoronadischargeionization；Metabolites；Massspectrometry

HQWT6JY（Received12July2016；accepted2September2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81460327），ProgramforChangjiangScholarsandInnovationResearchTeaminUniversities（PCSIRT）（No.IRT13054），ScienceandtechnologysupportprogramofJiangxiProvince（Nos.20152ACB21013，20152ACG70014）.