孫佳明 田淋淋 何忠梅 孟令文 孫慧 闞俊明 張輝

摘要 應(yīng)用電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（ESIMS/MS）對云南和秘魯產(chǎn)瑪咖樣品中低極性化學成分進行檢測，獲得各樣品的一級質(zhì)譜指紋譜圖和各離子峰的二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，并測定各樣品促進大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖活性，采用化學計量學方法主成分分析（PCA）、偏最小二乘法（PLS）和灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）對所獲得的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理后，可有效區(qū)分瑪咖的不同產(chǎn)地，且篩選出其中具有促大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖活性的可能成分，進而通過二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析得到可能活性成分的結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)果表明，瑪咖低極性成分具有很好的促大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖活性，其中活性較強的主要為Nbenzylhexadecanamide和Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。本方法為簡單、快速分析中藥中促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性成分篩選方法提供了借鑒。

關(guān)鍵詞瑪咖；不同產(chǎn)地；電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜；化學計量學方法；促睪丸間質(zhì)細胞增殖

1引言

瑪咖（Lepidiummeyenii）為十字花科Brassicaceae獨行菜屬Lepidium植物，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)[1]?，斂Ш胸S富的營養(yǎng)成分和具有多種生物活性的次級代謝產(chǎn)物，其中低極性瑪咖酰胺被認為是其特有的標志性成分[2～4]?，斂Ь哂卸喾矫娴乃幚碜饔?，包括提高生育力和性功能、抗疲勞、抗氧化、緩解更年期綜合癥、抗衰老和抗腫瘤等作用[3～5]，在保健品和藥用方面具有廣闊的開發(fā)前景[6]。

近年來對瑪咖中成分的分析方法主要有酸性染料比色法、薄層色譜法（TLC）、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法（GCMS）、高效液相色譜法（HPLC）和高效液相色譜電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCESIMS/MS）[7～12＼]。而對于瑪咖的瑪咖酰胺類成分的研究主要集中在使用酸性染料比色法檢測總生物堿含量[9＼]，以及使用高效液相色譜結(jié)合標準品對主要瑪咖酰胺類化合物的定性與定量研究上[13＼]。電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)作為一種軟電離技術(shù)，已成為研究天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)的重要手段。直接進樣電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法只需要很少的樣品量，并且不需要對被分析物進行分離處理，節(jié)省了分析步驟，提高了檢測效率[14＼]。如能將其與化學計量學方法結(jié)合應(yīng)用[15＼]，就可將被分析中藥等復(fù)雜體系中化學成分組成及結(jié)構(gòu)與其對應(yīng)活性相關(guān)聯(lián)，從而達到快速篩選活性成分的目的。

本研究利用直接進樣電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法對瑪咖低極性化學成分進行分析，結(jié)合化學計量學對所獲得的電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜及不同產(chǎn)地瑪咖樣品促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性數(shù)據(jù)進行處理。結(jié)果用于對來源于不同產(chǎn)地的瑪咖進行有效區(qū)分，并快速篩選分析瑪咖中具有促大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖活性的可能成分和結(jié)構(gòu)，為深入研究瑪咖中促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性成分提供分析方法基礎(chǔ)。

2實驗部分

2.1儀器與試劑

質(zhì)譜分析采用6320iontrap電噴霧離子阱質(zhì)譜（美國Agilent公司）；KQ3200BE超聲波清洗器（中國昆山市超聲儀有限公司）；Model680型酶標儀（日本TAKARA公司）；TGL16B臺式離心機（中國上海安亭科學儀器有限公司）；BP211D型十萬分之一電子天平（北京賽多利斯天平有限公司）。

瑪咖經(jīng)長春中醫(yī)藥大學張輝教授鑒定為十字花科獨行菜屬植物瑪咖（Lepidiummeyenii）的干燥根及根莖。不同批號的云南產(chǎn)瑪咖（Y01Y04）和秘魯產(chǎn)瑪咖（M01M06）購于長春北京同仁堂藥店；乙腈、甲醇和甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；水為超純水（美國MilliQ純水儀）；四甲基偶氮唑鹽（MTT，美國Amresco公司）；DMEM（美國Gibco公司）。

2.2樣品制備

取瑪咖干燥根及根莖適量粉碎為20目粗粉，稱取粉末1.0g，加入無水乙醚10mL，在50℃以下超聲提取60min，過濾，濾液40℃減壓回收溶劑至干，殘渣用乙腈溶解并定容至1mL，用0.22μm濾膜過濾，濾液用于電噴霧質(zhì)譜分析。

另稱取粉末1.0g，按上法制備得到乙醚提取物，溶于適量含有0.5%DMSO的DMEM溶液，配制成100μg/mL瑪咖乙醚提取物樣品溶液，用于睪丸間質(zhì)細胞增殖實驗。

2.3質(zhì)譜條件

質(zhì)量范圍m/z300～500，實驗前質(zhì)量數(shù)經(jīng)過校正；目標分子量400；實驗中采用正離子模式。樣品通過流動注射泵進樣，流速5μL/min；干燥氣溫度：350℃；干燥氣流量：9mL/min；霧化氣壓強：0.24MPa（35.0psi）；毛細管電壓：3.5kV。

2.4睪丸間質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)

取3只SD雄性成年大鼠（吉林大學動物中心提供〔動物合格證號：SCXK（吉）20130005〕），體重250～300g。大鼠斷頸處死，剖開腹腔剝離取出睪丸，放入TypeI膠原酶中，37℃恒溫振蕩器中振蕩消化15min，用3倍體積DMEM稀釋終止消化。過濾、離心后制成懸浮液，吸出后接種于培養(yǎng)瓶中，放于37℃CO2孵箱中培養(yǎng)[16＼]。

2.5應(yīng)用MTT方法檢測瑪咖對細胞增殖狀況

睪丸間質(zhì)細胞分為實驗組和對照組，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL細胞懸液，每組設(shè)立3個平行孔，48h后棄去培養(yǎng)液。實驗組加入100μL的瑪咖乙醚提取物樣品溶液；對照組加入等體積含有0.5%DMSO的DMEM溶液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后每孔加入5mg/mLMTT溶液20μL，繼續(xù)孵育4h，棄上清，每孔加DMSO100μL，充分振蕩10min，在波長570nm處，用酶標儀測定光密度值。

3結(jié)果與討論

3.1不同產(chǎn)地瑪咖中化學成分的電噴霧質(zhì)譜分析

采用正離子掃描模式，在優(yōu)化的ESIMS條件下對來源于云南和秘魯?shù)默斂悠愤M行質(zhì)譜分析，得到其一級質(zhì)譜指紋譜圖（圖1）。從圖1可知，兩種樣品均在m/z300～500范圍內(nèi)具有豐富的物質(zhì)信息，表明ESIMS能夠檢測瑪咖多種低極性化學成分。觀測這些質(zhì)譜峰信號后可以發(fā)現(xiàn)兩種產(chǎn)地瑪咖樣品所含化學成分極為相似，以質(zhì)荷比為偶數(shù)的質(zhì)譜峰為主，包括m/z346，360，368，370，384，406，408，422，436，438等質(zhì)譜信號，其中以m/z384，406，408，422的豐度最大，說明兩種樣品中富含較多的生物堿類成分，并且m/z384，406，408，422對應(yīng)的4個成分含量較大。但同時兩種樣品也存在著一些明顯的差別，如兩種樣品中含有很少質(zhì)荷比為奇數(shù)的質(zhì)譜峰中，云南產(chǎn)瑪咖含有的m/z307質(zhì)譜峰豐度最高，略低于質(zhì)荷比為偶數(shù)的m/z384，408，422的質(zhì)譜峰，而秘魯產(chǎn)瑪咖含有的m/z321，333質(zhì)譜峰豐度明顯高于所有質(zhì)荷比為偶數(shù)的質(zhì)譜峰。為了更好地區(qū)分瑪咖由于產(chǎn)地不同造成的代表性化學成分瑪咖酰胺組成的差異，本研究采用主成分分析法重點針對質(zhì)荷比為偶數(shù)的質(zhì)譜信號進行統(tǒng)計學處理。

3.2不同產(chǎn)地瑪咖電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜的主成分分析

主成分分析法（PCA）是利用降維的思想，在損失很少信息的前提下把多個指標轉(zhuǎn)化為幾個綜合指標的化學計量學方法。在研究復(fù)雜問題時只考慮少數(shù)幾個主成分，更容易抓住主要矛盾，揭示復(fù)雜體系內(nèi)部變量之間規(guī)律，使問題得到簡化，提高分析效率[17，18＼]。本研究采集了兩種產(chǎn)地共10個瑪咖樣品的電噴霧質(zhì)譜以及質(zhì)譜指紋圖譜數(shù)據(jù)，通過PCA來實現(xiàn)不同產(chǎn)地來源樣品的快速區(qū)分，從而為瑪咖產(chǎn)地的快速鑒別提供一種快捷方法。

將每個樣品質(zhì)譜數(shù)據(jù)m/z300～500范圍內(nèi)的質(zhì)譜峰豐度作為變量，應(yīng)用SIMCAP11對每個導(dǎo)出的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行PCA分析，自動得到所有樣本的PCA得分圖和載荷圖。得分圖用于區(qū)分樣本，載荷圖用于分析變量對樣本分類所起的作用，所得主成分分析的結(jié)果見圖2。

如圖2A所示，PC1和PC2兩個主成分分別代表了93.8%和3.3%的樣品變量信息，二者之和達到了97.1%，說明包含了原始樣本的絕大部分信息。圖2A為二維的PCA得分圖，圖中每個點代表1個樣本，其中Y代表云南產(chǎn)瑪咖，M代表秘魯產(chǎn)瑪咖，可以看出兩個產(chǎn)地的瑪咖明顯分為兩類，JP得到良好區(qū)分，表明兩種產(chǎn)地的瑪咖存在差異。圖2B為二維的PCA載荷圖，圖中每個點代表1個離子峰，其絕對值在載荷圖中得分越高，代表該峰對樣品分類所起的作用越大。所有離子峰均在第一主成分上呈正相關(guān)，并且與云南產(chǎn)瑪咖樣品所在區(qū)域相對應(yīng)，說明這些化合物對云南產(chǎn)瑪咖樣品的分類起重要作用[19＼]；尤其是m/z346系數(shù)的絕對值最大，對樣本分類所起的貢獻度也較大，可以將其作為特征差異峰。

3.3不同產(chǎn)地瑪咖電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜與促睪丸間質(zhì)細胞增殖的灰色關(guān)聯(lián)度分析

通過主成分分析得到了區(qū)分兩種產(chǎn)地瑪咖電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜中的特征差異峰，但是未能探明特征差異峰對應(yīng)成分與瑪咖活性是否相關(guān)。故本研究選擇體外大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖率作為活性指標，對其提高生育力和性功能活性進行表征，進而應(yīng)用灰色關(guān)聯(lián)度分析，以期篩選出瑪咖提高生育力和性功能的活性成分。

不同產(chǎn)地瑪樣品在濃度為100μg/mL時均具有促進大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖作用，結(jié)果見表1。

3.4不同產(chǎn)地瑪咖電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜與促睪丸間質(zhì)細胞增殖的灰色關(guān)聯(lián)度分析

主成分分析結(jié)果表明，得分貢獻度較大的質(zhì)譜峰質(zhì)荷比基本為偶數(shù)，且瑪咖的特征成分瑪咖酰胺為含奇數(shù)個N的生物堿類成分，其質(zhì)荷比均為偶數(shù)。故本研究將不同產(chǎn)地瑪咖的電噴霧質(zhì)譜一級質(zhì)譜中CM（44質(zhì)荷比為偶數(shù)的共有離子峰豐度數(shù)據(jù)與促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)，以期篩選出與促睪丸CM）

間質(zhì)細胞增殖活性密切相關(guān)到瑪咖酰胺。灰色關(guān)聯(lián)分析的目的是確定參考序列和若干個比較序列之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度，尋求系統(tǒng)中各個因素間的主要關(guān)系。且灰色關(guān)聯(lián)分析方法不要求有大量數(shù)據(jù)，適合于少數(shù)據(jù)、貧信息的情況，這正符合中藥與天然藥物活性成分篩選的實際需要。通過對原始數(shù)據(jù)標準化轉(zhuǎn)化后，計算灰色關(guān)聯(lián)度[20＼]，得到離子峰對睪丸間質(zhì)細胞增殖活性的貢獻程度排名為：m/z346>384>424>422>368>410>406>436>370>360>408>438>330。其中有5個共有離子峰所代表的化學成分與促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性的關(guān)聯(lián)度>0.6，但與其它離子峰的關(guān)聯(lián)度差別不明顯，由此可知，瑪咖促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性是多種瑪咖酰胺類成分共同作用的結(jié)果（表2）。

3.5不同產(chǎn)地瑪咖電噴霧質(zhì)譜指紋圖譜與促睪丸間質(zhì)ZH（細胞增殖的偏最小二乘法分析

利用SIMCAP11軟件，經(jīng)過多次提取主成分，多次迭代，擬合出不同產(chǎn)地瑪咖的電噴霧質(zhì)譜一級質(zhì)譜中質(zhì)荷比為偶數(shù)的共有離子峰豐度數(shù)據(jù)與促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性數(shù)據(jù)之間的數(shù)理方程[21＼]：y=

0262083x330+0528701x346-0369171x360+0399358x368+0388541x370+0209021x384-0105789x406+00514652x408+00271077x410-0443981x422-0391626x424-0195177x436-0.156797x438（x330～x438為共有離子峰豐度，y為不同產(chǎn)地瑪咖促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性），各離子峰所代表的化學成分對促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性貢獻大小順序為：m/z346>422>368>424>370>360>330>384>436>438>406>408>410，其中m/z346，368，370，384，408和410與活性呈正相關(guān)，而m/z330，360，406，422，424，436和438與活性呈負相關(guān)。ZH）

3.6促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性成分結(jié)構(gòu)分析

綜合灰色關(guān)聯(lián)度分析和偏最小二乘法分析結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)對促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性貢獻最大的前5位離子峰有4個是重合的，分別是m/z346，368，422和424。而且，其中m/z346和m/z368與活性呈正相關(guān)，因此重點對這兩個離子峰所代表的化學成分的結(jié)構(gòu)進行分析。為了明確它們的可能結(jié)構(gòu)，將m/z346和m/z368進行二級質(zhì)譜分析，所得結(jié)果及可能結(jié)構(gòu)式和質(zhì)譜裂解方式分別見圖3和圖4。

根據(jù)二級質(zhì)譜結(jié)果推測，m/z346為準分子離子峰＼[M+H＼]+，說明其分子量為345；在碰撞誘導(dǎo)解離過程中，m/z346離子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z239離子；m/z346離子失去一分子hexadec1en1one（238Da）生成m/z108離子；m/z346離子失去一分子苯（78Da）生成m/z268離子；m/z346離子失去一分子Nmethylenepalmitamide（210Da）生成m/z136離子。以上數(shù)據(jù)與文獻＼[7，8，11，13，22＼]報道一致，故確認EIC為m/z346的化合物為Nbenzylhexadecanamide。

準分子離子峰＼[M+H＼]+（m/z368），說明其分子量為367；在碰撞誘導(dǎo)解離過程中，m/z368離子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z261離子；m/z368離子失去一分子9，12，15順式三烯十八烷酮（260Da）生成m/z108離子；m/z368離子失去一分子（4Z，7Z）deca1，4，7triene（136Da）生成m/z232離子；m/z368離子失去一分子（Z）hepta1，4diene（96Da）生成m/z272離子；m/z368離子失去一分子丁烯（56Da）生成m/z312離子；m/z368離子失去一分子苯甲胺（107Da）生成m/z261離子。以上數(shù)據(jù)與文獻＼[8，11，13，22＼]報道一致，故確認EIC為m/z368的化合物為Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。

4結(jié)論

利用ESIMS對不同產(chǎn)地瑪咖樣品進行質(zhì)譜分析，獲得其一級質(zhì)譜指紋譜圖，結(jié)合主成分分析法（PCA）對所獲得的指紋圖譜數(shù)據(jù)進行處理，能夠較好地區(qū)分云南產(chǎn)和秘魯產(chǎn)的瑪咖樣品，從而為瑪咖產(chǎn)地的快速鑒別提供一種快捷方法。應(yīng)用偏最小二乘法（PLS）和灰色關(guān)聯(lián)度分析（GRA）對所獲得的一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行處理，快速篩選出具有促大鼠睪丸間質(zhì)細胞增殖活性的可能成分。結(jié)合二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析得到2個可能活性成分的結(jié)構(gòu)為Nbenzylhexadecanamide和Nbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamide。值得注意的是，通過PCA分析得到的不同產(chǎn)地瑪咖特征差異峰與通過PLS、GRA分析得到的最佳促睪丸間質(zhì)細胞增殖活性成分均是m/z346（Nbenzylhexadecanamide），且文獻報道Nbenzylhexadecanamide具有延長小鼠負重游泳時間、增強小鼠抗疲勞作用[23＼]，因此可以將其作為瑪咖質(zhì)量控制的重要指標性成分。但本研究推測出的活性成分僅為排序在前列的具有對活性正向影響的較少化合物，其它排序靠后以及負向影響的化合物的結(jié)構(gòu)還未能確定，尚需進一步研究。

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AbstractThelowpolarityconstituentsfromLepidiummeyeniiinYunnanandPeruweredetectedbyelectrosprayionizationtandemmassspectrometry（ESIMS/MS）.Theeffectsof10samplesofLepidiummeyeniionproliferationofratleydigcellsweremeasured.AftertheprocessofMSdatausingprincipalcomponentanalysis（PCA）methods，thesamplesfromYunnanandPeruweredistinguishedeffectively.Subsequently，thegreyrelationaldegreeanalysis（GRA）andpartialleastsquaresanalysis（PLS）wereemployedtorevealthecorrelationbetweencommonpeaksofESIfingerprintofLepidiummeyeniifromdifferentgeographicaloriginsandproliferationactivityofratleydigcells.TheresultssuggestedthatmostlowpolarityconstituentsfromLepidiummeyeniihadgoodactivitiesonproliferationofratleydigcells，inwhichNbenzylhexadecanamideandNbenzy（9Z，12Z，15Z）octadecatrienamideexhibitedthehighestactivities.Inaddition，theproposedprocedurecouldalsobeusedasasimple，quickreferencemethodtoscreentheactivecomponentspromotingLeydigcellproliferationintraditionalChinesemedicine.

KeywordsLepidiummeyenii；Differentgeographicalorigin；Electrosprayionizationtandemmassspectrometry；Chemometricsmethod；Promotingleydigcellproliferation

HQWT6JY（Received26March2016；accepted12July2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.31570347）.