曹 園，耿東升，孫玉華，袁鳳娟

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000； 2.中國人民解放軍新疆軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，新疆 烏魯木齊 830063；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004）

·實驗研究·

瘤果黑種草子總黃酮對RAW264.7細(xì)胞及豚鼠氣管平滑肌的作用

曹 園1，耿東升2，孫玉華3，袁鳳娟1

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000； 2.中國人民解放軍新疆軍區(qū)聯(lián)勤部藥品儀器檢驗所，新疆 烏魯木齊 830063；3.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊 830004）

目的探討瘤果黑種草子總黃酮(TFNG)對 RAW264.7細(xì)胞及豚鼠氣管平滑肌的作用。方法 采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）、Griess Reagent法檢測高、中、低劑量（20，40，80 g／mL）TFNG對脂多糖（LPS）體外誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素8（IL－8）、IL－6、一氧化氮(NO)的影響；采用離體氣管恒溫灌流的方法，制備豚鼠氣管螺旋條標(biāo)本，通過觀察其張力變化考察1，2，4 g／L不同劑量TFNG和10 g／L水煎液對張乙酰膽堿（ACh）和組胺（His）所致痙攣離體豚鼠氣管平滑肌解痙作用。結(jié)果TFNG低于100 g／mL時對RAW264.7細(xì)胞無明顯的毒性作用；與LPS組比較，TFNG低、中、高劑量（20，40，80 g／mL）均能抑制RAW264.7細(xì)胞過量分泌IL－6，IL－8，NO（P＜0.05），且呈一定量效關(guān)系；TFNG低、中、高劑量組（1，2，4 g／L）可明顯舒張ACh及His引起的豚鼠支氣管平滑肌痙攣，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。結(jié)論 TFNG具有一定的體外抗炎及支氣管解痙功能。

瘤果黑種草子總黃酮；巨噬細(xì)胞；支氣管解痙；抗炎；豚鼠

瘤果黑種草屬毛茛科黑種草屬金蓮花亞科植物，為我國新疆維吾爾族常用藥材[1]。本課題的前期研究顯示，瘤果黑種草子提取物中總黃酮(total flavones from Nigella Glandulifera，TFNG)，可明顯減輕慢性阻塞性肺疾病模型大鼠肺部炎性細(xì)胞浸潤，延長引起小鼠哮喘反應(yīng)的潛伏期，有一定的平喘作用[2－3]。但 TFNG對炎性反應(yīng)中巨噬細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響及支氣管平滑肌解痙作用機(jī)制報道少見。本試驗旨在進(jìn)一步研究TFNG對脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7分泌炎癥因子水平的影響，以及乙酰膽堿（acetylcholine chloride，ACh）和組胺（histamine，His）引起的豚鼠支氣管平滑肌痙攣的作用，為慢性阻塞性肺疾病后期的藥物研究提供理論基礎(chǔ)和實驗室依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 動物

健康豚鼠，體質(zhì)量350～450 g，雌雄各半，由新疆維吾爾自治區(qū)實驗動物研究中心提供，實驗動物質(zhì)量合格證號65000200000453，生產(chǎn)許可證為SCXK＜新＞2011－0001）。動物飼養(yǎng)在SPF級動物房，至少飼養(yǎng)1周后再使用；溫度為(22±1)℃，相對濕度為(55±5)%，12 h光暗循環(huán)；飼料和水均在消毒后由動物自由攝取；所有實驗均嚴(yán)格按照實驗動物有關(guān)條例進(jìn)行。

1.1.2 藥物

瘤果黑種草子 Nigella Glandulifera Freyn購自新疆和田墨玉縣，經(jīng)新疆中藥民族藥研究所李曉瑾研究員鑒定為 Nigella Glandulifera Freyn的種子，批號為201404；TFNG粉末由瘤果黑種草子采用40%乙醇回流提取，大孔樹脂分離及聚酰胺樹脂純化而得，TFNG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為58%。

1.1.3 試劑

脂多糖(LPS，美國Sigma公司）；噻唑藍(lán)（MTT，美國Amresco公司）；RPMI1640培養(yǎng)液（美國HyClone公司）；白細(xì)胞介素6（IL－6）；酶聯(lián)免疫吸附劑測定（ELISA）試劑盒(美國eBioscience公司)；IL－8 ELISA試劑盒（購自 Cloud－clone corp公司）；胎牛血清（美國 Gibco公司）；一氧化氮檢測試劑盒（Promega公司）；ACh（美國Sigma公司，貨號為A2661－25G，批號為BCBM4814V）；His（美國 Sigma公司，貨號為 V900396－1G，批號為WXBB2337V）；氨茶堿注射液（常州蘭陵制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H32025188，批號為11409051）。

1.1.4 細(xì)胞株

小鼠單核／巨噬細(xì)胞株RAW264.7，購于北京協(xié)和細(xì)胞資源中心。

1.1.5 儀器

BPN－CH型CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DSY2000X型倒置熒光顯微鏡（重慶澳浦光電技術(shù)有限公司）；TDZ5－WS型多管架自動平衡離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；RT－6100型酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)儀器有限公司）；BL－410F型生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，HV－4型離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)，HW－1000型超級恒溫水?。ǔ啥继┟丝萍加邢薰荆?。1.2 方法

1.2.1 LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子影響試驗[4]

采用MTT法檢測TFNG對RAW264.7細(xì)胞活性的影響。分別設(shè) TFNG組（100.00，50.00，25.00，12.50，6.25 μg／mL）、LPS組、空白對照組，每組設(shè)置3個平行孔，用二甲基亞砜（DMSO）助溶。空白對照組加入培養(yǎng)液，LPS組加入等量含0.5 μg／mL LPS的培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后每孔加入5 g／L的MTT溶液20 μL，避光培養(yǎng)4 h后吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，于室溫下振蕩10 min，于595 nm波長處檢測各孔的吸光度，計算細(xì)胞存活率。

檢測TFNG對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞分泌IL－8，IL－6，NO[5]。采用ELISA檢測IL－8及IL－6的水平，采用Griess法檢測NO的水平。設(shè)空白對照組、LPS組、水煎液組和 TFNG低、中、高劑量組（20，40，80 μg／mL），每組設(shè)置3個平行孔?？瞻捉M加入培養(yǎng)液，TFNG組、水煎液組于加藥4 h后加入0.5 μg／mL的LPS，LPS組加入等量含0.5 μg／mL的LPS培養(yǎng)液。培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24 h后吸取上清液分裝，檢測。

1.2.2 豚鼠離體支氣管解痙試驗[6]

取體質(zhì)量為350～400g的豚鼠36只，隨機(jī)分為9組，雌雄各半，每組4只，分別為生理鹽水組，陽性對照組（氨茶堿 0.008 g／L），水煎液對照組 （10 g／L），TFNG低、中、高劑量組（1，2，4 g／L）。試驗前，用木棒擊昏豚鼠，頸動脈放血致死，分離并取出氣管，仔細(xì)剔除氣管周圍結(jié)締組織，放入飽和混合氣體（95%O2＋5%CO2）的K－H液(NaCl 6.9 g／L，KCl 0.35 g／L，KH2PO40.16 g／L，NaHCO32.1 g／L，MgSO40.28 g／L，CaCl20.28 g／L，葡萄糖2 g／L，pH＝7.2)中。每3～4個軟骨環(huán)切一個螺旋條標(biāo)本，每個氣管段制成3條標(biāo)本，標(biāo)本放在浴槽內(nèi)，每個浴槽內(nèi)加入10 mL(37±0.5)℃恒溫的K－H液，標(biāo)本的一端固定于浴槽底部，另一端連接于肌張力換能器上，浴槽內(nèi)通入混合氣體，打開BL410型生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，調(diào)整平滑肌條初負(fù)荷為1.7 g，記錄一段氣管平穩(wěn)活動的曲線，然后開始給藥。浴槽內(nèi)加入10 μL終質(zhì)量濃度為1×10－7g／mL的ACh（或終質(zhì)量濃度為1×10－6g／mL的 His），待作用明顯時加入各組藥物100 μL，生理鹽水組注入等量生理鹽水。給藥后記錄氣管平滑肌張力的變化，用K－H液沖洗，氣管平滑肌恢復(fù)平穩(wěn)后再加入另一種藥物。計算解痙率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。單因素方差分析進(jìn)行組間比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對RAW264.7細(xì)胞活性的影響

由表 1可見，6.25～100.00 μg／mL的 TFNG對RAW 264.7細(xì)胞活性無明顯影響。因此，本試驗選用的藥物劑量分別為20，40，80 μg／mL。

表1 細(xì)胞活性檢測結(jié)果（n＝4）

2.2 對LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子的影響

LPS組與空白對照組比較，IL－8，IL－6，NO含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明建模成功。與LPS組相比，TFNG高、中、低劑量組IL－8，IL－6，NO含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

2.3 豚鼠離體支氣管解痙試驗

與生理鹽水組比較，陽性對照組、水煎液對照組及TFNG低、中、高劑量組解痙率明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。詳見表3和表4。

表2 TFNG對RAW264.7細(xì)胞分泌IL－8，IL－6，NO的影響（±s，n＝3）

表2 TFNG對RAW264.7細(xì)胞分泌IL－8，IL－6，NO的影響（±s，n＝3）

注：與LPS組比較， P＜0.01， P＜0.05；與空白對照組比較， P＜0.01。表4同。

組別空白對照組LPS組水煎液組TFNG低劑量組中劑量組高劑量組劑量（ g／mL）－0.5 100 20 40 80 IL－8（ng／L）2.27±0.38 236.84±1.05 74.50±17.40 131.82±31.51 56.78±13.04 42.13±9.43 IL－6（ng／L）2.42±0.77 3 597.95±140.56 2 434.76±109.30 3 244.03±156.13 1 851.73±124.85 1 107.95±109.21 NO（ mol／L）1.32±0.31 11.40±0.91 8.71±0.65 10.21±0.86 8.91±0.30 7.84±0.43

表3 TFNG對豚鼠離體氣管平滑肌的影響（±s，n＝8）

表3 TFNG對豚鼠離體氣管平滑肌的影響（±s，n＝8）

注：與生理鹽水組比較， P＜0.01。下表同。

組別生理鹽水組陽性對照組水煎液對照組TFNG低劑量組中劑量組高劑量組終質(zhì)量濃度（g／L）－0.008 10 124給藥前2.65±0.11 2.49±0.37 2.56±0.25 2.58±032 2.66±0.31 2.71±0.21張力（g）給藥后2.56±1.05 1.02±0.32 2.21±4.01 1.73±3.98 1.68±4.67 1.58±3.96 ACh解痙率（%）3.23±1.63 59.24±0.26 14.01±3.94 33.11±4.24 36.98±4.27 41.55±4.01

表4 TFNG對豚鼠離體氣管平滑肌的影響（±s，n＝8）

表4 TFNG對豚鼠離體氣管平滑肌的影響（±s，n＝8）

張力（g）組別生理鹽水組陽性對照組水煎液組TFNG低劑量組中劑量組高劑量組終質(zhì)量濃度（g／L）－0.008 10 124給藥前2.43±0.23 2.53±0.27 2.72±0.47 2.61±0.14 2.65±0.32 2.57±0.12給藥后2.33±2.08 0.55±2.14 1.64±9.86 1.61±8.99 1.51±10.60 1.28±6.12 His解痙率(%) 4.46±2.07 79.14±1.90 40.16±12.20 38.71±12.73 41.32±11.47 50.96±7.71

3 討論

LPS是革蘭陰性菌釋放的一種內(nèi)毒素，是炎性反應(yīng)的誘導(dǎo)因素之一。當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎性反應(yīng)時，LPS可進(jìn)入肺內(nèi)與相應(yīng)的單核細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面受體蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，促進(jìn)炎性細(xì)胞釋放IL－8，IL－6，NO等多種炎癥因子，其過度表達(dá)激活了效應(yīng)細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子和炎癥介質(zhì)，加大炎性反應(yīng)。

活化的巨噬細(xì)胞是炎性反應(yīng)中的NO，IL－8，IL－6等細(xì)胞因子的重要來源[7－9]。NO作為炎癥介質(zhì)的重要因子之一，致炎物質(zhì)可誘導(dǎo)或增加NO的合成和釋放，從而促進(jìn)炎癥部位滲出和水腫。IL－8又稱嗜中性粒細(xì)胞因子，對特異性和非特異性的免疫細(xì)胞具有強(qiáng)烈的趨化作用，其在炎癥局部、血清和體液中均有顯著增加。IL－6是一種多功能細(xì)胞因子，具有抗炎和致炎的雙向功能，其作用與組織中的含量有關(guān)，正常水平的IL－6對機(jī)體有利，產(chǎn)生過多會引起一系列炎性損傷。

豚鼠氣管平滑肌主要分布著M受體、β2受體和H1受體，其中M受體和H1受體興奮使氣管平滑肌收縮，β2受體興奮使氣管平滑肌舒張[10－11]。因此，ACh通過啟動M受體，組胺作用于H1受體，發(fā)揮氣管平滑肌收縮作用，總黃酮能抑制ACh、組胺引起的氣管平滑肌收縮，表明其作用可能與抑制氣管平滑肌M受體、H1受體有關(guān)。

本研究中，LPS刺激RAW264.7細(xì)胞后，可迅速誘導(dǎo) IL－8，IL－6，NO的表達(dá)，TFNG高、中、低劑量組對IL－8，IL－6，NO的過量分泌具有不同程度的抑制作用，且呈一定的劑量依賴關(guān)系。豚鼠離體支氣管解痙實驗中，TFNG低、中、高劑量均可明顯舒張豚鼠氣管平滑肌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

本研究結(jié)果顯示，TFNG具有明顯拮抗ACh和His收縮支氣管平滑肌的作用，使支氣管平滑肌松弛，支氣管擴(kuò)張，解除氣管平滑肌痙攣，提示TFNG舒張支氣管平滑肌作用可能與抑制氣管平滑肌M受體、H1受體有關(guān)[12－13]。TFNG還可以一種劑量依賴性的方式下調(diào)細(xì)胞釋放NO，IL－8，IL－6，從而介導(dǎo)炎性反應(yīng)，緩解炎癥部位炎性細(xì)胞浸潤，提示TFNG可能通過抑制炎癥因子IL－8，IL－6和NO的生成發(fā)揮抗炎作用。提示從瘤果黑種草子中提取的總黃酮的藥理活性比水煎液強(qiáng)。

前期大量的動物藥理試驗表明，TFNG具有良好的體內(nèi)抗炎及平喘作用[14－20]，本試驗中主要針對 TFNG體外抗炎及豚鼠離體氣管平滑肌解痙作用進(jìn)行了研究。TFNG可能通過抑制氣管平滑肌M受體、H1受體發(fā)揮氣管解痙作用達(dá)到平喘的目的；通過下調(diào)巨噬細(xì)胞釋放NO和IL－8，IL－6等炎癥細(xì)胞因子發(fā)揮抗炎作用，達(dá)到減輕組織炎性細(xì)胞浸潤及氣道炎性反應(yīng)的目的。其作用機(jī)制可能是瘤果黑種草子治療呼吸系統(tǒng)疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)。

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Effect of Total Flavones from Nigella Glandulifera on RAW264.7 Cells and Guinea Pig Tracheal Smooth M uscle

Cao Yuan1,Geng Dongsheng2,Sun Yuhua3,Yuan Fengjuan1
(1.Xinjiang Medical University,Wulumuqi,Xinjiang,China 830000; 2.Institute for Drug and Instrument Control,Joint Military Department,Xinjiang Military Area Command,Wulumuqi,Xinjiang,China 830063; 3.Institute of Materia Medica,Wulumuqi,Xinjiang,China 830004)

Objective To study the effect of total flavones from Nigella Glandulifera(TFNG)on RAW264.7 cells and guinea pig tracheal smooth muscle.M ethods The high,medium and low dose(20,40,80 μg／mL)of TFNG was used to detect the secretion of interleukin－8 in RAW264.7 cells induced by lipopolysaccharide(LPS)by enzyme－linked immunosorbent assay(ELISA)and Griess Reagent method.IL－8,IL－6 and nitric oxide(NO)were measured.The tracheal spiral specimens of guinea pigs were prepared by the method of constant－temperature perfusion with tracheal trachea.The changes of the tension were observed by 1,2,4 g／L dose of TFNG and 10 g／L decoction on antipruritic effects of guinea pig tracheal smooth muscle induced by tacrolipotentin(ACh)and histamine(His).Results TFNG had no significant toxic effect on RAW264.7 cells at less than 100 μg／mL.Compared with LPS group,the TFNG low, medium and high dose group(20,40,80 μg／mL)could inhibit RAW264.7 cells and the levels of IL－6,IL－8 and NO(P＜0.05), and there was a significant dose－dependent relationship.The TENG low,medium and high dose group(1,2,4 g／L)could significantly relax the bronchial smooth muscle spasms of guinea pig induced by ACh and His,the difference was statistically significant(P＜0.01).Conclusion TFNG has some anti－inflammatory and bronchial antispasmodic effects in vitro.

total flavones from Nigella Glandulifera;macrophage;bronchodilation;anti－inflammatory;guinea pig

R285.5

A

1006－4931(2017)05－0006－04

2016－12－07；

2017－01－07)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.05.002

國家自然科學(xué)基金[69483382]。

曹園（1991－），女，在讀碩士研究生，研究方向為抗炎免疫，（電子信箱）1595645286＠qq.com。通訊作者：耿東升，碩士研究生，主任藥師，研究方向為抗炎免疫，（電子信箱）dongsheng811＠sina.com。