吳麗紅，任麗英，陳志鋼

（河北省唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院，河北 唐山 064000）

·實驗研究·

紫葉李果實總黃酮抗氧化性能實驗研究

吳麗紅，任麗英，陳志鋼

（河北省唐山市豐潤區(qū)人民醫(yī)院，河北 唐山 064000）

目的考察紫葉李果實總黃酮(PCE)的抗氧化活性。方法 采用紫外－可見分光光度法，在體外化學模擬條件下測定PCE的總還原能力，對1，1－二苯基－2－苦味肼基(1，1－Diphenyl－2－picrylhydrazy，DPPH)、超氧陰離子(O2－)、羥基自由基(·OH)、一氧化氮(NO)的清除作用及對脂質(zhì)過氧化的抑制作用，研究PCE的抗氧化活性。結(jié)果PCE在1，2，4，6，8 g／mL質(zhì)量濃度下，吸光度逐漸增加(0.189±0.02，0.287±0.01，0.451±0.003，0.708±0.001，0.769±0.002)，具有較強的還原能力，能明顯地抑制·OH，O2－，DPPH，NO的生成；對照組、抗壞血酸組、PCE組（0.40，0.80，0.160 g／L）丙二醛(MDA)清除率分別為50.1%，19.6%，31.8%，45.9%，能有效抑制MDA的產(chǎn)生。結(jié)論 PCE具有較強的抗氧化活性，且呈明顯的量效關(guān)系。

紫葉李果實總黃酮；脂質(zhì)過氧化；氧自由基；抗氧化

薔薇科植物紫葉李是多年生落葉小喬木，原種產(chǎn)于亞洲西南部，較耐濕，有一定耐寒力，在我國廣泛種植，資源豐富。國內(nèi)外學者對紫葉李同屬植物的化學成分進行了報道，從葉子、果實、種子等部位分離得到黃酮類、花色素類、香豆素類、新木脂素類等成分[1]。自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類可以單獨存在的，具有高度氧化活性的，帶有一個或幾個不配對電子的分子或原子。研究表明，這些活性氧非常活潑，易攻擊生物膜及核酸和蛋白，造成生物膜脂質(zhì)過氧化，核酸斷裂和蛋白硝化等易引發(fā)細胞凋亡或壞死的嚴重后果；心腦血管疾病、衰老及腫瘤疾病的發(fā)生和發(fā)展也與體內(nèi)的活性氧自由基密切相關(guān)[2－3]。植物中的酚類、黃酮類等物質(zhì)具有良好的抗氧化作用，尤其是黃酮類成分在清除自由基、抗氧化、抗衰老方面發(fā)揮著重要作用，其抗氧化作用主要通過直接捕捉和清除氧自由基來實現(xiàn)，能有效預(yù)防上述疾病的發(fā)生與發(fā)展[4－7]。因此，本研究中通過測定紫葉李果實總黃調(diào)(PEC)總還原能力，PCE對羥基自由基(·OH)、超氧陰離子(O2－)、1，1－二苯基－2－苦味肼基(1，1－Diphenyl－2－picrylhydrazy，DPPH)及 NO的清除率，PCE對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響，研究紫葉李果實的藥用保健價值，為研發(fā)紫葉李果實(作為一種天然的抗氧化物)提供科學的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試藥與儀器

實驗動物：昆明種小鼠，清潔級，雌、雄各半，體質(zhì)量18～22 g，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK豫2015～0001。飼養(yǎng)條件，小鼠置經(jīng)84消毒的塑料籠中飼養(yǎng)，溫度(20±2)℃，相對濕度 50% ～60%，光暗周期12 h／12 h，自由攝食、飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

試藥：鄰苯三酚（批號為20150517），鄰二氮菲（批號為20150511），抗壞血酸（批號為20150923），均為分析純，購于中國醫(yī)藥上?；瘜W試劑公司；30% 雙氧水（批號為20150918），F(xiàn)eSO4（批號為20150923），硫代巴比妥酸(TBA，批號為20151123)，三氯乙酸(TCA，批號為20150815)，均為分析純，購于天津市藥通化學試劑有限公司；水楊酸（批號為2015327，天津大茂化學試劑廠）；三羥甲基氨基甲烷(Tris，批號為150921，上海源葉生物科技有限公司)；1，1－二苯基－2－苦味肼基(DPPH，STBB0510，Sigma－Aldrich公司)；維生素C（分析純，批號為20101101－1，廣州化學試劑廠）。紫葉李果實采摘于唐山市華北理工大學校園，經(jīng)華北理工大學韓淑英教授鑒定為正品。

儀器：Biofuge strutos型高速低溫離心機(Kendro Laboratory Products)；JY92－2D型超聲波細胞粉碎機(寧波新芝科器研究所)；YKH－I型液體快速混合器(江西醫(yī)療器械廠)；TU－180型紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；FJ－200型高速分散均質(zhì)機(上海標本模型廠)；RE52－99型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；FA2104N型普通電子天平(上海民橋精密儀器廠)；ZDHW型電熱套(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(上海醫(yī)療器械五廠)；予華SHZ－Ⅲ循環(huán)水式真空泵(上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司)；SB－B20002型電子天平(盛博電子衡器有限公司)；NO檢測試劑盒(Beyotime公司)。

1.2 方法

1.2.1 PCE的制備

洗凈紫葉李果實，去核，粉碎成粗粉，精密稱取干燥至恒重的果實粗粉，待用。圓底燒瓶中加入500 mL飽和石灰水，煮沸2～3 min后，加入果實粗粉，然后加熱（微沸）回流提取2次，每次2 h，趁熱用脫脂棉過濾。將所得濾液放置稍冷（60～70℃），用濃鹽酸調(diào)pH至4～5，放置過夜，沉淀完全，抽濾，得淡黃色PCE粗品。將總黃酮粗品置燒杯中，加適量（按總黃酮粗品∶水＝1 g∶200 mL）蒸餾水，于電熱套上加熱溶解，趁熱過濾。濾液靜置1 h，即析出精制PCE，最終總黃酮得率為86%。將上述精制總黃酮溶解至所需的濃度，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 自由基溶液的制備[8]

O2－溶液：稱取0.788 0 g Tris－HCl，精密稱定，置100 mL棕色容量瓶中，蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH至8.50，定容至刻度，搖勻，制成50.00 mmol／L的緩沖溶液；吸取37%的濃鹽酸溶液33.33 mL，置50 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成 8.00 mmol／L的鹽酸溶液，吸取0.31 mL，置250 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成 10.00 mmol／L的鹽酸溶液；稱取0.315 3 g鄰苯三酚，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用10.00mmol／L的鹽酸溶液溶解，定容至刻度，搖勻，制成25.00 mmol／L的溶液。

·OH溶液：稱取硫酸亞鐵0.136 8 g，精密稱定，置50 mL棕色容量瓶中，蒸餾水溶解，定容至刻度，搖勻，制成9.84 mmol／L的母液(使用時稀釋至1.09 mmol／L)；精密稱取水楊酸0.124 3 g，置50 mL容量瓶中，無水乙醇溶解，定容至刻度。搖勻，制成18.00 mmol／L的母液（使用時稀釋至2.0 mmol／L）；吸取30%的過氧化氫溶液1.00 mL，置100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，搖勻，制成0.03%的過氧化氫溶液。

1.2.3 PCE抗氧化作用實驗[9－16]

PCE的總還原能力測定：采用鐵氰化鉀還原法，加樣表見表1。取10 mL試管，分別加入系列PCE溶液（1，2，4，6，8 g／L）1 mL，磷酸鹽緩沖溶液（0.2 mol／L，pH 6.6）0.5 mL和0.3% 鐵氰化鉀1.5 mL，置50℃水浴中反應(yīng)20 min，然后加入10% 三氯乙酸（TCA）1 mL，混勻后以3 000 r／min的速率離心10 min，取上清液2 mL，加0.5 mL 0.3% 三氯化鐵溶液，振搖后在700 nm波長處測定吸光度，3次平行試驗，得 A1，A2，A3，取平均值。

總還原能力＝（A1＋A2＋A3）／3

式中 A1，A2，A3為每個濃度平行3次的吸光度值。

PCE對O2－清除率的測定：采用改良的鄰苯三酚自氧化法，具體操作見表2。加0.05 mol／L Tris－HCl溶液（pH＝8.2）4.5 mL于試管中，置25℃水浴20 min。加入不同質(zhì)量濃度的PCE溶液（1，2，4，6，8 g／L）0.4 mL和25℃保溫過的鄰苯三酚溶液（10 mmol／L HCl配制）0.08 mL，加入后快速搖勻，然后以空白作對照測定樣品的 A325，每隔0.5 min記錄1次，連續(xù)記錄4 min，各管的氧化速率及對O2－的清除率按下列公式計算。

式中，A0為 O2－溶液加蒸餾水1 mL的吸光度，A1為樣品溶液本身的吸光度值，A2為O2－溶液加樣品溶液1 mL的吸光度。

PCE對·OH清除率的測定[11，13]：具體操作見表3。采用鄰二氮菲－Fe2＋－H2O2法，PCE不同質(zhì)量濃度（1，2，4，6，8 g／L），按表3進行加樣。將各試管搖勻放入37℃恒溫水浴箱中保溫1 h后測定 A509，各管對·OH的清除率按下列公式計算。

表1 用鐵氰化鉀還原法加樣表（mL）

式中，A0為O2－溶液加蒸餾水2 mL的吸光度，A1為O2－溶液加樣品溶液1 mL的吸光度，A2為樣品溶液本身的吸光度值。

表2 鄰苯三酚自氧化法加樣表(mL)

表3 鄰二氮菲－Fe2＋－H2O2法加樣表(mL)

PCE對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響[11，13]：小鼠處死后立即打開腹腔，用預(yù)冷的生理鹽水從門靜脈沖洗肝臟后取出肝臟，用4℃生理鹽水洗凈表面血污，稱定質(zhì)量，用預(yù)冷的生理鹽水制成 10% 的肝勻漿，以3 000 r／min的速率離心10 min，取上清液備用，卡馬斯亮藍試劑盒測蛋白，制成含蛋白質(zhì)0.005 g／mL的溶液。取2.5%肝勻漿懸浮液1 mL，加入陽性對照藥抗壞血酸（0.080 g／L）及不同質(zhì)量濃度的PCE溶液0.2 mL （0.040，0.080，0.160 g／L），平行3次，37℃水浴60 min，加入15%TCA 1 mL終止反應(yīng)，再加入0.67%TBA 1 mL，于沸水浴中顯色15 min，冷卻后離心，取上清液測定吸光度 A532，以 A表示丙二醛(MDA)的含量，MDA的清除率按下列公式計算。

PCE對DPPH清除活性的測定[15]：取DPPH對照品80.00 mg，精密稱定，加20.00 mL 70% 乙醇，配制成0.4%的DPPH母液，避光保存，臨用前稀釋成0.04%。以70%乙醇溶液將紫葉李提取液依次稀釋成含黃酮量20，40，60，80，100 mg／L的梯度溶液。樣品管中加入0.50 mL不同濃度的紫葉李提取液與 2.50 mL的0.04%DPPH溶液；以95%乙醇代替DPPH溶液為對照溶液，以蒸餾水代替紫葉李提取液作空白溶液。以上3組置28℃ 水浴30 min后，用0.50 mL蒸餾水和2.50 mL 70%的乙醇調(diào)零，于517 nm波長處測定 A，平行3次。用同樣濃度系列的維生素C溶液作陽性對照，用以下公式計算PCE對DPPH的清除率。

式中，A空白為蒸餾水 0.50 mL＋DPPH 2.50 mL的吸光度，A樣品為供試液 0.50 mL＋DPPH 2.50 mL的吸光度，A對照為供試液 0.50 mL＋70% 乙醇 2.50 mL的吸光度。

PCE對NO清除活性的測定[16]：采用Beyotime公司NO檢測試劑盒中的NO檢測系統(tǒng)略作改進。在0.50 mL硝普鈉(25.00 mmol／L)中，加入2.00 mL不同濃度的紫葉李總黃酮提取液(提取液的配制同DPPH清除活性測定項下方法)，用0.50 mL蒸餾水代替硝普鈉為對照溶液，以 2.00 mL蒸餾水代替樣品溶液為空白溶液，25℃下放置90 min后，加入1.50 mL的Griess試劑，于540 nm波長處以蒸餾水調(diào)零測定吸光度，平行3次，用同樣濃度系列的維生素C溶液作陽性對照，根據(jù)以下公式計算各種樣品對NO的清除率。

式中，A空白為0.50 mL硝普鈉＋2.00 mL蒸餾水的吸光度，A樣品為0.50 mL硝普鈉＋2.00 mL藥物溶液的吸光度，A對照為0.50 mL蒸餾水＋2.00 mL藥物溶液的吸光度。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 PCE的總還原能力

以樣品吸光度為縱坐標和質(zhì)量濃度為橫坐標作圖。抗氧化劑的還原能力是其抗氧化活性的重要指標，一般物質(zhì)的還原能力越強，其抗氧化活性也越強。PCE 1，2，4，6，8 g／L質(zhì)量濃度的吸光度逐漸增加，表明PCE的還原能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增強。詳見圖1。

2.2 PCE對O2－的清除作用

以樣品清除率和質(zhì)量濃度作圖。PCE清除率總體呈上升趨勢，在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除作用不如高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除效果好，且呈良好的劑量依賴關(guān)系。詳見圖2。

2.3 PCE對·OH的清除作用

以樣品清除率和質(zhì)量濃度作圖。與對O2－的清除作用相比，對·OH的清除效果較差。PCE清除率總體呈上升趨勢，在低質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，清除作用不如高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除效果好，且呈良好的劑量依賴關(guān)系。詳見圖3。

圖2 PCE對O2－的清除作用

圖3 PCE對·OH的清除作用

2.4 PCE對小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響

由表4可見，PCE各劑量組均可抑制肝勻漿自發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，呈良好的量效關(guān)系，其抑制效果表現(xiàn)為隨質(zhì)量濃度升高而逐漸上升的趨勢。

2.5 PCE對DPPH的清除活性

由表5可見，20～100 mg／L紫葉李總黃酮對DPPH自由基有明顯的清除作用，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，其抑制效果表現(xiàn)為隨質(zhì)量濃度升高而逐漸上升的趨勢。

2.6 PCE對NO的清除活性

由表6可見，20～100 mg／L紫葉李總黃酮對NO自由基有一定的清除作用，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系，其抑制效果表現(xiàn)為隨質(zhì)量濃度升高而逐漸上升的趨勢。

表4 PCE小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響（±s）

表4 PCE小鼠肝勻漿自發(fā)性脂質(zhì)過氧化的影響（±s）

注：與對照組比較， P＜0.05；與抗壞血酸組比較， P＜0.05；與PCE低質(zhì)量濃度組比較， P＜0.05。

組別對照組抗壞血酸組PCE組質(zhì)量濃度(g／L) 0.080 0.040 0.080 0.160 A532 0.123±0.001 0.059±0.032 0.105±0.011 0.085±0.003 0.071±0.021清除率（%）50.1 19.6 31.8 45.9

表5 PCE與維生素C對DPPH的清除率比較(±s，%，n＝3)

表5 PCE與維生素C對DPPH的清除率比較(±s，%，n＝3)

組別PCE組對照組質(zhì)量濃度(mg／L) 20 17.55±0.21 15.68±0.14 40 30.64±0.23 33.23±0.07 60 42.68±0.19 47.99±0.21 80 51.48±0.17 64.46±0.05 100 60.98±0.22 66.23±0.13

表6 PCE與維生素C對NO的清除率比較(±s，%，n＝3)

表6 PCE與維生素C對NO的清除率比較(±s，%，n＝3)

組別PCE組對照組20 22.32±3.69 24.38±7.43 40 20.76±8.09 55.73±5.89質(zhì)量濃度(mg／L) 60 29.35±5.79 67.21±3.69 80 80.98±9.57 85.25±2.01 100 64.43±2.79 87.95±3.95

3 討論

自由基可引起人體組織衰老，誘發(fā)心血管疾病，癌癥等。氧自由基(OFR)主要是指O2－和·OH，可引起細胞損傷和死亡，并與某些疾病的發(fā)生有密切關(guān)系，已引起社會各界尤其是醫(yī)學界的廣泛關(guān)注[17]。OFR能調(diào)節(jié)花生四烯酸的代謝，刺激吞噬細胞和中性粒細胞的吞噬殺菌功能和免疫過程，有利于機體健康；可使許多生物大分子如核酸、蛋白質(zhì)、膜多聚不飽和脂肪酸發(fā)生超氧化反應(yīng)，生物大分子出現(xiàn)交聯(lián)或斷裂，進而引起細胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞[17]。目前，由氧自由基引起的疾病已超過100余種。有報道稱，心血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病及消化系統(tǒng)疾病等都與氧自由基有關(guān)[18]。

鄰苯三酚自氧化能產(chǎn)生O2－和有色物質(zhì)，該有色中間物在325 nm波長處有吸收峰，如加入O2－清除劑，就會抑制鄰苯三酚自氧化，同時也抑制有色物質(zhì)的產(chǎn)生，325 nm波長處的吸收峰受到抑制。通過 A325值的變化可判斷O2－清除能力的強弱。H2O2和Fe2＋產(chǎn)生·OH，鄰二氮菲－Fe2＋水溶液可被氧化成鄰二氮菲－Fe3＋，使鄰二氮菲－Fe2＋在509 nm波長處的最大吸收峰小時，當體系中存在·OH清除劑時，此氧化過程受到抑制，A509降低，可通過 A509來判斷·OH 的清除能力[11]。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要降解產(chǎn)物，其含量的多少直接反映脂質(zhì)過氧化的程度，也反映細胞受自由基攻擊的程度[11，19]。

研究表明，PCE具有很好的抗氧化能力，生物活性強，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、調(diào)血脂、抗輻射、抗菌、抗病毒、保護肝臟等保健作用[20]。本研究對紫葉李果實總黃酮的總還原能力和抗自由基活性進行了研究。關(guān)于研究抗氧化活性的實驗方法很多，如體外的有測定自由基，包括羥基自由基、超氧自由基、脂質(zhì)過氧化，DPPH法，體內(nèi)的如SOD，CAT，GSH－PX，MDA等方法。從總還原能力、清除自由基能力及抑制脂質(zhì)過氧化能力等方面考慮，采用體外方法測定總還原能力，可通過測定羥基自由基、超氧自由基的變化及小鼠肝勻漿中脂質(zhì)過氧化過程中MDA的變化來實現(xiàn)。

本研究中采用體外實驗的方法探究PCE的抗氧化活性，結(jié)果顯示，PCE對DPPH，·OH，O2－，NO具有較好的清除能力，能明顯抑制脂質(zhì)過氧化，表明PCE具有較好的抗氧化能力，具有進一步開發(fā)利用的價值，因此PCE在抗氧化活性方面的藥用價值有待更深層次的開發(fā)研究。

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Antioxidant Effect of Total Flavonoids in the Fruits of Pranus Cerasifera

Wu Lihong,Ren Liying,Chen Zhigang
(Fengrun District People′s Hospital,Tangshan,Hebei,China 064000)

Objective To study the antioxidant effect of total flavonoids in the fruits of Pranus cerasifera(PCE).M ethods The total reducing ability of PCE was determined by UV－Vis spectrophotometry.The total reduction ability of PCE,the effects of 1,1－Diphenyl－2－picrylhydrazy(DPPH),superoxide anion(O2－),hydroxyl radical(·OH),nitric oxide(NO)and the inhibition of lipid peroxidation were determined by the method of in vitro chemical simulation.The antioxidant activity of PCE was studied.Results The absorbance of PCE increased at the concentration of 1,2,4,6,8 g／mL (0.189±0.02,0.287±0.01,0.451±0.003,0.708±0.001,0.769±0.002),which had strong reducing ability and could significantly inhibit the generation of·OH,O2－,DPPH,NO;The levels of malondialdehyde(MDA) in the control group,ascorbic acid group and PCE group(0.40,0.80,0.160 g／L)were 50.1%,19.6% and 31.8%,45.9%,respectively,showing the levels of MDA could effectively inhibited.Conclusion PCE has strong antioxidant effect and has obvious dose－effect relationship.

total flavonoids in the fruits of Pranus cerasifera(PCE);lipid peroxidation;oxygen free radical;antioxidant

R285.5

A

1006－4931(2017)05－0015－05

2016－11－23；

2016－12－04)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.05.004

吳麗紅，大學本科，研究方向為藥物作用機制及藥劑學，（電子信箱）18730295361＠163.com。