張 博，韓紅園，王寶麗，李彤彤，林瑞超

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院·中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)中心·北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100102）

·實(shí)驗(yàn)研究·

正交試驗(yàn)法優(yōu)選地 提取工藝

張 博，韓紅園，王寶麗，李彤彤，林瑞超

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院·中藥品質(zhì)評(píng)價(jià)中心·北京市重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100102）

目的優(yōu)選地 中牡荊素、異牡荊素、蘆丁的提取工藝。方法 采用 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以地 中牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量為考察指標(biāo)，對(duì)超聲時(shí)間、超聲功率、甲醇濃度、液料比4個(gè)因素進(jìn)行考察，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)及方差分析。優(yōu)選最佳工藝條件，采用高效液相色譜法進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果最佳提取工藝為在140 W超聲功率下，以40倍80%甲醇超聲提取35 min。結(jié)論 該試驗(yàn)設(shè)計(jì)合理，結(jié)果重復(fù)性好，可為地 的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

地 ；提取工藝；正交試驗(yàn)；牡荊素；異牡荊素；蘆丁

地 為野牡丹科植物地 Melastoma dodecandrum Lour.的干燥全草，歸肝、脾、胃、大腸經(jīng)，有清熱化濕、止痛止血等功效?，F(xiàn)代藥理研究表明，地 提取物有鎮(zhèn)痛消炎、顯著降低四氧嘧啶性糖尿病小鼠的血糖、調(diào)血脂、止血、抗氧化等作用[1－3]。研究表明，地 還可治療肝炎、肝腫大、腎盂腎炎等疾病[4]。地 質(zhì)量控制指標(biāo)主要為沒食子酸、槲皮素，但兩者多在酸性條件下提取，容易發(fā)生水解，所測(cè)成分不能完全代表藥材的質(zhì)量。地 中主要含有黃酮類成分，已經(jīng)分離、鑒別出約28種。本研究中首次采用 L9(34)正交試驗(yàn)法對(duì)地 中3種黃酮類成分牡荊素、異牡荊素、蘆丁進(jìn)行同時(shí)測(cè)定，并進(jìn)行提取工藝研究，采用多指標(biāo)綜合評(píng)分法[6]對(duì)其提取工藝進(jìn)行評(píng)價(jià)，可全面地反映地 藥材的質(zhì)量，為工業(yè)化生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Alliance Waters e2695型高效液相色譜儀(美國沃特世公司，包括2998型二極管陣列檢測(cè)器，Empower3.0色譜數(shù)據(jù)工作站)；Mettler MS105DU型電子分析天平(梅特勒－托利多儀器＜上海＞有限公司)；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW－200型高速萬能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）。

1.2 試藥

牡荊素對(duì)照品（批號(hào)為PS14070702，純度為99.64%），異牡荊素對(duì)照品（批號(hào)為PS14042202，純度為99.66%），蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為PS16011302，純度為95.95%），均購自成都普思生物科技股份有限公司；甲醇為色譜純（美國Fisher公司）；水為娃哈哈純凈水；其余試劑均為分析純。試驗(yàn)用地 全草產(chǎn)自福建，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)林瑞超教授鑒定為野牡丹科植物地 Melastoma dodecandrum Lour.的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃酮類成分含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax SB－C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇(A)－0.2%甲酸水（B）溶液，梯度洗脫（0～3 min，5%～40%A；3～20 min，40%A）；檢測(cè)波長：354 nm；柱溫：29℃；流速：1 mL／min；進(jìn)樣量：15 μL。在此色譜條件下，各成分色譜峰分離度良好，色譜圖見圖1。

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取牡荊素對(duì)照品5.53 mg，精密稱定，異牡荊素對(duì)照品5.63 mg，蘆丁對(duì)照品2.74 mg，分別置25，10，10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得各對(duì)照品貯備液。分別精密吸取上述對(duì)照品貯備液牡荊素3 mL，異牡荊素2 mL，蘆丁1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，配制成每1 mL含牡荊素0.066 36 mg，異牡荊素0.112 6 mg，蘆丁0.027 4 mg的混合對(duì)照品溶液。保存于4℃冰箱，備用。

圖1 高效液相色譜圖

供試品溶液：取地 藥材粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按正交試驗(yàn)方法進(jìn)行超聲提取，放冷，用提取溶劑補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，上清液用0.22 μm濾膜過濾，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取混合對(duì)照品溶液5，10，15，20，25 μL注入高效液相色譜儀，記錄各峰面積。以被測(cè)物質(zhì)量(X)對(duì)峰面積積分值(Y)進(jìn)行線性回歸，得牡荊素、異牡荊素、蘆丁的回歸方程分別為，Y＝2.37× 106X＋2.96×104（r＝0.999 9），Y＝2.28×106X＋4.39×104（r＝0.999），Y＝1.65×106X＋0.39×104（r＝1.000）。結(jié)果表明，牡荊素、異牡荊素、蘆丁進(jìn)樣量分別在0.331 8～1.659 0 μg，0.563～2.815 μg，0.137～0.685 μg范圍內(nèi)與峰面積積分值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取上述同一混合對(duì)照品溶液15 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果牡荊素、異牡荊素、蘆丁平均峰面積的 RSD分別為1.18%，1.21%，1.48%（n＝6），表明儀器精密度較好。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一批地 藥材粉末約0.5 g，共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液并測(cè)定。結(jié)果牡荊素、異牡荊素、蘆丁的平均含量分別為0.714，1.144，0.411 mg／g，RSD分別為1.61%，1.50%，1.86%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn):取同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，16，24，36 h時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果牡荊素、異牡荊素、蘆丁平均峰面積的 RSD分別為1.19%，1.02%，1.63%（n＝7），表明供試品溶液在36 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批已知含量的地 藥材粉末約0.25 g，精密稱取 6份，依法制備供試品溶液并測(cè)定，計(jì)算牡荊素、異牡荊素、蘆丁的加樣回收率。結(jié)果見表1。

2.2 正交試驗(yàn)

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用L9（34）正交試驗(yàn)表對(duì)超聲時(shí)間（A）、超聲功率（B）、甲醇濃度（C）、液料比（D）4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以牡荊素、異牡荊素、蘆丁含量為考察指標(biāo)，采用綜合評(píng)分法[6]對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)及方差分析。詳見表2。

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，采用綜合評(píng)分法對(duì)試驗(yàn)進(jìn)行分析。評(píng)分時(shí)以各指標(biāo)的最大值為參照，將數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，再給出不同權(quán)重[5]。設(shè)總權(quán)重系數(shù)為1.00，牡荊素（m1）、異牡荊素（m2）、蘆?。╩3）分別占總系數(shù)的 1／3。綜合評(píng)分 ＝（1／3）m1／m1max＋（1／3）m2／m2max＋（1／3）m3／m3max。綜合評(píng)分越高，代表指標(biāo)成分提取越完全。評(píng)分結(jié)果見表3。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

由表4可見，影響地 提取工藝的因素依次為液料比＞甲醇濃度＞超聲時(shí)間＞超聲功率，極顯著性影響因素為超聲時(shí)間、甲醇濃度和液料比，顯著性影響因素為超聲功率。在此試驗(yàn)條件下，得最佳提取工藝為A2B1C2D2，即超聲功率為140 W，加入40倍80%甲醇超聲處理35 min。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表

表3 L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

表5 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（mg／g）

2.3 工藝驗(yàn)證

取地 藥材粉末3份，每份約0.5 g，精密稱定，加入20 mL的80%甲醇，140 W超聲處理35 min。按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定牡荊素、異牡荊素、蘆丁的含量，結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 正交試驗(yàn)驗(yàn)證

本研究中以牡荊素、異牡荊素、蘆丁的含量為考察指標(biāo)，分析超聲時(shí)間、超聲功率、甲醇濃度、液料比對(duì)指標(biāo)成分含量的影響，得最佳提取工藝組合為A2B1C2D2，即加入40倍80%甲醇，在140 W功率條件下超聲處理35 min。4個(gè)因素對(duì)含量均有較大影響，差異有顯著性。通過驗(yàn)證試驗(yàn)表明，提取工藝的方法簡單可行，結(jié)果穩(wěn)定可靠。

3.2 成分選擇

考察指標(biāo)選擇牡荊素和異牡荊素，均為黃酮碳苷異構(gòu)體，均有顯著清除2－二苯基－1－苦肼基(DPPH)、抑制金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌及預(yù)防或治療乳腺癌、前列腺癌等藥理作用[6－7]；蘆丁為黃酮苷，在抗病毒、抗炎、抑制肝癌細(xì)胞生長等方面作用顯著[8－9]，是地

的有效成分。故選擇其作為地 質(zhì)量控制指標(biāo)。

3.3 試驗(yàn)條件選擇

預(yù)試驗(yàn)比較了超聲與回流的提取效率，發(fā)現(xiàn)兩者提取效率無顯著性差異，但超聲提取法有操作簡單、提取溫度低、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，故采用超聲提取法。曾選擇水、甲醇、乙醇作為提取溶劑，對(duì)地 進(jìn)行提取，結(jié)果表明80%甲醇對(duì)指標(biāo)成分的提取率最高，故選擇80%甲醇作為提取溶劑。曾采用PDA檢測(cè)器，于200～400 nm波長處對(duì)3種黃酮類成分進(jìn)行全波長掃描，蘆丁于354 nm波長處有最大吸收，且對(duì)牡荊素和異牡荊素吸收影響較小，故選擇354 nm作為檢測(cè)波長。

綜上所述，中藥具有多成分、多功效、多靶點(diǎn)等特點(diǎn)，這也決定了單一成分或指標(biāo)評(píng)價(jià)難以表達(dá)中藥的質(zhì)量[10]，本試驗(yàn)中采用適當(dāng)?shù)脑囼?yàn)方法和多指標(biāo)綜合評(píng)分方法，對(duì)地 藥材質(zhì)量進(jìn)行控制，可為建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

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Orthogonal Test for Optimization of Melastoma Dodecandrum Loureiro Extraction Process

Zhang Bo,Han Hongyuan,Wang Baoli,Li Tongtong,Lin Ruichao
(School of Chinese Pharmacy,Beijing University of Chinese Medicine· Chinese Medicine Quality Evaluation Center·Beijing Key Laboratory,Beijing,China 100102)

Objective To optimize an appropriate extracting technology to extract vitexin,isovitexin and rutin from Melastoma dodecandrum Loureiro.M ethods According the yield of vitexin,isovitexin and rutin,the L9(34)orthogonal experimental design was used to optimize the process with ultrasonic time,ultrasonic power,methanol concentration,solvent ratio of inspection,and the results were analyzed by multi－index comprehensive weighted score evaluation.Choose the optimal conditions,and HPLC method was verified.Results The best extraction process was with 140 W power,40 times of 80% methanol,and ultrasonic extraction of 35 min.Conclusion The experimental design is reasonable with good results of the experiment reproducibility,which can provide scientific basis for its quality control.Key words:Melastoma dodecandrum Loureiro;extraction process;orthogonal experiment;vitexin;isovitexin;rutin

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)05－0020－04

2017－01－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.05.005

張博(1992－)，女，在讀碩士研究生，主要從事重要質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與藥效學(xué)研究，（電子信箱）13521571837＠163.com。

林瑞超，教授，博士研究生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹兴幣c民族藥品質(zhì)評(píng)價(jià)，（電子信箱）linrch307＠sina.com。