張新峰，王 蕾，徐貴永，李 靜，胡 彬

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泰安市感染性腹瀉非傷寒沙門菌耐藥監(jiān)測及分型研究

張新峰1，王 蕾2，徐貴永3，李 靜3，胡 彬4

目的 分離鑒定泰安市腹瀉病沙門菌的血清型分布、耐藥性及PFGE分子分型和同源性特點。方法 對分離自泰安市腹瀉病人的糞便標(biāo)本中的31株沙門菌進(jìn)行生化鑒定和血清分型，采用微量肉湯稀釋法對其進(jìn)行16種抗生素敏感試驗，利用PFGE進(jìn)行分子分型及聚類分析。結(jié)果 31株沙門菌分屬于10種血清型，腸炎沙門菌占35.5%(11/31)為優(yōu)勢血清型；31株沙門菌對頭孢西丁和亞胺培南100%敏感，對磺胺異唑的耐藥率為77.42%(24/31)；31株沙門菌按照100%的相似度可分為17個PFGE型。結(jié)論 藥敏顯示所檢測樣本存在較為嚴(yán)重的多重耐藥性，腸炎沙門菌遺傳變異在該地區(qū)相對較為保守，且存在散發(fā)流行的可能，提示應(yīng)做好腸炎沙門菌傳染病的早期預(yù)警及防控。

腹瀉；沙門菌；血清型；耐藥；脈沖場凝膠電泳預(yù)警；防控

沙門菌廣泛存在于自然界，是一類危害人類和動物健康的重要病原菌，也是引起腹瀉的主要病原菌之一。為掌握泰安市沙門菌的流行和耐藥情況，依托“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”科技重大專項——腹瀉病癥候群監(jiān)測技術(shù)平臺項目，于2012—2015年從泰安市所轄4個縣市區(qū)哨點醫(yī)院收集的感染性腹瀉病例糞便標(biāo)本中分離沙門菌，進(jìn)行血清型研究和藥敏試驗，并用PFGE分型方法對流行菌株進(jìn)行分子分型，以揭示菌株之間的同源性。為控制沙門菌感染，指導(dǎo)臨床合理使用抗生素和防控食源疾病提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 標(biāo)本來自泰安市4個縣市區(qū)哨點醫(yī)院腸道門診。采集腹瀉病人糞便標(biāo)本于Cary-Blair運送培養(yǎng)基，4 h內(nèi)送到泰安市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行腸道致病菌分離，并對檢出的沙門菌進(jìn)行鑒定、血清學(xué)、耐藥性檢測脈沖場電泳分子分型溯源。

1.1.2 儀器與試劑 AS4德靈半自動生化分析儀，Thermo全自動藥敏分析儀，Bio-Rad脈沖場凝膠電泳儀，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)。Cary-Blair運送培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，SBG增菌液、營養(yǎng)瓊脂購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；SS瓊脂、麥康凱瓊脂為北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，革蘭氏陰性菌生化鑒定板(德靈公司)，沙門菌診斷血清購自泰國S&A公司；微量細(xì)菌定量(MIC)藥敏試劑盒購自天津金章科技發(fā)展有限公司；SeaKemGold瓊脂糖，10×TBE緩沖液購自美國Bio-Rad公司；SDS、蛋白酶K購自美國Sigma公司；限制性內(nèi)切酶XbaI購自大連寶生物；PFGE相對分子量標(biāo)準(zhǔn)用布倫登盧普沙門菌，H9812由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所提供。其它培養(yǎng)基均由北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。所有試劑、培養(yǎng)基均在有效期內(nèi)使用。

1.2 方法 依據(jù)國家科技重大專項課題《自然疫源性傳染病病原譜流行規(guī)律及變異研究》及其子課題《癥候群細(xì)菌學(xué)研究》中的腹瀉病癥候群監(jiān)測技術(shù)方案進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.2.1 沙門菌的分離鑒定和血清分型 使用AS4德靈半自動生化分析儀，參照WS 280-2008《傷寒和副傷寒診斷標(biāo)準(zhǔn)》[1]及GB 4789.4-2010《食品微生物學(xué)檢驗 沙門氏菌檢測》[2]進(jìn)行沙門菌的分離鑒定。血清分型方法按照泰國S&A公司提供的沙門菌血清診斷操作步驟進(jìn)行，根據(jù)Kauffmann-hite表確定沙門菌的血清型。

1.2.2 藥敏試驗 采用CLSI推薦的微量肉湯稀釋法[3]，參照CLSI微生物藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行結(jié)果判定，判斷結(jié)果分為敏感、中介和耐藥3種。依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(CLSI)推薦的抗菌藥物敏感性試驗執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)M100-S20，利用96孔板微量肉湯稀釋法對環(huán)丙沙星、鏈霉素、氨芐西林、氯霉素、磺胺異惡唑、復(fù)方新諾明、萘啶酸、阿莫西林-克拉維酸、頭孢曲松、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、阿奇霉素、四環(huán)素、頭孢西丁、頭孢吡肟、亞胺培南16種不同類別的常用抗生素進(jìn)行試驗及結(jié)果判讀，質(zhì)控菌株為大腸埃希氏菌ATCC25922(中國疾病預(yù)防控制中心傳染病所提供)。

1.2.3 PFGE分型 參照美國PulseNet PFGE標(biāo)準(zhǔn)化分型方法進(jìn)行。沙門菌經(jīng)瓊脂糖固定、裂解、洗滌后，包埋的DNA在37 ℃水浴中使用40U的XbaI酶切至少2 h。得到的DNA片段使用Chef Mapper 脈沖場凝膠電泳分型，電泳緩沖液為0.5×TBE，電泳時間為18.5 h，電泳溫度為14 ℃，脈沖時間為2.16～63.8 s。膠使用GelRed染色后成像。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 統(tǒng)計學(xué)處理用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。資料的描述主要使用率(%)，統(tǒng)計學(xué)分析采用卡方檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。PFGE成像結(jié)果使用BioNumerics 6.6軟件采用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，PFGE帶型之間的相似度采用Dice系數(shù)衡量，確定沙門菌的基因型和同源關(guān)系。

2 結(jié) 果

2.1 沙門菌的分離 2012—2015年期間，泰安市4個縣市區(qū)的監(jiān)測點共發(fā)現(xiàn)513例腹瀉患者，共檢出沙門菌31株，檢出率為6.04%。4個縣市區(qū)哨點醫(yī)院沙門氏菌檢出率分別為：泰山區(qū)4.69%(16/341)，岱岳區(qū)3.23%(2/62)，寧陽縣8.45%(6/71)，新泰市17.95%(7/35)。各縣市區(qū)哨點醫(yī)院的檢出率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.424，P=0.006)；另外，31例沙門氏菌感染者中年齡3歲以下的人群占54.84%(17/31)。

2.2 菌株的血清型分布 31株血清分為10個血清型，其中腸炎沙門菌共11株，占35.48%(表1)，為泰安市沙門菌的優(yōu)勢菌種；嬰兒沙門菌6株，鼠傷寒沙門菌5株，德爾卑沙門菌3株，都柏林沙門菌2株，其他血清型菌株包括法斯塔、加里瑪、羅安達(dá)、山夫登沙門氏菌各1株；各哨點醫(yī)院中，新泰市腸炎沙門菌5株(5/7)，寧陽縣鼠傷寒沙門菌3株(3/6)，泰山區(qū)嬰兒沙門菌4株(4/16)，血清型在各縣區(qū)哨點醫(yī)院的分布差異沒有統(tǒng)計學(xué)差異(表1)(P=0.129，95%CI=(0.011-0.247))。

表1 31株沙門氏菌各血清型的哨點醫(yī)院分布和構(gòu)成比(%)

Tab.1 Regional sentinel hospital distribution and constituent ratios (%) of different serotypes of 31 non-typhoidSalmonellaisolates

血清型Serotypes各地區(qū)哨點醫(yī)院分布Regionalsentinelhopitaldistribuion菌株數(shù)Isolates泰山區(qū)TaishanDistict新泰市XintaiCity寧陽縣NingyangCouny岱岳區(qū)DaiyueDistrict合計Total構(gòu)成比(%)Constituentratio(%)腸炎S．enteritidi45111135．48嬰兒S．infatis4110619．35鼠傷寒S．typhimuium0131516．13德爾卑S．drby3010412．90都柏林S．dulin200026．45其他?Others300039．68合計Total1676231100

*其他包括法斯塔、加里瑪、羅安達(dá)、山夫登沙門氏菌。

2.3 藥敏試驗 31株沙門菌全部對頭孢西丁和亞胺培南敏感(100%)，只有1株對慶大霉素耐藥，對磺胺異惡唑的耐藥率為77.42%(24/31)，對氨芐西林和萘啶酸的耐藥率為64.52%(20/31)，對鏈霉素和阿奇霉素的耐藥率為58.06%(18/31)，另外有1株嬰兒沙門菌對11種藥物耐藥，4株沙門菌對9種藥物耐藥，24株對3種及以上的藥物耐藥；泰山區(qū)16株沙門菌與其他地區(qū)15株沙門菌對磺胺異噁唑的耐藥率分別為37.5%(6/16)、86.67%(13/15)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)；對氨芐西林的耐藥率分別為56.25%(9/16)、100%(15/15)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.17)(表2)；另外除2012年菌株較少外，2013—2015年，菌株的抗生素耐藥性范圍不斷擴(kuò)大，多重耐藥情況比較嚴(yán)重(表3和圖2)。

圖1 2012-2015年泰安市31株沙門菌對16種抗生素的耐藥性分布Fig.1 Antibiotic resistance distribution of 31 Salmonella strains to 16 antibiotics in Tai’an City in different years between 2012 and 2015

2.4 PFGE分型 31株沙門菌按照100%的相似度可分為17個PFGE型，分別命名為P1-P17。其中優(yōu)勢菌P16型共7株，P14和P15型各3株，P1、P2、P3型各2株，其余10個型相互獨立。全部31株沙門菌的相似度均在56%～100%之間，根據(jù)帶型相似度≥85%歸為同一克隆系的原則(聚類)[5]，31株沙門菌可分為3組大的克隆系，其中克隆系Ⅰ共7株，克隆系Ⅱ共6株，克隆系Ⅲ共11株(圖2)。

圖2 泰安市31株沙門菌PFGE分型結(jié)果Fig.2 PFGE typing results among 31 strain of Salmonella in Tai’an City

表2 泰安市31株沙門菌對16種抗生素的藥敏結(jié)果分析(%)

表3 2012—2015年泰安市31株沙門菌對16種抗生素的耐藥譜分布(%)

Tab.3 Distribution of resistant spectrum of 31Salmonellaisolates to 16 antibiotics in Tai’an City，2012-2015

抗生素Antibiotics菌株數(shù)(%)2012年2013年2014年2015年環(huán)丙沙星Ciprofloxacin0(0)1(14．29)3(25)2(22．22)鏈霉素Streptomycn0(0)2(28．57)12(100)4(44．44)氨芐西林Ampicillin0(0)6(85．71)7(58．33)7(77．78)氯霉素Chloramghenicol0(0)2(28．57)5(41．67)3(33．33)磺胺異惡唑Sulfamethox?azole0(0)4(57．14)11(91．67)9(100)復(fù)方新諾明Sulfamethox?azole0(0)1(14．29)4(33．33)2(22．22)萘啶酸Nalidixicacid2(66．67)3(42．86)10(83．33)5(55．56)阿莫西林-克拉維酸鉀Amoxicillin?cla?vulanatepotas?siu0(0)2(28．57)2(16．67)7(77．78)頭孢曲松Ceftriaxon0(0)4(57．14)3(25)0(0)強(qiáng)力霉素Doxycyclin0(0)2(28．57)3(25)5(55．56)慶大霉素Gentamicin0(0)1(14．29)0(0)0(0)阿奇霉素Azithromycn2(66．67)4(57．14)10(83．33)0(0)四環(huán)素Tetracycline0(0)2(28．57)1(8．33)5(55．56)頭孢西丁Cefoxitin0(0)0(0)0(0)0(0)頭孢吡肟Cefepime0(0)3(42．86)0(0)0(0)亞胺培南Imipenem0(0)0(0)0(0)0(0)合計3(100)7(100)12(100)9(100)

3 討 論

沙門氏菌屬是一類危害人類和動物健康的重要致病菌，其血清型別繁多，抗原復(fù)雜，是引起腹瀉的主要病原菌之一。本次研究發(fā)現(xiàn)，泰安市沙門菌感染者主要以年齡<6歲的人群為主(58.06%)，尤其是年齡<2歲的嬰幼兒(51.61%)。原因是沙門菌感染的人群特征是學(xué)齡前兒童高發(fā)，特別是0～2歲的嬰幼兒占很大比例，可能因為自身免疫系統(tǒng)不完善而易感染[6]，或者兒童年幼尚未養(yǎng)成良好的衛(wèi)生習(xí)慣。另外新泰市哨點醫(yī)院腹瀉患者的沙門菌檢出率明顯高于其他縣市區(qū)，原因可能是哨點醫(yī)院的診斷標(biāo)準(zhǔn)不一，也可能是新泰市人民的飲食生活習(xí)慣等原因造成的。此外，糞便標(biāo)本的運輸途徑、儲存條件和檢測時間等因素也有可能造成不同哨點醫(yī)院沙門菌陽性標(biāo)本檢出率的不同[7]。

血清學(xué)分型是沙門菌的傳統(tǒng)分型方法，到目前為止已鑒定2 500多種[8-9]，血清型的正確鑒定對確定沙門菌病的感染源及控制減少發(fā)病率具有重要意義。本次研究發(fā)現(xiàn)泰安市沙門菌感染以腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型(35.48%)，其次是嬰兒沙門菌(19.35%)和鼠傷寒沙門菌(16.13%)。此結(jié)果和北京市的研究結(jié)果大體相似，都是以腸炎沙門菌為優(yōu)勢血清型[10]，但長沙市[11]、深圳市[12]、廣州市[13]的研究顯示，鼠傷寒沙門菌為優(yōu)勢血清型，和本文結(jié)果有一定差異性。沙門氏菌的血清型可能存在地域性分布差異，可能與南北方的氣候差異和居民的飲食習(xí)慣有關(guān)，也可能是本次研究樣本量較小的原因。另外，沙門菌的血清分型在泰安市各縣市區(qū)哨點醫(yī)院的分布差異沒有統(tǒng)計學(xué)差異，提示泰安市衛(wèi)生部門可以制定統(tǒng)一的沙門菌感染防控和治療的措施。

由于抗生素的廣泛使用和濫用導(dǎo)致包括沙門菌在內(nèi)的很多病原菌出現(xiàn)了多重耐藥性，且全球范圍內(nèi)沙門菌分離株的耐藥性在逐漸增強(qiáng)[14]。本次藥敏分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)泰安市31株沙門菌全部對頭孢西丁和亞胺培南100%敏感，對慶大霉素敏感率96.77%(30/31)，與侯君等[15]結(jié)果相似，對磺胺異惡唑的耐藥率為77.42%(24/31)，但存在較為嚴(yán)重的多重耐藥現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)1株嬰兒沙門菌對11種抗生素耐藥，另有24株(24/31)對3種及以上的抗生素耐藥；統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)泰山區(qū)部分藥物的耐藥性明顯低于其他縣市區(qū)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，泰山區(qū)是泰安市發(fā)展較為全面的地區(qū)，在醫(yī)療衛(wèi)生方面有突出成績，聚集了全市先進(jìn)的衛(wèi)生資源和優(yōu)秀醫(yī)療人才，其他縣市區(qū)應(yīng)學(xué)習(xí)泰山區(qū)的先進(jìn)檢驗，提高傳染病防治能力。

脈沖場凝膠電泳(PFGE)技術(shù)是由Schwartz和Cantor[16]提出，發(fā)展至今以其重復(fù)性好、分辨力強(qiáng)而被稱為細(xì)菌分子生物學(xué)分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[17]。PFGE結(jié)果可用于描述病原菌的遺傳特性，結(jié)合流行病學(xué)資料進(jìn)行疾病溯源，并為臨床診斷和治療提供分子生物學(xué)依據(jù)等[18]。本研究發(fā)現(xiàn)泰安市沙門菌的同源性較強(qiáng)，全部31株沙門菌的相似度均在56%～100%之間，且克隆系Ⅲ共11株。相似度在100%的3個條帶14TANY001、2014TA056和TADY16分別是寧陽2014年1月、7月和岱岳區(qū)2014年8月的病例，表明腸炎沙門菌在泰安存在散發(fā)流行的可能，且該流行株腸炎沙門菌遺傳變異在該地區(qū)較為保守，與林文娟等[6]報道的一致而與曲梅等[19]的結(jié)果相反。提示應(yīng)做好腸炎沙門菌傳染病的早期預(yù)警及防控。另外本研究PFGE型與血清型分析結(jié)果顯示，同一PFGE型可分為相同或不同的血清型，例如：14TANY001、2012046TA分別為腸炎和都柏林兩個血清型，此研究結(jié)果與長沙市[11]的研究結(jié)果相一致。但PFGE型與血清型和耐藥性之間的流行病學(xué)關(guān)系尚待進(jìn)一步研究。

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Hu Bin, Email：wubz9670@126.com

Drug resistance and molecular typing of nontyphoidSalmonellaof infectious diarrhea in Tai’an City, China

ZHANG Xin-feng1, WANG Lei2, XU Gui-yong3, LI Jing3, HU Bin4

(1.Tai’anCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000，China; 2.LaiwulenterforDiseaseControlandPrevention,Laiwu271000,China； 3.TaishanDistrictCenterforDiseaseControlandPrevention,Tai’an271000，China; 4.ShandongCenterforDiseaseControlandPrevention,Jinan250000，China)

We investigated the serotype, drug resistance features, molecular types, and homology ofSalmonellain diarrhea in Tai’an City, and provided scientific evidences for warning, control and clinical treatment. The 31Salmonellastrains isolated from stool specimens of diarrhea in Tai’an were identified by serotyping. Broth dilution technique was used to test the sensitivity of 31 strains ofSalmonellato 16 antibiotics. Pulsed field gel-electrophoresis (PFGE) was used for molecular typing and cluster analysis. Results showed that 31 strains ofSalmonellawere divided into 10 kinds of serotype.S.enteritidis(11/31) was the predominant serotype. All 31 strains ofSalmonellawere sensitive to cefoxitin and imipenem. The drug resistance rates of the 31 strains ofSalmonellawere 77.42 % (24/31) to sulfafurazole. The 31 strains ofSalmonellawere divided into 17 patterns by PFGE, with 100% similarity for each pattern. All the results suggest that there are more serious problems in multiple drug resistance. The genetic variation ofS.enteritidisis relatively conservative. Early warning and control onS.enteritidisare exposed to reinforce.

diarrhea;Salmonella; serotype; drug resistance; PFGE; early warning; control

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.04.009

國家科技重大專項課題(No.2012ZX10004-201-002)資助

胡 彬，Email：wubz9670@126.com

1.山東省泰安市疾病預(yù)防控制中心，泰安 271000； 2.萊蕪市疾病預(yù)防控制中心，萊蕪 271000； 3.泰安市泰山區(qū)疾病預(yù)防控制中心，泰安 271000； 4.山東省疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250000

Supported by the National Major Science and Technology Project ( No.2012ZX10004-201-002)

R378.2

A

1002-2694(2017)04-0337-06

2016-08-16 編輯：李友松