周 容，周莉莉，鐘思雨，袁 禮，周 瑋，李 朝，夏新華*（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的制備工藝研究

周 容，周莉莉，鐘思雨，袁 禮，周 瑋，李 朝，夏新華*
（湖南中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，湖南 長沙 410208）

目的 制備甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體。方法 采用化學(xué)合成甘珀酸十八醇酯(18-GA-Suc)作為兩親性導(dǎo)向分子，從穩(wěn)定性、包封率等方面考察制備甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的最佳方法，單因素和正交試驗優(yōu)選甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的處方和工藝。結(jié)果 根據(jù)優(yōu)化工藝制備的甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體外觀為乳白色，帶有淡藍色乳光，無絮凝現(xiàn)象，包封率為41.75%。結(jié)論 甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體制備成功,并以包封率為指標對其制備工藝進行優(yōu)化，可為其肝靶向研究奠定基礎(chǔ)，有望成為肝腫瘤靶向的新型載體。

甘草次酸；黃芩苷；脂質(zhì)體

黃芩苷是從唇形科植物黃芩中分離的一種黃酮類化合物，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種生物活性[1]。黃芩苷及其制劑存在口服吸收差、生物利用度低、水溶性及脂溶性差、體內(nèi)半衰期短等不足，限制了黃芩苷類制劑在臨床上的應(yīng)用。

脂質(zhì)體近年來廣泛用作抗癌藥物的載體，能提高藥物的生物利用度，降低藥物毒性，靶向釋藥。已有研究證實，肝細胞膜上存在大量的甘草次酸（GA）特異性結(jié)合位點，該位點能與GA特異性結(jié)合，通過肝細胞內(nèi)吞作用，可將其配體運送至溶酶體內(nèi)進行降解[2]。以該受體為靶點，可將藥物特異性導(dǎo)入治療乙型肝炎和原發(fā)性肝癌。文獻表明，甘草次酸修飾的脂質(zhì)體具有更好的肝靶向性[3]。本研究以甘草次酸為原料，合成甘珀酸十八醇酯（18-GA-Suc）作為兩親性導(dǎo)向分子修飾黃芩苷脂質(zhì)體[4]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相系統(tǒng) (美國安捷倫公司)；色譜柱 Kromasil C18柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 （鞏義市予華有限公司）；TE-214S分析天平 (北京賽多利斯天平有限公)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Zetasizer 3000HSA型粒徑分析儀 （英國Malvern）；JEM-1200EX電子顯微鏡（日本電子株式會社）。

1.2 藥品與試劑

黃芩苷（質(zhì)量分數(shù)93.3%，批號110715-201318，中國食品藥品檢定研究院）；大豆磷脂Lipoid S PC-3（德國Lipoid公司）；膽固醇（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；葡聚糖凝膠G-50（美國GE公司）；磷酸鹽緩沖劑（粉劑，0.01 M，pH 7.4，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；甘草次酸（新疆天山制藥有限公司）；N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、N,N-二環(huán)己基碳酰亞胺（DCC）（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；4-二甲氨基吡啶（DMAP）（上海展方化工有限公司）；石油醚（60～90℃）、乙酸乙酯（成都市科龍化工試劑廠）；甲醇（色譜純，美國Spectrum公司）；無水乙醇、甲醇（分析純，湖南匯虹試劑有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 導(dǎo)向分子18-GA-Suc的制備

2.1.1 甘草次酸十八醇酯（18-GA）的制備 取甘草次酸1.0 g溶于20 mL DMF中，加入DCC 0.44 g、硬脂醇0.75 g以及DMAP 0.26 g，80℃水浴加熱2 h至反應(yīng)完全，將反應(yīng)液緩緩滴入水中，產(chǎn)生沉淀，抽濾，得淡黃色固體，55℃干燥即得。對產(chǎn)物過柱純化并進行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)有 [M-1]-m/z=721的峰存在，即目標產(chǎn)物18-GA的分子離子峰。

2.1.2 18-GA-Suc的制備 取18-GA 0.5 g，加10 mL吡啶溶解，加入DMAP 0.25 g、丁二酸酐0.5 g，116℃油浴下加熱反應(yīng)12 h，往反應(yīng)液中加少許水，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去吡啶，得褐色固體。對產(chǎn)物過柱純化并進行質(zhì)譜鑒定，有[M-1]-m/z=821強峰存在，可以證明為目標產(chǎn)物18-GA-Suc。

2.2 黃芩苷含量及包封率的測定

2.2.1 色譜條件[5]Kromasil C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm,5 μm），流動相甲醇-0.2%磷酸水（47∶53），流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30℃。

2.2.2 標準曲線的建立 對照品溶液的配制：分別配置濃度為 0.003 04、0.006 08、0.015 2、0.030 4、0.045 6、0.060 8 mg/mL的系列對照品溶液，以峰面積對濃度進行線性回歸，得到標準曲線回歸方程Y= 3×107X-12 189（r=0.999 5），結(jié)果表明黃芩苷在0.03 04～0.608 μg與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.2.3 精密度試驗 取5.598、11.196、55.98 μg/mL 3個高、中、低濃度的黃芩苷溶液，按“2.2.1”色譜條件測定，一日內(nèi)各進樣5次，計算日內(nèi)精密度；連續(xù)5 d各濃度重復(fù)測定5次，計算日間精密度。結(jié)果表明，日內(nèi)、日間相對標準偏差均小于2.0%。

2.2.4 洗脫曲線的繪制 精密吸取脂質(zhì)體樣品0.25 mL，加于Sephadex G-50凝膠柱頂部（直徑1.5 cm，柱床高25 cm），以純水洗脫，洗脫流速0.5 mL/min。每2 mL洗脫液為一管，收集洗脫液，分別用色譜甲醇破膜，超聲使其澄清后，HPLC進樣分析，測定每管樣品中黃芩苷的含量。以洗脫體積為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制洗脫曲線，脂質(zhì)體與藥物的洗脫峰有明顯的分界，可實現(xiàn)良好的分離,見圖1。

圖1 黃芩苷脂質(zhì)體葡聚糖凝膠G-50純水洗脫曲線

2.2.5 柱回收率 配制低、中、高三種不同濃度的黃芩苷甲醇溶液，分別加入空白脂質(zhì)體混合均勻，得標準混合液，精密吸取混合液0.5 mL上柱，按以上洗脫條件進行分離，收集洗脫液，過0.45 μm微孔濾膜，HPLC進樣分析，測定藥物的濃度，計算柱回收率，結(jié)果見表1。

2.2.6 上樣量 精密吸取黃芩苷脂質(zhì)體溶液，分別上柱1.0、0.5、0.25 mL，用純水以0.5 mL/min流速進行洗脫，其他操作同上“洗脫方法”。以脂質(zhì)體與游離藥物的分離效果、包封率為評價指標進行比較，結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，上樣量為0.25 mL時，脂質(zhì)體與游離藥物分離良好。

2.2.7 包封率的測定 精密吸取脂質(zhì)體樣品0.25 mL，加于Sephadex G-50凝膠柱頂部（直徑1.5 cm，柱床高25 cm），以純水洗脫，洗脫流速0.5 mL/min。每2 mL洗脫液為一管，收集脂質(zhì)體流出液，用色譜甲醇破膜，超聲使其澄清后，過0.45 μm微孔濾膜，HPLC進樣分析。計算包封率。

表1 黃芩苷溶液的柱回收率 （n=3）

表2 不同上樣量的比較

包封率=系統(tǒng)中包封的藥量/系統(tǒng)中包封與未包封的總藥量×100%

2.3 脂質(zhì)體制備方法的研究

2.3.1 乙醇注入法 精密稱取磷脂∶膽固醇（4∶1）、黃芩苷、10%的甘草次酸配體，按一定比例溶于無水乙醇中（45℃水浴加熱），所得的類脂溶液用細孔徑注射器緩慢勻速地注入到恒溫55℃ pH 7.0的30 mL磷酸鹽緩沖液中，注入過程中用磁力攪拌器攪拌，通氮氣除去乙醇，繼續(xù)攪拌30 min，45℃孵育20 min，冰浴超聲8 min，過0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.2 薄膜分散法[6]精密稱取磷脂、膽固醇、10%的甘草次酸配體，按一定比例，加三氯甲烷30 mL充分溶解，55℃減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，形成均勻脂質(zhì)膜，再按磷脂：黃芩苷（10∶1）取適量黃芩苷，溶于30 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，加入脂質(zhì)膜中進行洗膜，55℃水化1 h，超聲30 min，過0.45、0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3.3 兩種制備方法的比較 按“2.3.1”及“2.3.2”方法制備脂質(zhì)體，觀察外觀性狀、測定包封率、粒徑、Zeta電位，薄膜分散法粒徑較乙醇注入法小，且分布更均勻，包封率更高，且Zeta電位絕對值更大，因此確定用薄膜分散法制備黃芩苷脂質(zhì)體。結(jié)果見表3。

表3 兩種黃芩苷脂質(zhì)體制備方法的比較

2.4 處方及制備工藝單因素考察

2.4.1 溶劑的選擇 薄膜分散法中所用溶劑為三氯甲烷，但三氯甲烷毒性大，因此對比考察二氯甲烷、三氯甲烷作為有機溶劑對類脂膜形成的影響。結(jié)果表明，二氯甲烷作為溶劑時所形成的脂質(zhì)膜有很多氣泡且不均勻，而三氯甲烷作為有機溶劑時所形成的類脂膜薄而均勻，因此確定三氯甲烷作為有機溶劑。

2.4.2 水相的選擇 按“2.3.2”項下條件制備均勻脂質(zhì)膜，再按一定比例取適量黃芩苷，溶于三種水相中（pH 6.0、pH 6.8、pH 7.0的PBS緩沖液），其余操作同“2.3.2”項下。比較三種水相制得的脂質(zhì)體外觀，測定其包封率，結(jié)果見圖2。以pH 6.8的PBS緩沖液制備的脂質(zhì)體包封率最佳。

圖2 不同pH值的水相對包封率的影響

2.4.3 藥量 固定磷脂、膽固醇、黃芩苷、甘草次酸配體的比例，分別稱取黃芩苷5、8、10、15、20 mg，其余操作同“2.3.2”項下，比較不同黃芩苷用量所制得的脂質(zhì)體的外觀，測定其包封率，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，黃芩苷用量為10 mg時，所制備的脂質(zhì)體包封率最好。

2.4.4 膽脂比 固定磷脂、黃芩苷、甘草次酸配體的比例，分別取膽脂比1∶10、1∶4、1∶2.5的膽固醇量，其余操作同“2.3.2”項，比較不同膽脂比所制得的脂質(zhì)體的外觀，測定其包封率，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，膽脂比為1∶4時，所制備的脂質(zhì)體包封率最好。

2.4.5 水化時間 按“2.2.2項”下條件制備脂質(zhì)體后，55℃分別水化30 min、1 h、2 h，其余操作同“2.2.2”項，考察不同水化時間對包封率的影響，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，當(dāng)水化時間為1 h，脂質(zhì)體包封率最佳。

圖3 不同藥量對包封率的影響

圖4 不同膽固醇量對包封率的影響

圖5 不同水化時間對包封率的影響

2.5 處方的正交優(yōu)選

在單因素考察的基礎(chǔ)上，結(jié)合文獻，采用正交試驗優(yōu)選黃芩苷肝靶向脂質(zhì)體處方。固定18-GA-Suc的比例為混合類脂的10%，選擇藥物與磷脂的質(zhì)量比（A）、磷脂與膽固醇的質(zhì)量比（B）、水合時間（C）三個主要因素為變量，各因素分別設(shè)3個水平，進行正交設(shè)計，以包封率為評價指標篩選處方。用L9(34)正交表安排試驗方案，所選因素水平見表4，試驗結(jié)果見表5。

從表6的結(jié)果可知，包封率的影響因素大小為A＞B＞C，最佳組合為A2B2C3，即藥物與磷脂的質(zhì)量比為1∶10，磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4∶1，水化時間90 min。按照以上優(yōu)選的條件制備3批脂質(zhì)體樣品，每批樣品測定3次，以驗證處方的穩(wěn)定性，驗證結(jié)果見表7。

表4 正交試驗因素水平表

表5 正交試驗結(jié)果

表6 正交試驗方差分析表

表7 驗證試驗結(jié)果 （±s，n=3）

表7 驗證試驗結(jié)果 （±s，n=3）

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驗證結(jié)果表明，按最佳處方制備的3批樣品總平均包封率為41.75%，RSD為1.94%。說明基于正交設(shè)計優(yōu)化的參數(shù)準確可靠，工藝合理可行。

黃芩苷肝靶向脂質(zhì)體的制備工藝為：精密稱取一定量的磷脂∶膽固醇 （4∶1）、10%的甘草次酸配體，加三氯甲烷30 mL充分溶解，55℃減壓蒸發(fā)除去有機溶劑，形成均勻脂質(zhì)膜，再按磷脂∶黃芩苷（10∶1）取適量黃芩苷，溶于30 mL pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，加入脂質(zhì)膜中進行洗膜，55℃水化90 min，超聲30 min，過0.45 μm微孔濾膜，即得，產(chǎn)品冷藏保存。

3 討論

3.1 肝靶向材料的合成

甘草次酸與硬脂醇反應(yīng)生成18-GA-Suc的過程為成酯反應(yīng)，該反應(yīng)是可逆反應(yīng)，反應(yīng)過程中需嚴格保持容器及溶劑無水。文獻報道的第一步反應(yīng)產(chǎn)物處理方法為旋蒸除去溶劑，但DMF沸點較高，一般旋蒸蒸發(fā)難以除去。根據(jù)反應(yīng)產(chǎn)物不溶于水而DMF與水互溶的特點，將反應(yīng)液倒入水中，再抽濾即可得到反應(yīng)產(chǎn)物。這樣可以簡化反應(yīng)過程。第二步反應(yīng)中所用溶劑為吡啶，反應(yīng)結(jié)束要除去吡啶需較高溫度且所需時間較長，故采用少許水與吡啶形成共沸物再減壓除去，可縮短旋蒸時間。

3.2 脂質(zhì)體包封率的測定

脂質(zhì)體的包封率是脂質(zhì)體質(zhì)量控制的一個重要指標，選擇合適的測定方法是脂質(zhì)體制備前的一項重要考察內(nèi)容。采用葡聚糖凝膠柱層析法測定包封率時，通常是收集未被脂質(zhì)體包封的游離藥物來進行測定。本實驗過程中發(fā)現(xiàn)，被包封的脂質(zhì)體在16～40 mL便可被洗脫出來，且肉眼可直觀判斷脂質(zhì)體的流出過程，因此最后確定收集包封的脂質(zhì)體部分來測定包封率，既節(jié)省測定所需時間，也更加簡便節(jié)約。

本實驗中所制備的修飾脂質(zhì)體包封率較低，其原因可能有:a脂質(zhì)體的穩(wěn)定性差，藥物在過柱過程中發(fā)生了泄漏；b脂質(zhì)體粒徑較大，容易沉降聚集，導(dǎo)致在過柱時被截留在凝膠柱頂端。

3.3 脂質(zhì)體的制備

脂質(zhì)體的制備方法很多，不同藥物的理化性質(zhì)有差異，采用的制備方法也不同。脂質(zhì)體的內(nèi)水相可以包封水溶性藥物，外層的雙層膜可包封脂溶性藥物，首先應(yīng)對藥物的性質(zhì)有充分的了解。

脂質(zhì)體制備的關(guān)鍵在于磷脂的水化及藥物的包載，根據(jù)藥物包載的機制不同，通?？煞譃楸粍虞d藥和主動載藥兩類。被動載藥即先將藥物溶于水相或有機相中，然后采用注入法、分散法、蒸發(fā)法等制備方法得到含藥脂質(zhì)體。主動載藥法是通過內(nèi)外水相的不同離子或化合物梯度進行載藥。由于黃芩苷在水及有機溶劑中的溶解性均不好，因此不能直接采用被動載藥法[7]，需通過磷酸鹽緩沖液增強黃芩苷在水溶液中的溶解性，使黃芩苷成為“水溶性”好的藥物，因此本試驗選用薄膜分散法，制得的脂質(zhì)體粒徑分布均勻，且操作工藝簡單。

[1]辛文妤,宋俊科,何國榮,等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展[J].中國新藥雜志,2013,21(6):647-653,659.

[2]ShojiS,Kunio T,Shingo S,etal.Chemicalmodification of gly-cyrrhetinic acid in relation to the biological activities [J].Chem Pharm-bull,1987,35(5):1910-1918.

[3]栗 婕,柯 學(xué).甘草次酸修飾多西紫杉醇脂質(zhì)體的制備和體外抑瘤效果[J].藥學(xué)與臨床研究,2011,19(3):207-210.

[4]毛聲俊,侯世祥,金 輝,等.肝細胞靶向甘草次酸表面修飾脂質(zhì)體的制備[J].中國中藥雜志,2003,28(4):328-331.

[5]李 朝,夏新華,周 宇,等.黃芩苷的處方前研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2016,36(7):51-54.

[6]齊 濱,李 然,劉 莉，等.薄膜分散法制備RGD脂質(zhì)體[J].長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報,2008,24(2):155-156.

[7]高媛媛,張維農(nóng).脂質(zhì)體的制備與檢測方法研究進展[J].武漢工業(yè)學(xué)院學(xué)報,2010,29(3):44-52.

（本文編輯 蘇 維）

The Study on Preparation of Baicalin Liposomes Modified by Glycyrrhetinic Acid

ZHOU Rong,ZHOU Lili,ZHONG Siyu,YUAN Li,ZHOU Wei,LI Chao,XIA Xinhua*
(School of Pharmacy,Hunan University of Chinese Medicine,Changsha,Hunan 410208,China)

Objective To prepare baicalin liposomes modified with glycyrrhetinic acid.Methods The carbenoxolone eighteen alcohol ester（18-GA-Suc）by chemical synthesis method was as amphiphilic guidance molecule.The optimal method was investigated from its stability,encapsulation efficiency.The single factor and orthogonal test was used to optimize the prescription and process.Results According to the optimized process,the appearance of the baicalin liposomes modified by the glycyrrhetinic acid was milky white,with pale blue light and no flocculation,and the encapsulation efficiency was for 41.75%.Conclusion The preparation technology of baicalin was successfully prepared,and the process was optimized by the index of encapsulation efficiency,which could provide the basis for liver targeted research.

glycyrrhetinic acid;baicalin;liposomes

R283

A

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.04.007

2016-07-30

湖南省“十二五”中藥學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目（湘教通[2011]76號）;2016年湖南省創(chuàng)新課題（CX2016B346）。

周 容，女，在讀碩士研究生，研究方向:中藥新制劑及制劑質(zhì)量標準。

*夏新華，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，E-mail：xiaxinhua001@163.com。

本文引用：周 容，周莉莉，鐘思雨，袁 禮，周 瑋，李 朝，夏新華.甘草次酸修飾的黃芩苷脂質(zhì)體的制備工藝研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（4）：373-377.