蘇薈娟，趙旭東，張麗，樊雯潔，王愈聰，賈紅霞

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

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一種新型的焦磷酸根可視化檢測方法

蘇薈娟，趙旭東，張麗，樊雯潔，王愈聰，賈紅霞

(河北大學(xué) 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002)

焦磷酸根(PPi)在生命體系和環(huán)境體系中都占有重要的地位，利用Cu2+誘導(dǎo)CdTe量子點(diǎn)產(chǎn)生熒光譜帶紅移的現(xiàn)象和PPi對(duì)銅離子的配位作用，建立了一種新型的PPi可視化檢測方法.結(jié)果表明，PPi在5～50μmol/L的濃度內(nèi)可通過CdTe量子點(diǎn)熒光顏色的變化進(jìn)行可視化檢測，其他陰離子對(duì)PPi測定均無干擾.此外，利用該方法對(duì)焦磷酸酶的活性進(jìn)行了檢測，初步取得了滿意的結(jié)果，說明本文所建立的方法可以用于PPi相關(guān)物質(zhì)的檢測.

焦磷酸根；CdTe量子點(diǎn)；Cu2+；可視化

焦磷酸鹽(pyrophosphate,PPi)廣泛參與生物體的新陳代謝和能量傳遞，如細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷水解[1]和核酸復(fù)制等[2-3]，在生命過程中起著非常重要的作用.研究發(fā)現(xiàn)，PPi的含量跟許多疾病有密切關(guān)聯(lián)，比如癌癥[4]、關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈中層硬化等[5-6].此外，PPi還廣泛應(yīng)用于日常生產(chǎn)生活中，比如毛紡業(yè)、造紙業(yè)和食品業(yè)等.因此，選擇性識(shí)別并檢測PPi對(duì)于生命科學(xué)、疾病診斷、食品安全及環(huán)境監(jiān)測等方面都具有重要的意義，該方面的工作成為了近年來的研究熱點(diǎn).

目前，PPi的檢測方法主要有酶法[7]、比色法[8]、色譜法[9]和熒光法[3]等，其中熒光法因操作簡單和靈敏度高成為了近年來最熱門的方法之一.利用熒光法測定PPi主要是基于PPi與Zn2+、Cu2+、Fe3+、Ce3+和Eu3+等特定的金屬離子之間的強(qiáng)配位作用引起熒光探針信號(hào)的變化而進(jìn)行的，因此熒光探針的設(shè)計(jì)非常重要.當(dāng)前熒光探針的類型主要有3種，包括有機(jī)金屬離子配合物[10]、熒光共軛聚合物[11]及量子點(diǎn)[12].以有機(jī)金屬離子配合物作為探針的方法只能在極性有機(jī)溶劑中才能夠發(fā)揮較好的作用，而且在靈敏度和選擇性方面，結(jié)果并不盡如人意[13-18].熒光共軛聚合物是一類水溶性的聚合物，因其結(jié)構(gòu)特殊而具有熒光放大作用，常用來作為生物檢測體系中的傳感原件，跟有機(jī)金屬離子配合物相比，該探針對(duì)PPi檢測更靈敏，具有更好的選擇性，但該探針合成比較復(fù)雜，不利于進(jìn)一步推廣使用.量子點(diǎn)是一種半導(dǎo)體的納米晶體，具有stokes位移大、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、熒光量子產(chǎn)率高和生物兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域[19].目前利用量子點(diǎn)作為熒光探針的PPi檢測方法主要是通過金屬離子對(duì)量子點(diǎn)的猝滅作用及PPi對(duì)金屬離子的絡(luò)合從而使量子點(diǎn)熒光恢復(fù)進(jìn)行的，然而眾所周知，可以猝滅量子點(diǎn)的金屬離子有很多[20-29]，而且一些共存基質(zhì)也會(huì)影響量子點(diǎn)的熒光，因此該方法雖然靈敏度較高，但容易受到外界因素的干擾，導(dǎo)致選擇性大大降低.

近期本課題組研究建立了一種基于Cu2+被還原為Cu+，進(jìn)而誘導(dǎo)CdTe量子點(diǎn)(CdTe QDs)熒光譜帶紅移的Cu2+的可視化檢測方法，這種方法不受其他猝滅離子的干擾，在選擇性方面具有明顯的優(yōu)勢[30].另外有文獻(xiàn)報(bào)道指出PPi與Cu2+結(jié)合之后，可有效阻止Cu2+被還原為Cu+[31].受上述二者的研究成果的啟發(fā)，提出了一種新型的PPi檢測方案.首先，當(dāng)Cu2+與巰基乙酸修飾的綠色CdTe QDs共存時(shí)，由于巰基乙酸的還原作用，Cu2+被還原為Cu+，誘導(dǎo)CdTe QDs產(chǎn)生熒光光譜的紅移，同時(shí)其熒光顏色由綠色變?yōu)榧t色.當(dāng)PPi存在時(shí)，由于PPi對(duì)銅離子的保護(hù)作用，抑制了CdTe QDs熒光光譜的紅移，同時(shí)其熒光顏色為綠色，由此實(shí)現(xiàn)了PPi的可視化檢測.該方法簡單、省時(shí)、成本低，不需要大型的儀器即可實(shí)現(xiàn)PPi的裸眼檢測，為焦磷酸的檢測尤其是野外現(xiàn)場作業(yè)提供了一種新的途徑.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：HORIBA○RFL3-211型熒光分析儀(美國)；GL-9406型手提式紫外燈(海門市)；CHB-100型恒溫金屬浴(杭州)；Canon IXUS230HS數(shù)碼相機(jī)(北京)；ME104E型電子天平(上海)；ZHWY-103D型恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海).

試劑：焦磷酸酶(購于Sigma-Aldrich，中國)；巰基乙酸(購于Fluka，中國)；抗壞血酸(AscorbicAcid,C6H8O6，Vc)、五水合硫酸銅(CuSO4·5H2O)、焦磷酸鈉(Na4P2O7)、磷酸鈉(Na3PO4)、磷酸一氫鈉(Na2HPO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、硫酸鈉(Na2SO4)、碳酸鈉(Na2CO3)、硝酸鈉(NaNO3)、氟化鈉(NaF)、氯化鈉(NaCl)、溴化鈉(NaBr)、碘化鈉(NaI)均為分析純；實(shí)驗(yàn)中所用的水均為二次去離子水.

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1CdTeQDs的制備

CdTeQDs按照文獻(xiàn)[32-33]制備，具體步驟如下：首先將0.280 8gCdCl2和120μL巰基乙酸(Thioglycolicacid,TGA)溶解于180mL超純水中，用NaOH調(diào)節(jié)pH值為12，待用.然后取12mL超純水于3口燒瓶中，將燒瓶置于冰水浴，通氮?dú)獬?，并在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入0.030 0g碲粉和0.108 0g硼氫化鈉，磁力攪拌下反應(yīng)8h，得到碲氫化鈉，往其中滴加1mol/L硫酸溶液22.5mL，產(chǎn)生H2Te氣體，該氣體隨氮?dú)庖黄鹜ㄈ霚?zhǔn)備好的CdCl2溶液中，形成CdTe前驅(qū)體，繼續(xù)加熱回流2h，得到巰基乙酸修飾的綠色量子點(diǎn).將制備好的CdTe量子點(diǎn)置于日光燈下照射8d，以增強(qiáng)其熒光強(qiáng)度，然后避光保存，備用.

1.2.2PPi的測定

本實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系的終體積為100μL，其中包含10mmol/LpH7.0HEPES、10μmol/LCu2+、100μmol/LVc、5μLCdTeQDs和一定濃度的PPi，將該體系置于60 ℃恒溫金屬浴下反應(yīng)30min.反應(yīng)結(jié)束后將樣品冷卻至室溫，用FL3-211熒光光譜儀掃描樣品的發(fā)射光譜，測量參數(shù)：激發(fā)波長為365nm，激發(fā)和發(fā)射的狹縫寬度均為2 nm，掃描的波長為450～700 nm.然后在手提式紫外燈(波長為365 nm)的照射下觀察溶液的顏色變化，并使用數(shù)碼相機(jī)照相.為保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中所有的數(shù)據(jù)均平行測定3次.

圖1 焦磷酸根(PPi)可視化檢測原理Fig.1 Schematic illustration of the visual detection of PPi

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)原理

本實(shí)驗(yàn)的原理如圖1所示，當(dāng)Cu2+和CdTe QDs混合之后，由于本實(shí)驗(yàn)所使用的QDs表面為TGA，因此Cu2+被TGA還原為Cu+，Cu+誘導(dǎo)CdTe QDs的發(fā)射峰產(chǎn)生紅移，并引起其激發(fā)光照射下熒光顏色從綠色變?yōu)榧t色，這一點(diǎn)在筆者前期的研究工作中已有證明[30].當(dāng)PPi加入到上述體系時(shí)，由于PPi對(duì)Cu2+強(qiáng)烈的配位作用有效地阻止了Cu2+的還原，Cu+的生成量減小，CdTe QDs發(fā)射峰的紅移減弱，溶液從之前的紅色逐漸恢復(fù)為綠色.在紫外燈照射下，裸眼即可從顏色變化分辨出PPi的含量，并且利用PPi加入前后CdTe QDs的發(fā)射峰位移差和PPi的含量的關(guān)系可定量的檢測PPi.另外為了實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象更加明顯，在體系中加入一定量的Vc，并且加熱到60 ℃，以增強(qiáng)Cu2+的還原.

為了證明方案的可行性，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了初步的驗(yàn)證(圖2).為了更直觀地反映譜峰的變化情況，文中對(duì)每個(gè)譜圖以最大發(fā)射波長處的熒光強(qiáng)度做了歸一化處理.圖2A中曲線a為CdTe QDs的熒光發(fā)射譜圖，λem為534 nm，對(duì)應(yīng)圖2B中a，可以看出此時(shí)溶液的熒光顏色為綠色；曲線b為加入100 μmol/L Vc后CdTe QDs的熒光發(fā)射譜圖，該譜圖幾乎與單一CdTe QDs的譜圖重合，對(duì)應(yīng)的熒光顏色照片為B圖中的b，說明Vc對(duì)CdTe QDs的熒光發(fā)射無影響；曲線c為加入100 μmol/L Vc 和10 μmol/L Cu2+后CdTe QDs的熒光發(fā)射譜圖，λem為587 nm，可以看出CdTe QDs的熒光譜峰發(fā)生了明顯的紅移，對(duì)應(yīng)的熒光顏色照片為B圖中的c，此時(shí)溶液的熒光顏色為紅色；曲線d為加入100 μmol/L Vc 、10 μmol/L Cu2+與100 μmol/L PPi后CdTe QDs的熒光峰，λem為560 nm，相比未加入PPi的光譜圖c，譜峰紅移明顯減小，對(duì)應(yīng)的熒光顏色為B圖中的d，此時(shí)顯示為綠色.以上結(jié)果可以說明，在PPi加入前后，反應(yīng)體系的顏色從明顯的紅色變?yōu)榫G色，最大發(fā)射波長從587 nm藍(lán)移為560 nm，因此，可以根據(jù)CdTe QDs的熒光顏色和最大發(fā)射波長的變化與PPi的含量建立一定的關(guān)系，實(shí)現(xiàn)PPi檢測.同時(shí)也證明，在不需要大型儀器的情況下，通過一臺(tái)簡易便捷的手提式紫外燈即可實(shí)現(xiàn)PPi的可視化檢測.

a.CdTe QDs；b.CdTe QDs+100 μmol/L Vc；c.CdTe QDs+100 μmol/L Vc+10 μmol/L Cu2+；d.CdTe QDs+100 μmol/L Vc+10 μmol/L Cu2++100 μmol/L PPi.圖2 不同體系中CdTe QDs的熒光光譜歸一化圖(A)及照片(B)Fig.2 Normalized fluorescence emission spectra(A)and photos(B)of the QDs mixed with different reagent

2.2 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

為了使方法發(fā)揮更好的性能，對(duì)實(shí)驗(yàn)中涉及到的關(guān)鍵步驟進(jìn)行了優(yōu)化.首先是Cu2+濃度的優(yōu)化.本實(shí)驗(yàn)建立在Cu2+誘導(dǎo)CdTeQDs熒光發(fā)射峰紅移和PPi通過配位作用減弱這種紅移效應(yīng)的基礎(chǔ)上，如果Cu2+濃度太小，CdTeQDs譜峰紅移小，在PPi作用下該峰的藍(lán)移空間就小，影響PPi的線性范圍，如果Cu2+濃度太大，則會(huì)影響PPi的檢測靈敏度，因此合理的Cu2+濃度非常重要.以不加入PPi的體系作為空白，以不同Cu2+濃度下空白和樣品的最大發(fā)射波長差值(Δλ)作為條件篩選的依據(jù)，結(jié)果如圖3A所示.從圖3A可以看出，隨著Cu2+濃度的增加，Δλ呈先增加后減小的趨勢，在Cu2+濃度為10μmol/L時(shí)達(dá)到了最大值，因此選擇10μmol/L為最佳Cu2+濃度.

接下來優(yōu)化了PPi與Cu2+結(jié)合時(shí)間.PPi與Cu2+是否結(jié)合完全，直接影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性.結(jié)果表明，PPi與Cu2+結(jié)合不論時(shí)間長短，Δλ基本不變，說明PPi與Cu2+絡(luò)合速度很快，不需要單獨(dú)把PPi和Cu2+提前反應(yīng)，直接加到總反應(yīng)體系中即可.

對(duì)總體系的反應(yīng)溫度進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果如圖3B.從圖3B可以看出，隨著溫度的增加，Δλ呈先顯著增加后降低的趨勢，這主要是由于溫度增加有利于銅離子的還原，但當(dāng)溫度大于60 ℃時(shí)，PPi會(huì)發(fā)生分解反應(yīng)，因此導(dǎo)致信號(hào)降低.最終選擇最佳反應(yīng)溫度為60 ℃.

實(shí)驗(yàn)條件：A.30 min,60 ℃,PPi:100 μmol/L,Vc:100 μmol/L；B.30 min,Cu2+:10 μmol/L,PPi:100 μmol/L,Vc:100 μmol/L.圖3 Cu2+濃度(A)和反應(yīng)溫度(B)的影響Fig.3 Effect of the Cu2+ concentration(A)and the incubation temperature(B)

2.3 線性范圍及方法評(píng)價(jià)

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，考察了本方法對(duì)PPi的分析性能，結(jié)果如圖4所示.圖4A為不同PPi濃度下CdTe QDs的熒光光譜歸一化圖.從圖4A可以看出，隨著PPi濃度的增加，CdTe QDs的熒光譜峰逐漸藍(lán)移.圖4B為紫外燈照射下與圖4A相對(duì)應(yīng)的溶液的顏色，可以看出，隨著PPi濃度的增加，溶液從紅色變?yōu)辄S色直至綠色，顏色對(duì)比非常明顯，可以通過肉眼的觀察，實(shí)現(xiàn)PPi的可視化檢測，需要重點(diǎn)指出的是，該檢測無需大型儀器，只需要30 min的反應(yīng)時(shí)間和一臺(tái)手提式的紫外燈即可完成，為PPi的現(xiàn)場檢測或者家庭檢測提供了可能.圖5為Δλ與PPi濃度的線性關(guān)系圖，可以看出在5 μmol/L到50 μmol/L的范圍內(nèi)，PPi的濃度與Δλ成良好的線性關(guān)系，線性方程為Δλ=0.384 6ρ(PPi)+3.166，其中R2=0.955 7.

為了更好地評(píng)價(jià)本文提出的方案，表1中列舉了近幾年利用熒光法進(jìn)行PPi檢測的方法，與本文方法進(jìn)行比較.目前熒光法檢測PPi主要是采用熒光聚合物、有機(jī)金屬配合物及熒光納米粒子作為探針.從表中可以看出，在檢測靈敏度和線性范圍方面，本方法處于中間水平；但在可視化檢測方面，本方法優(yōu)點(diǎn)較為突出.表中方法一大部分不能實(shí)現(xiàn)直接裸眼可視化，需要復(fù)雜昂貴的儀器才能夠達(dá)到檢測PPi的目的，另外有2種可以實(shí)現(xiàn)可視化的方法均以熒光聚合物為探針，眾所周知，熒光聚合物的合成和純化比較復(fù)雜，而本文使用量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了從紅色到黃色到綠色的可視化效果，顏色對(duì)比明顯，而且水相量子點(diǎn)的制備相對(duì)簡單，不需要復(fù)雜的純化過程.因此，綜合考慮上述2方面的因素，本文提出的方案在目前熒光法檢測PPi的眾多方法中具有明顯的優(yōu)勢.

實(shí)驗(yàn)條件：30 min，60 ℃，Vc:100 μmol/L，Cu2+:10 μmol/L.從a到j(luò)，PPi濃度依次為0,2,5 10,20,30,40,50,100,200 μmol/L.圖4 不同濃度的PPi下QDs熒光光譜歸一化圖(A)和熒光照片(B)Fig.4 Normalized fluorescence emission spectra(A)and photos(B)of the QDs treated with different concentration of PPi

Δλ為空白和樣品溶液的最大發(fā)射波長之差；實(shí)驗(yàn)條件：30 min；60 ℃；Vc:100 μmol/L；Cu2+:10 μmol/L.圖5 標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Relationship between Δλ and the PPi concentration

定量依據(jù)傳感器材料線性范圍/(μmol·L-1)是否可視化顏色變化情況文獻(xiàn)熒光強(qiáng)度熒光聚合物1.5～9 否無色→橙色[34]熒光強(qiáng)度熒光聚合物2～20 是綠色→深藍(lán)色[35]熒光強(qiáng)度熒光共軛聚合物2～10 是藍(lán)色→綠色[36]熒光強(qiáng)度金納米簇0.16～78.1否-[37]熒光強(qiáng)度金屬配合物和有機(jī)染料50～450 否-[38]熒光強(qiáng)度有機(jī)金屬離子配合物1～50 否-[13]熒光強(qiáng)度量子點(diǎn)0.5～10 否-[39]熒光譜帶移動(dòng)量子點(diǎn)5～50 是紅→橙→綠本方法

2.4 特異性

實(shí)驗(yàn)條件：30 min；60 ℃；Vc:100 μmol/L；Cu2+:10 μmol/L；PPi及干擾離子：50 μmol/L.圖6 CdTe QDs和Cu2+的混合物在PPi或其他干擾離子作用下的熒光光譜歸一化圖(A)及熒光照片(B)Fig.6 Normalized fluorescence emission spectra(A)and photos(B)of CdTe QDs/ Cu2+ mixture afterincubation with PPi or different interfering ions

2.5 焦磷酸酶活性的檢測

焦磷酸酶(pyrophosphatase,PPase)是一種以PPi為底物的水解酶，可催化PPi水解為磷酸，廣泛存在于生物體中，跟生命過程中的糖代謝、脂代謝等直接相關(guān)，因此PPase活性的檢測也是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一.在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用PPase對(duì)PPi的水解作用，設(shè)計(jì)了一種PPase活性的測定方法.當(dāng)PPase不存在時(shí)，PPi有效地保護(hù)了Cu2+，使Cu2+誘導(dǎo)之后的CdTe QDs譜峰藍(lán)移，溶液顏色為綠色，當(dāng)PPase存在時(shí)，PPi在其催化作用下水解為磷酸根，在特異性考察實(shí)驗(yàn)中已經(jīng)證明磷酸根對(duì)Cu2+沒有保護(hù)作用，此時(shí)譜峰相對(duì)于上述光譜圖，發(fā)生紅移，結(jié)果如圖7所示.從圖7可以看出，隨著PPase加入量的增加，譜峰逐漸紅移，相應(yīng)的反應(yīng)體系在紫外燈下的顏色由綠色變?yōu)辄S色，證明這種方法可以用于PPase活性的測定，另外也說明該方法在PPi相關(guān)物質(zhì)的檢測中具有很好的潛力.

實(shí)驗(yàn)條件：30 min；60 ℃；Vc:100 μmol/L；Cu2+:10 μmol/L；PPi:100 μmol/L.圖7 焦磷酸酶活性檢測的熒光光譜歸一化圖(A)和可視化照片(B)Fig.7 Normalized fluorescence emission spectra(A)and photos(B)for the PPase activity detection

3 結(jié)論

本文利用Cu2+誘導(dǎo)CdTe QDs熒光譜峰位移和PPi與Cu2+的配位作用，建立了一種可視化檢測PPi的新方法.該方法實(shí)驗(yàn)過程只需要一步，使用30 min即可完成，并且利用便捷的手提式紫外燈即可實(shí)現(xiàn)PPi的裸眼檢測，省時(shí)，方便，無需復(fù)雜的前處理步驟和昂貴的儀器，特異性良好，并可拓展應(yīng)用于PPase活性的檢測，在貧困地區(qū)、野外或家庭等不具備或者不方便使用大型儀器的場合中具有很好的發(fā)展前景.

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(責(zé)任編輯：梁俊紅)

A new method for visual detection of pyrophosphate

SU Huijuan,ZHAO Xudong,ZHANG Li,FAN Wenjie,WANG Yucong,JIA Hongxia

(College of Chemistry and Environmental Science,Hebei University,Baoding 071002,China)

Pyrophosphate(PPi)plays an important role in the biological and environmental systems.Therefore,a simple,rapid,high sensitivity determination of the pyrophosphate is of great significance.A new colorimetric strategy for the visual detection of pyrophosphate by the naked eye under the irradiation of a UV lamp was developed on the basis of Cu2+-induced fluorescence band shift of CdTe quantum dots(QDs)and the strong interaction between PPi and Cu2+. PPi can be visually detected in the range of 5 μmol/L to 50 μmol/L.Furthermore,this method was of good specificity and it also can be used for the detection of the pyrophosphatase activity.

pyrophosphate；CdTe quantum dots；Cu2+；visual detection

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.007

2016-11-21

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(B2015201130);河北大學(xué)2016校級(jí)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)計(jì)劃項(xiàng)目(149)

蘇薈娟(1992—)，女，河北邢臺(tái)人,河北大學(xué)在讀碩士研究生,主要從事發(fā)光材料在生物分子上的應(yīng)用研究. E-mail：suhuijuan2016@163.com

王愈聰(1979—)，女，山西河曲人，河北大學(xué)副教授，博士，主要從事生物功能材料的制備及應(yīng)用研究. E-mail：15931795521@163.com 賈紅霞(1980—)，女，河北宣化人，河北大學(xué)講師，博士，主要從事生化分析及光譜分析研究. E-mail：jia123renren@126.com

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1000-1565(2017)02-0147-08