武金霞，范君姣，趙敬敬，張賀迎

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.河北大學 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002)

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苯酚污染對蚯蚓抗氧化酶系活性及同工酶組分的影響

武金霞1，范君姣1，趙敬敬1，張賀迎2

(1.河北大學 生命科學學院，河北 保定 071002；2.河北大學 生物技術(shù)研究中心，河北 保定 071002)

采用濾紙接觸法，研究了不同質(zhì)量濃度、不同時間苯酚污染脅迫對赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性及同工酶組分的影響，為研究酚類化合物對土壤污染的生物學診斷和風險評價提供科學依據(jù).結(jié)果表明，苯酚對蚯蚓SOD、POD和CAT活性及同工酶組分具有顯著的影響，不同質(zhì)量濃度苯酚可顯著提高蚯蚓CAT活力，改變蚯蚓SOD、POD同工酶組分，低質(zhì)量濃度苯酚可提高蚯蚓SOD和POD活力，高質(zhì)量濃度則會降低其活力.

苯酚；蚯蚓；超氧化物歧化酶(SOD)；過氧化物酶(POD)；過氧化氫酶(CAT)

酚類化合物是一類使用范圍極其廣泛的有機物[1-3],但是，一些高毒性酚類化合物如苯酚的使用會污染到土壤及環(huán)境，威脅到生態(tài)環(huán)境及人類健康[4].苯酚已被多個國家納入重點控制污染物名單[5-6]，因此對其污染檢測非常重要.

蚯蚓是典型的土壤動物，其數(shù)量占土壤動物生物量的60%～80%[7]，其體內(nèi)組織可以富集許多殺蟲劑和重金屬，因而常被用來監(jiān)測和評價土壤污染狀況[8-9].蚯蚓體內(nèi)的SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性經(jīng)常會受到環(huán)境健康狀況的影響，成為生態(tài)毒理學研究的熱點[10-11].目前關(guān)于蚯蚓抗氧化酶系的研究中，對農(nóng)藥、金屬離子研究的報道較多[12-14]，少見酚類化合物對其影響的報道，且多數(shù)只是研究污染物對蚯蚓抗氧化酶系活力的影響[15-17]，鮮有對其同工酶組分變化的研究.因此本實驗以苯酚為污染物，研究其對蚯蚓抗氧化酶系活性及同工酶組分的影響，為蚯蚓在土壤污染生態(tài)評估中的應用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試蚯蚓

赤子愛勝蚓(Eiseniafoetida)，購自天津某蚯蚓養(yǎng)殖公司.馴化后選取成熟健壯、體重200～300 mg的蚯蚓作為實驗材料.

1.1.2 主要試劑

磷酸鹽緩沖液， Tris-HCl 緩沖液，5.68 g/L的鄰苯三酚，50 g/L的 Vc，2 g /L的H2O2，2 g/L的愈創(chuàng)木酚，8.6 g/L的生理鹽水.

1.1.3 主要儀器

分光光度計(721，上海舜宇恒平科學儀器有限公司)；超高速冷凍離心機(GL-22LM，湖南星科科學儀器有限公司)；電子天平(FA2004，上海儀器儀表廠)；光照培養(yǎng)箱(LRH-250-G，廣東省醫(yī)療器械廠).

1.2 實驗方法

1.2.1 蚯蚓清腸

將濾紙用蒸餾水浸濕，鋪在平皿底部，將待試蚯蚓用蒸餾水沖洗干凈，放在平皿中，封口并扎孔，暗處放置24h后用蒸餾水沖洗干凈，用濾紙吸干體表水分[18].

1.2.2 蚯蚓染毒

參考國際標準方法組織草案(OECD-1984Earthwormacutetoxicitytests.ChemicalTestingGuideline207)指南，采用濾紙接觸法對蚯蚓進行染毒.根據(jù)預實驗確定的毒物質(zhì)量濃度，配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/L的苯酚溶液.取不同質(zhì)量濃度的苯酚溶液各4mL，倒入平皿中，使濾紙濕潤均勻，用保鮮膜將培養(yǎng)皿封口，在陰暗處平衡2h.取已清腸、生長狀況相似的10條蚯蚓用蒸餾水沖洗干凈，吸干體表水分，放入已加入苯酚溶液的培養(yǎng)皿中，封口并扎孔，(20±1)℃避光培養(yǎng)，每個處理質(zhì)量濃度做3個平行實驗.對照組以蒸餾水代替苯酚溶液進行同樣的處理.

1.2.3 蚯蚓抗氧化酶活性測定

粗酶液制備:在實驗進行的第24、48、72h將每一個平皿內(nèi)的蚯蚓在蒸餾水中浸泡洗凈，吸干水分，剪成小段，在研缽中加1g蚯蚓小段及3mL磷酸鹽緩沖液，再加入適量石英砂，研磨至勻漿，4 ℃環(huán)境下將勻漿離心20min(10 000r/min)，最終得到的上清液即粗酶液.每個處理質(zhì)量濃度共得3管粗酶液[18].

酶活性測定：SOD活性測定參考Marklund等[19]的方法，一個活性單位為抑制鄰苯三酚自氧化率達到一半所需要的酶量.POD活性測定參考Kochba等[20]的方法，一個活性單位為每min每mg組織蛋白470nm處吸光度值升高0.01需要的酶量.CAT活性測定參考Song等[21]、張麗娜[22]的紫外吸收法，一個活性單位為每minH2O2240nm處吸光值下降0.1需要的酶量.蛋白含量采用Folin-酚法測定.

1.2.4 同工酶條帶分析

SOD和POD同工酶檢測參考王蘭[23]、武金霞[24]等人的方法，CAT同工酶檢測配制分離膠時添加膠液總體積0.3%的可溶性淀粉.

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)利用Excel2003及SPSS13.0軟件進行分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 苯酚對蚯蚓SOD活性及組分的影響

由圖1可以看出，隨著苯酚質(zhì)量濃度的升高，蚯蚓的SOD活力先增強后減弱，隨處理時間的延長，SOD活力逐漸下降.0.2g/L苯酚處理24h時，蚯蚓SOD活力達到最高112U/mL，表明在0.2g/L苯酚處理24h時，蚯蚓體內(nèi)清除自由基的能力最強，反應了機體對輕度氧化脅迫的適應性，之后隨著處理質(zhì)量濃度的不斷增大及處理時間的不斷延長，蚯蚓SOD活性下降，表現(xiàn)出明顯的抑制效應，當污染物質(zhì)量濃度過高或污染時間過長時，超出蚯蚓自身修復范圍，最終受到活性氧的損害，反應了蚯蚓自身修復系統(tǒng)的局限性.曹佳等[25]研究異噁草酮對蚯蚓抗氧化酶影響時發(fā)現(xiàn)，隨著污染物質(zhì)量濃度的升高，蚯蚓SOD活性先升高后降低，與本實驗結(jié)果有相似之處.

由圖2可以看出，低質(zhì)量濃度、短時間苯酚處理組均有2條酶帶，遷移率較小的條帶記為SOD1，遷移率較大的記為SOD2.由圖2b可以看出，在處理第48h時，隨著苯酚質(zhì)量濃度的升高，酶帶先變亮后變暗，說明SOD活性隨苯酚質(zhì)量濃度的上升先增強后減弱，與圖1的結(jié)果一致.48h及72h0.5g/L苯酚處理組只有SOD1顯示活性.而當污染物質(zhì)量濃度高或污染時間較長時，會抑制SOD酶活力，甚至導致酶帶消失.

不同小寫字母表示不同處理的顯著性差異(P<0.05)，下同.圖1 不同處理下蚯蚓的SOD活力Fig.1 Activity of SOD enzyme of earthworm under different treatments

處理時間分別為a.24 h;b.48 h;c.72 h.泳道由左到右依次為對照、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L組.圖2 不同處理下蚯蚓的SOD同工酶組分Fig.2 SOD isozymes composts of earthworm under different treatments

2.2 苯酚對蚯蚓POD活性的影響

圖3說明，同一時間處理下，蚯蚓的POD活性隨著苯酚質(zhì)量濃度的上升，呈先上升后下降的變化規(guī)律，Liu[26]等人研究佳樂麝香對蚯蚓影響時發(fā)現(xiàn)，當佳樂麝香質(zhì)量濃度為0.015 7 μg/ mL時， POD活性出現(xiàn)最高值，之后開始下降，與本結(jié)果相似.而當苯酚質(zhì)量濃度為0.4、0.5 g/L時，隨著時間延長蚯蚓POD活力呈上升趨勢，在0.3 g/L苯酚處理72 h時，POD活力最高，為21.63 U/mg.這說明，少量的苯酚可誘導機體產(chǎn)生更多的POD來抵抗這種環(huán)境脅迫，而當有機物的刺激強度超過一定閾值時，就會對體內(nèi)POD造成中毒性損害，蚯蚓POD活力隨苯酚污染時間延長而升高則反映了機體利用自身修復系統(tǒng)來抵御污染物的脅迫.

從圖4可以看出，對照組有2條酶帶(POD1和POD2)，苯酚處理時，蚯蚓POD1條帶消失；隨苯酚質(zhì)量濃度的升高，24 h處理組中，POD2活性先降低后升高，48 h處理組的POD活性則先升高后降低，72 h處理組的POD活性逐漸降低，與圖3結(jié)果有明顯區(qū)別，說明通過同工酶法測定酶活性有一定的局限性.同時，本實驗結(jié)果說明，蚯蚓體內(nèi)POD1對苯酚比較敏感，較低質(zhì)量濃度就會導致其失活，POD2在抵御苯酚污染脅迫時起主要作用.整個過程中既有POD同工酶組成的變化也有各成分相對活性的變化，說明蚯蚓可以通過這種調(diào)整，減少污染物對自身系統(tǒng)帶來的損害.

圖3 不同處理下蚯蚓的POD活力Fig.3 Activity of POD enzyme of earthworm under different treatments

處理時間分別為a.24 h;b.48 h;c.72 h.泳道由左到右依次為對照、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L組.圖4 不同處理下蚯蚓POD同工酶組分Fig.4 POD isozymes composts of earthworm under different treatments

2.3 苯酚對蚯蚓CAT活性的影響

由圖5可見，除0.5 g/L苯酚處理24 h外，其他處理組CAT活性均高于對照組，說明苯酚對蚯蚓CAT具有誘導作用.而且這種誘導效應隨著時間的延長逐漸加強，隨著處理質(zhì)量濃度的升高先增強后減弱.這說明，在本次實驗劑量范圍內(nèi)，苯酚的存在使蚯蚓CAT活性提高，從而減少過多的H2O2對蚯蚓機體造成的損傷，這是生物應激性的體現(xiàn).

從圖6可以看出，所有處理組都只有1條CAT酶帶，且隨著苯酚質(zhì)量濃度的升高，CAT酶帶變亮，活性升高，圖5及圖6說明，苯酚對蚯蚓CAT酶活性具有激活作用，與曹佳等[26]的結(jié)論一致，說明與 SOD、 POD相比， CAT對苯酚的耐受能力較高.

圖5 不同處理下蚯蚓的CAT活力Fig.5 Activity of CAT enzyme of earthworm under different treatments

處理時間分別為a.24 h;b.48 h;c.72 h.泳道由左到右依次為對照、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L組.圖6 不同處理下蚯蚓CAT同工酶組分Fig.6 CAT isozymes composts of earthworm under different treatments

3 結(jié)論

1) 低質(zhì)量濃度、短時間苯酚污染可以提高蚯蚓SOD活力，高質(zhì)量濃度長時間污染則會降低其活力.

2) 蚯蚓的POD酶活性隨著苯酚質(zhì)量濃度的上升，先上升后下降，其同工酶組分也會受苯酚污染的影響，POD1對苯酚比較敏感，較低質(zhì)量濃度就會導致其失活.

3)苯酚對蚯蚓CAT活性有顯著的激活作用，這種激活作用隨著苯酚質(zhì)量濃度的加大先強后弱.

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(責任編輯：趙藏賞)

Effect of phenol on antioxidant enzymes activity and isozymes composition ofEiseniafoetida

WU Jinxia1,FAN Junjiao1,ZHAO Jingjing1,ZHANG Heying2

(1.College of Life Sciences,Hebei University,Baoding 071002,China;2.Research Center for Biotechnology,Hebei University,Baoding 071002,China)

The filter paper contacting test was conducted to detect the activity and isozymes composition of SOD,POD and CAT ofEiseniafoetidaexposured with phenol,to provide scientific basis for biological diagnosis and risk assessment of soil pollution by phenol compounds.The results suggested that the CAT activity was activated markedly at different concentrations；the SOD and POD isozymes composition was changed; the SOD and POD activity were induced prominently at low concentration but inhibited at high concentration.

phenol；earthworm；SOD；POD；CAT

10.3969/j.issn.1000-1565.2017.02.008

2016-06-30

河北省生物工程重點學科資助項目(1050-5030023)

武金霞(1966—)，女，河北保定人，河北大學教授，博士，主要從事生化藥物及基因工程藥物研究. E-mail：wjx6@163.com

張賀迎(1966—)，男，河北大城人，河北大學副研究員，主要從事生化藥物及基因工程藥物研究. E-mail：z660128@163.com

X835

A

1000-1565(2017)02-0155-06