黃招琴，蘇壬香，鐘貝芬，韓慧敏，谷陟欣，顏冬蘭，辛 秀，袁 莉，胡 翔,

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蛋白質(zhì)化學(xué)與基因調(diào)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國 長沙 410081;2.九芝堂股份有限公司博士后工作站，中國 長沙 410205)

卡介菌多糖核酸對(duì)CIK細(xì)胞活性的影響

黃招琴1，蘇壬香1，鐘貝芬1，韓慧敏2，谷陟欣2，顏冬蘭2，辛 秀2，袁 莉2，胡 翔1,2

(1.湖南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蛋白質(zhì)化學(xué)與基因調(diào)控教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國 長沙 410081;2.九芝堂股份有限公司博士后工作站，中國 長沙 410205)

在CIK細(xì)胞的培養(yǎng)過程中加入卡介菌多糖核酸，研究其對(duì)CIK細(xì)胞體外增殖及殺瘤活性等方面的影響.CCK-8檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)低濃度卡介菌多糖核酸處理的CIK細(xì)胞相比對(duì)照組(生理鹽水)，細(xì)胞增殖能力和殺瘤效果都顯著上調(diào).RT-qPCR結(jié)果顯示卡介菌多糖核酸處理后的CIK細(xì)胞毒活性相關(guān)因子(Granzyme B, IFN-γ, TNF-α和TNF-β)mRNA的表達(dá)相比對(duì)照組都有提高.這些結(jié)果可為培養(yǎng)具有更高效殺瘤活性又能大量擴(kuò)增的CIK細(xì)胞提供新思路.

卡介菌多糖核酸；CIK；細(xì)胞增值；殺瘤活性

惡性腫瘤嚴(yán)重危害人類健康，目前常規(guī)的手術(shù)和放化療治療方法均不能徹底清除體內(nèi)的瘤細(xì)胞，過繼免疫治療法因具有符合生理、低毒和高效等優(yōu)點(diǎn)成為重要的腫瘤輔助治療手段[1].其中，細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞(cytokine-induced killer cells, CIK細(xì)胞)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種非常有前景的過繼免疫細(xì)胞，具有增殖迅速、殺瘤活性廣譜且高效、毒副作用微小等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為腫瘤免疫治療領(lǐng)域的一種新選擇[2-4].CIK是以CD3+CD56+T細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群，兼有 NK 細(xì)胞和 T 細(xì)胞的特征.在功能上，CIK 一方面擁有 T 淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗腫瘤活性，另一方面還擁有 NK 細(xì)胞非 MHC 限制性的殺傷腫瘤的特點(diǎn)，其增殖迅速、對(duì)正常造血影響輕微[5].CIK細(xì)胞的增殖和細(xì)胞毒活性依賴于多種外源性細(xì)胞因子的刺激，但何種因子組合為最佳尚無定論，因此研究如何進(jìn)一步提高CIK的增殖和殺瘤活性已經(jīng)成為抗腫瘤的過繼免疫細(xì)胞生物治療的一個(gè)熱點(diǎn)[6].卡介菌多糖核酸(BCG polysaecharide and nucleis acid，BCG-PSN)是在卡介苗的基礎(chǔ)上，通過熱酚法提取卡介菌中的多糖、核酸，混合而制成的免疫活性物質(zhì)，是我國首創(chuàng)的具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的新型免疫調(diào)節(jié)劑[7-8].BCG-PSN 能誘導(dǎo)多種免疫細(xì)胞的活化，調(diào)節(jié)多種細(xì)胞因子的分泌，可作為一種較好的腫瘤輔助治療手段[9].由于卡介菌多糖核酸能提高機(jī)體免疫力并且輔助提高腫瘤治療效果，同時(shí)CIK細(xì)胞亦是腫瘤過繼免疫治療的有效方法，且國內(nèi)外還沒有BCG-PSN聯(lián)合CIK進(jìn)行研究的相關(guān)報(bào)道，因此本課題將兩者結(jié)合起來研究.為研究卡介菌多糖核酸的生物活性及藥理作用，在CIK細(xì)胞的培養(yǎng)過程中加入卡介菌多糖核酸，研究其對(duì)CIK細(xì)胞的體外增殖及對(duì)肝癌細(xì)胞的毒活性(殺瘤活性)方面的影響，并且探討其對(duì)CIK細(xì)胞毒活性相關(guān)因子表達(dá)的影響.

1. 材料與方法

1.1 材料

淋巴細(xì)胞分離自健康志愿者外周血.SMMC-7721肝癌細(xì)胞系于上海中科院購買，本實(shí)驗(yàn)室長期保存.斯奇康卡介菌多糖核酸注射液(1 mL/支)購自湖南九芝堂制藥公司.人血液淋巴細(xì)胞分離液購自佳和生物.采血針、采血管、生理鹽水購自長沙市第四人民醫(yī)院.人源CD3單抗購自北京同立源生物科技有限公司，人白介素(IL-2)買自江蘇金絲利藥業(yè)有限公司.DMEM培養(yǎng)液、RPMI-1640和GT-T551培養(yǎng)液，以及胎牛血清均為美國Gibco公司產(chǎn)品.青霉素-鏈霉素溶液產(chǎn)自碧云天.

1.2 方法

1.2.1 CIK細(xì)胞分離及原代培養(yǎng) 采集健康志愿者血液20 mL，平衡溫度至室溫.取50 mL離心管若干，將血樣轉(zhuǎn)移至離心管，用生理鹽水稀釋至30 mL，充分吹打均勻.將稀釋后的血樣緩緩加入另一管裝有15 mL 淋巴細(xì)胞分離液的上方，形成上下兩相.22 ℃，390 g離心30 min(加速1，剎車0).離心后血漿層與分離液之間有白膜層可見，分別收集上層血漿和中間白膜層至新的離心管.于收集白膜層的離心管中加入RPMI-1640至45 mL，混勻，22 ℃，1 000 g離心10 min(加速9，剎車9).重復(fù)上一步驟兩次，離心速度分別改為400 g和201 g，最后一次離心之前取20 μL混勻的細(xì)胞懸液進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，參照《細(xì)胞計(jì)數(shù)SOP》.離心后重懸細(xì)胞，按細(xì)胞數(shù)5×106個(gè)/mL加含有500 μg/L CD3 mAB, 1 000 U/mL IL-2和10%FBS的GT-T551培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)成CIK細(xì)胞.

1.2.2 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng) 在37 ℃，5%CO2及90%相對(duì)濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中用DMEM完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清和100 mg/L青-鏈霉素溶液)培養(yǎng)SMMC-7721細(xì)胞.

1.2.3 CCK-8 檢測細(xì)胞增殖活力 將培養(yǎng)7 d的CIK細(xì)胞數(shù)調(diào)整至2×106個(gè)/mL，于96 孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液50 μL，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，對(duì)照組為生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)組分為5組，分別加入卡介菌多糖核酸終濃度為1，10，50，100，200 mL/L的培養(yǎng)基各50 μL，每個(gè)濃度4個(gè)平行對(duì)照孔，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理細(xì)胞72 h，加入10 μL CCK-8溶液，4 h 后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測OD450值A(chǔ)(吸光度的大小與活細(xì)胞的數(shù)量呈正比).并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.以BCG-PSN 濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，作細(xì)胞增殖曲線.

1.2.4 腫瘤殺傷實(shí)驗(yàn) 將培養(yǎng)9 d的CIK細(xì)胞均分為兩組，分別為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，對(duì)照組為生理鹽水組，實(shí)驗(yàn)組為培養(yǎng)基終濃度為10 mL/L的卡介菌多糖核酸，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中處理細(xì)胞72 h(至12 d).另外，在CIK細(xì)胞培養(yǎng)11 d時(shí)，將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期的SMMC-7721細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL，于96孔板中鋪板每孔100 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.CIK培養(yǎng)至第12天進(jìn)行CIK殺傷腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，棄去SMMC-7721舊的培養(yǎng)液，分別按n(效應(yīng)細(xì)胞)/n(靶細(xì)胞)為5∶1,10∶1和20∶1調(diào)整兩組CIK細(xì)胞至相應(yīng)數(shù)目加入SMMC-7721細(xì)胞孔中，每個(gè)比例3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)設(shè)單獨(dú)靶細(xì)胞和單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照組，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h. 4 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀測定OD450值A(chǔ).計(jì)算殺傷率：殺傷率(%)=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值-單獨(dú)效應(yīng)細(xì)胞組A值)/單獨(dú)靶細(xì)胞組A值]×100%.

1.2.5 細(xì)胞總RNA的提取及cDNA的合成

(1)卡介菌多糖核酸處理CIK細(xì)胞:調(diào)整培養(yǎng)至第9天的CIK細(xì)胞數(shù)目至2×106個(gè)/mL，于6 孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入細(xì)胞懸液1 mL，設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入卡介菌多糖核酸終濃度為10 mL/L的培養(yǎng)基1 mL，對(duì)照組加入生理鹽水，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h.

(2)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄:按TRIZOL法提取CIK細(xì)胞總RNA，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA.

1.2.6 實(shí)時(shí)定量PCR

(1)引物的設(shè)計(jì)與合成:根據(jù)GenBank中基因的序列，查找文獻(xiàn)并用Primer Primer 5 軟件設(shè)計(jì)CIK相關(guān)毒活性因子Granzyme B，TNF-α，TNF-β，IFN-γ，Actin(內(nèi)參)基因引物(見表1).將設(shè)計(jì)好的目的引物序列發(fā)給上海生工公司合成.

表1 PCR所用引物

(2)引物驗(yàn)證：引物合成后，加入滅菌水溶解至10 μmol/L.先做一個(gè)普通PCR檢測引物是否能克隆出目的片段，PCR反應(yīng)體系如表2，按照體積從大到小加溶液至總體積為20 μL.

表2 PCR反應(yīng)體系

PCR體系加完后用槍輕輕混勻，放入PCR儀擴(kuò)增片段.擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，重復(fù)29個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸5 min.用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR反應(yīng)完成后產(chǎn)物.

(3)熒光定量PCR:反應(yīng)體系見表3，共30 μL,具體操作按照Takara SYBR RT-qPCR產(chǎn)品說明書進(jìn)行.

表3 熒光定量PCR體系

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件及Graphpad軟件進(jìn)行方差及顯著性分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)(P)設(shè)為0.05.

2 結(jié)果與分析

2.1 CIK細(xì)胞形態(tài)觀察

CIK細(xì)胞即細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞，它是從人血液分離出來的單核淋巴細(xì)胞經(jīng)IL-2和CD3單抗等細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的以CD3+CD56+T細(xì)胞為主的異質(zhì)細(xì)胞群.CIK是一種懸浮細(xì)胞，相比癌細(xì)胞其體積較小.經(jīng)過適應(yīng)期的CIK細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量對(duì)數(shù)生長且會(huì)形成細(xì)胞球，細(xì)胞體積在7～12 d時(shí)有所增大，之后幾乎不變.圖1是顯微鏡下不同時(shí)期的CIK細(xì)胞形態(tài)，A～D分別對(duì)應(yīng)從人血中分離后培養(yǎng)至1，4，7，11 d的CIK細(xì)胞.

圖1 不同時(shí)期的CIK細(xì)胞圖片F(xiàn)ig.1 Images of CIK cells in different growth period

2.2 卡介菌多糖核酸對(duì)CIK細(xì)胞增殖的影響

在CIK細(xì)胞培養(yǎng)至第7天時(shí)，加入不同濃度的卡介菌多糖核酸處理細(xì)胞72 h，然后用CCK-8試劑盒檢測CIK細(xì)胞活性.分析數(shù)據(jù)結(jié)果，以不同BCG-PSN濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)作量效曲線圖，結(jié)果如圖2所示.由圖可知，隨著BCG-PSN濃度的增加，吸光度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在BCG-PSN濃度增加到10 mL/L時(shí)，CIK活細(xì)胞數(shù)目最多,吸光度最大且明顯高于未加藥組，統(tǒng)計(jì)分析差異有意義(*p<0.05).濃度繼續(xù)增加吸光度反而下降，但仍然比未加藥組高，到200 mL/L時(shí)，CIK細(xì)胞數(shù)量接近未加藥組.結(jié)果說明卡介菌多糖核酸對(duì)CIK細(xì)胞增殖的影響與劑量依賴有關(guān)，低濃度下可促進(jìn)增殖，高濃度反而無明顯效果.

2.3 卡介菌多糖核酸對(duì)CIK細(xì)胞殺傷活性的影響

為了驗(yàn)證卡介菌多糖核酸對(duì)CIK細(xì)胞殺瘤活性有影響，筆者將培養(yǎng)至第9天的CIK細(xì)胞加入卡介菌多糖核酸處理72 h(至12 d)，再進(jìn)行CIK殺傷SMMC-7721腫瘤細(xì)胞實(shí)驗(yàn).殺傷率統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3.結(jié)果顯示，無論是實(shí)驗(yàn)組還是對(duì)照組，隨著效靶比增大CIK細(xì)胞殺傷腫瘤效果增強(qiáng)；相比對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組CIK細(xì)胞在效靶比為5∶1和10∶1時(shí)殺傷率有顯著提高(*p<0.05)，在靶效比為20∶1時(shí)殺傷率也比對(duì)照組稍高.結(jié)果說明，卡介菌多糖核酸對(duì)CIK細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性有顯著增強(qiáng)作用.

圖2 BCG-PSN影響CIK細(xì)胞增殖的量效曲線Fig.2 The dose-effect curve of BCG-PSN on CIK cells

圖3 CIK 對(duì)SMMC-7721細(xì)胞的殺傷效率統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Cytotoxicities of CIK cells against SMMC-7721 cells

2.4 BCG-PSN對(duì)CIK細(xì)胞毒活性相關(guān)因子RNA表達(dá)的影響

收集生理鹽水和10 mL/L的卡介菌多糖核酸處理72 h的兩組CIK細(xì)胞，提取RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，做熒光定量PCR檢測CIK細(xì)胞毒活性相關(guān)因子的表達(dá).瓊脂糖凝膠電泳檢測CIK細(xì)胞RNA質(zhì)量，可看到28S和18S兩條清晰的帶，如圖4.RT-qPCR結(jié)果顯示BCG-PSN實(shí)驗(yàn)組CIK細(xì)胞Granzyme B(顆粒酶B)，TNF-α，TNF-β的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組明顯升高(*p<0.05), IFN-γ的mRNA表達(dá)量較對(duì)照組也有所升高，如圖5.表明卡介菌多糖核酸的確能促進(jìn)CIK細(xì)胞Granzyme B，TNF-α，TNF-β和IFN-γ等mRNA的表達(dá)，這可能是BCG-PSN增加CIK殺瘤活性的原因之一.

Mark：DNA standard marker；1：對(duì)照組CIK細(xì)胞RNA；2：BCG-PSN實(shí)驗(yàn)組CIK細(xì)胞RNA.圖4 CIK細(xì)胞RNA鑒定Fig.4 Identification of RNA from CIK cells

圖5 RT-qPCR檢測CIK細(xì)胞毒活性相關(guān)因子表達(dá)Fig.5 Expression levels of granzyme B, TNF-α, TNF-β, IFN-γ measured by RT-qPCR

3 討論

卡介菌多糖核酸是從卡介菌中提取的核酸、多糖等活性物質(zhì)混合而成的免疫增強(qiáng)劑，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫水平、增強(qiáng)機(jī)體抗感染和抗過敏的能力[10]，還可促進(jìn)T 淋巴細(xì)胞的增殖與活化及輔助提高機(jī)體內(nèi)NK殺傷活力[11].於敏等[12]研究表明卡介菌多糖核酸能顯著提高斷奶仔豬外周血淋巴細(xì)胞分化增殖，推測其可通過直接作用于外周血淋巴細(xì)胞從而增強(qiáng)個(gè)體免疫力.本研究結(jié)果表明低濃度卡介菌多糖核酸可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞增殖分化，而在機(jī)體免疫應(yīng)答過程中，T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的激活、分化、增殖起著重要的作用，因此，卡介菌多糖核酸或可通過直接作用于人周血淋巴細(xì)胞從而增強(qiáng)機(jī)體免疫力.

卡介菌多糖核酸影響CIK細(xì)胞的體外增殖及CIK殺傷肝癌細(xì)胞的特點(diǎn)尚無報(bào)道.SMMC-7721肝癌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室常用細(xì)胞系，材料易得且細(xì)胞個(gè)體大、生長較快易于實(shí)驗(yàn)，因此在此文中筆者選擇其作為CIK的靶細(xì)胞進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn).研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)BCG-PSN處理后的CIK細(xì)胞相比對(duì)照組殺瘤效果有明顯增加，在效靶比為5∶1和10∶1時(shí)殺傷率有顯著提高，在靶效比為20∶1時(shí)殺傷率也比對(duì)照組稍高，表明卡介菌多糖核酸能提高CIK的殺傷能力.

CIK殺傷腫瘤細(xì)胞的具體機(jī)制還并不清楚，根據(jù)之前相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道，筆者猜測可能與相關(guān)毒活性因子的表達(dá)相關(guān)，于是做熒光定量PCR檢測了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組處理后的CIK細(xì)胞Granzyme B,TNF-α,TNF-β和IFN-γ的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這幾類因子的RNA表達(dá)水平的確有所提高.Granzyme B,TNF-α,TNF-β和IFN-γ這幾種因子在CIK細(xì)胞殺瘤過程中發(fā)揮著重要作用，本研究也證實(shí)了其RNA表達(dá)升高促進(jìn)了CIK殺瘤效果.為了進(jìn)一步驗(yàn)證它們在蛋白水平的表達(dá)，后續(xù)將購買TNF-α和IFN-γ的ELISA試劑盒以檢測其在CIK細(xì)胞的胞外分泌情況.

顆粒酶B(Granzyme B)是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和自然殺傷(NK)細(xì)胞顆粒中絲氨酸蛋白酶家族中發(fā)揮殺傷作用的主要效應(yīng)分子，它能進(jìn)入靶細(xì)胞，激活caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，迅速引起靶細(xì)胞DNA的斷裂，使細(xì)胞快速凋亡[13].因此，它是殺傷細(xì)胞的標(biāo)志性分子之一.

腫瘤壞死因子 (Tumor Necrosis Factor, TNF )是一類重要的細(xì)胞因子，包括TNF-α和TNF-β兩類，TNF-α由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)生，而TNF-β則由活化的T細(xì)胞分泌[14].TNF具有廣泛的生物學(xué)活性，對(duì)腫瘤細(xì)胞有強(qiáng)烈的殺傷作用，還能刺激T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞使其功能增強(qiáng).本研究結(jié)果顯示，相比生理鹽水對(duì)照組，卡介菌多糖核酸能顯著提高TNF-α及TNF-β的mRNA表達(dá)量.

γ-干擾素(Interferon-γ，IFN-γ)是I型輔助T細(xì)胞(Th1細(xì)胞)的標(biāo)志性細(xì)胞因子，能抑制腫瘤細(xì)胞分裂，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞及 NK 細(xì)胞的殺傷性.另外γ-干擾素還可增加巨噬細(xì)胞對(duì)抗原的吞噬，調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫系統(tǒng)，提高NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷以及T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的激活，增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫應(yīng)答能力[15].

CIK是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤過繼免疫治療細(xì)胞，因其治療效果與細(xì)胞輸注劑量、效應(yīng)細(xì)胞比例和對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性有著密切關(guān)系，因此提高其體外的增殖效率和毒性是首要解決的問題.本研究證實(shí)低濃度下的卡介菌多糖核酸能促進(jìn)CIK細(xì)胞增殖，又能提高CIK的殺瘤效果，說明卡介菌多糖核酸可以作為一種較好的腫瘤輔助治療藥物.另外CIK細(xì)胞殺瘤效率提高的同時(shí)相關(guān)毒活性因子的表達(dá)也增加，揭示其可能是殺傷腫瘤細(xì)胞的途徑之一，這也為進(jìn)一步研究CIK殺傷腫瘤細(xì)胞機(jī)制奠定基礎(chǔ)，為抗腫瘤過繼免疫治療提供一些新思路.

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(編輯 WJ)

The Impact of BCG-PSN on the Activity of CIK Cells

HUANG Zhao-qin1, SU Ren-xiang1, ZHONG Bei-fen1, HAN Hui-min2, GU Zhi-xin2, YAN Dong-lan2, XIN Xiu2, YUAN Li2, HU Xiang1,2*

(1.Key Laboratory of Protein Chemistry and Developmental Biology of State Education Ministry of China, College of Life Science, Hunan Normal University, Changsha 410081, China;2.Jiuzhitang Limited Share Company Postdoctoral Workstation, Changsha 410205, China)

The BCG polysaccharide and nucleic acid (BCG-PSN) was added to CIK cells to study CIK cells’ responses on the proliferation and tumoricidal activity in vitro. CCK-8 results showed that the CIK cells treated with low dose BCG-PSN, compared with control group (normal saline), were significantly enhanced on the proliferation and tumoricidal activity. RT-qPCR results revealed that the expression of CIK Granzyme B, IFN-γ, TNF-α, TNF-βmRNA of BCG-PSN group was higher than that of the control group. These results lay the foundation for how to cultivate a large number of CIK cells with high tumoricidal activity, and provide new ideas for the therapy of anti-tumor adoptive immunity.

BCG-PSN; CIK cell; cell proliferation;tumoricidal activity

10.7612/j.issn.1000-2537.2017.02.005

2016-03-22

湖南省博士后基金資助項(xiàng)目(2012RS4016);長沙市科技局重點(diǎn)資助項(xiàng)目(K1303113-31)

Q78

A

1000-2537(2017)02-0033-06

*通訊作者,E-mail：huxiang@hunnu.edu.cn