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“低甲醇濃度- 高溶解氧濃度”策略誘導(dǎo)畢赤酵母高效表達(dá)HSA-GCSFm及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)理分析

2017-04-26 02:05:20涂庭勇賈祿強(qiáng)孫佼文陳珊珊史仲平
食品與發(fā)酵工業(yè) 2017年3期
關(guān)鍵詞:畢赤山梨醇酵母

涂庭勇,賈祿強(qiáng),孫佼文,陳珊珊,史仲平

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

“低甲醇濃度- 高溶解氧濃度”策略誘導(dǎo)畢赤酵母高效表達(dá)HSA-GCSFm及其轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)理分析

涂庭勇,賈祿強(qiáng),孫佼文,陳珊珊,史仲平*

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 無(wú)錫,214122)

甲醇/山梨醇共混誘導(dǎo)畢赤酵母(Mut+,GS115)表達(dá)人血清白蛋白-人粒細(xì)胞集落刺激因子突變體融合蛋白(HSA-GCSFm)的過(guò)程中,甲醇消耗與O2消耗相互偶聯(lián),難以將甲醇濃度和溶解氧濃度(DO)同時(shí)維持在高水平。該文研究探討了“低甲醇濃度-高DO”和“高甲醇濃度-低DO”誘導(dǎo)策略下HSA-GCSFm的表達(dá)性能。結(jié)果表明,“低甲醇濃度-高DO”誘導(dǎo)策略策略下的HSA-GCSFm濃度達(dá)到587.5 mg/L,而“高甲醇濃度-低DO”誘導(dǎo)策略下的HSA-GCSFm濃度僅達(dá)到106 mg/L。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)分析上述2種誘導(dǎo)策略引起HSA-GCSFm表達(dá)水平差異的分子機(jī)制,結(jié)果表明:“低甲醇濃度-高DO”條件下甲醇代謝途徑、TCA循環(huán)和過(guò)氧化物酶體相關(guān)的部分基因上調(diào),而與蛋白水解作用相關(guān)的部分基因下調(diào),表明該條件下甲醇和山梨醇的代謝活性更高,細(xì)胞抗高DO沖擊的能力更強(qiáng),錯(cuò)誤折疊的蛋白減少。

畢赤酵母;甲醇濃度;溶解氧濃度;轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

甲醇營(yíng)養(yǎng)型畢赤酵母(MethylotrophicPichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)是1980年代初開發(fā)和研制的一種新型蛋白表達(dá)系統(tǒng)。由于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)具有細(xì)胞容易達(dá)到高密度、產(chǎn)物表達(dá)效率高、產(chǎn)物可分泌到胞外、外源基因遺傳穩(wěn)定等許多優(yōu)點(diǎn),近年來(lái)已成為極受青睞、應(yīng)用廣泛的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[1]。一般而言,根據(jù)畢赤酵母利用甲醇的能力不同,可以將其分為甲醇利用快型(methanol utilization positive,Mut+)和甲醇利用慢型(methanol utilization slow,MutS)。Mut+型畢赤酵母的代表菌株為GS115;MutS型畢赤酵母的代表菌株為KM71。人粒細(xì)胞集落刺激因子是(human granulocyte colony stimulating factor,hG-CSF)特異的作用于粒系祖細(xì)胞,促進(jìn)其向中性細(xì)胞增殖、分化及維持功能、存活所必需的糖蛋白造血生長(zhǎng)因子[2]。BAHRAMI等成功地實(shí)現(xiàn)了hG-CSF在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá),且產(chǎn)量達(dá)到320 mg/L[3]。然而,hG-CSF由于分子量較小而易被腎小球過(guò)濾,導(dǎo)致其在人體內(nèi)半衰期短,使用效果不佳。目前,人們已利用人血清白蛋白(human serum albumin, HSA) 融合技術(shù)成功地融合了大量的多肽/蛋白類藥物并顯著地延長(zhǎng)了其半衰期[4]。為了延長(zhǎng)hG-CSF在人體內(nèi)的半衰期,本研究室的合作者將G-CSF突變體(GCSFm)與HSA進(jìn)行基因融合并在畢赤酵母GS115中成功表達(dá)。融合蛋白HSA-GCSFm兼具HSA抗原性及G-CSF活性,且突變型融合蛋白活性高出野生型融合蛋白數(shù)倍,具有良好的應(yīng)用前景[5]。

為了提高HSA-GCSFm在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)水平,需要對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化。畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的過(guò)程主要分為甘油初始培養(yǎng)期、甘油流加培養(yǎng)期和甲醇誘導(dǎo)培養(yǎng)期,其中甲醇誘導(dǎo)期是表達(dá)蛋白最為關(guān)鍵的時(shí)期。本研究室的合作者在前期研究中已經(jīng)證明,在甲醇誘導(dǎo)階段添加輔助碳源山梨醇能夠提高HSA-GCSFm在畢赤酵母GS115中的表達(dá)量[6]。在畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的誘導(dǎo)階段,甲醇濃度和溶解氧濃度(dissolved oxygen, DO)是影響外源蛋白表達(dá)的2個(gè)重要因素。對(duì)于畢赤酵母GS115而言,其誘導(dǎo)過(guò)程中甲醇能夠被快速消耗,且O2消耗與甲醇利用相互偶聯(lián)。因此,難以同時(shí)將甲醇濃度和DO控制在較高的水平,只能滿足其中之一。因此,本研究將在合作者前期研究[7]的基礎(chǔ)之上,考察采用甲醇/山梨醇共混誘導(dǎo)策略時(shí),“高甲醇濃度-低DO”和“低甲醇濃度-高DO”2種條件下HSA-GCSFm的表達(dá)性能,并利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析的方法進(jìn)一步解析導(dǎo)致上述2種條件下發(fā)酵性能差異的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

重組畢赤酵母(Pichiapastoris)GS115(pPIC9K-HSA-GCSFm),由江南大學(xué)藥學(xué)院分子藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。表達(dá)載體為pPIC9k蛋白信號(hào)肽為α交配因子信號(hào)肽,外源基因?yàn)镠SA-GCSFm。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L):酵母粉10,葡萄糖20,蛋白胨20。發(fā)酵罐初始培養(yǎng)基(g/L):甘油20 mL/L,K2SO41,MgSO41,CaSO40.1,(NH4)2SO45,PTM110 mL/L,H3PO42%(v/v),pH 6.0。甘油流加培養(yǎng)基(g/L):甘油500 mL/L,(NH4)2SO40.5,MgSO40.03,PTM110 mL/L, KH2PO40.5,pH 6.0。誘導(dǎo)流加培養(yǎng)基(g/L):甲醇500 mL/L,(NH4)2SO40.5,MgSO40.03,PTM110 mL/L, KH2PO40.5,pH 5.5。山梨醇流加培養(yǎng)基(g/L):山梨醇 500。

1.2 培養(yǎng)方法

1.2.1 種子培養(yǎng)

在裝有50 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中接入從YPD平板上挑取的單菌落,30 ℃、220 r/min的條件下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h,作為發(fā)酵的種子液。

1.2.2 5 L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)畢赤酵母表達(dá)HSA-GCSFm

分批補(bǔ)料培養(yǎng)在5 L發(fā)酵罐(百侖生物科技公司)內(nèi)進(jìn)行,裝液量3 L,接種量10%,通風(fēng)比為1.5 vvm。初始甘油耗盡后開始補(bǔ)加甘油流加培養(yǎng)基,利用前期研究中構(gòu)建的改良型DO-stat策略控制甘油流加,當(dāng)DO基線過(guò)低時(shí)改為通純氧,當(dāng)菌體質(zhì)量濃度達(dá)到100 g-DCW/L時(shí)停止流加甘油。經(jīng)過(guò)1~2 h的饑餓培養(yǎng),甘油以及其他可以充當(dāng)碳源的中間代謝物全部耗盡后,添加甲醇誘導(dǎo)HSA-GCSFm的表達(dá)。因此本研究中,采用2種不同的甲醇/山梨醇共混流加誘導(dǎo)策略:(1)誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO):將DO設(shè)定為10%,按照下列公式修正甲醇流加速率:F=F*+Kc×(DO-DOset)。其中F表示甲醇流加速率(F≥ 0);F*代表基準(zhǔn)甲醇流加速率,本次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)中F*=0.7 mL/min;控制參數(shù)Kc在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定為0.05。(2)誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO):利用甲醇電極在線檢測(cè)甲醇濃度,并采用ON-OFF控制的方式將甲醇濃度維持在5~10 g/L,同時(shí)按2∶1的質(zhì)量比流加山梨醇。在整個(gè)誘導(dǎo)期內(nèi),均采用空氣供氧,通風(fēng)比為1.5 vvm,攪拌速率保持不變,并將2個(gè)電子天平通過(guò)RS232通訊接口連接至工業(yè)控制計(jì)算機(jī),通過(guò)自編的監(jiān)控程序在線記錄甲醇和山梨醇的流加速率。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 乙醇和甲醇濃度測(cè)定

商用的膜滲透型甲醇電極(上海蘇泊公司,F(xiàn)C2002)可以對(duì)乙醇和甲醇這一類的揮發(fā)性小分子有機(jī)物產(chǎn)生響應(yīng),其響應(yīng)電壓與有機(jī)物濃度存在二次曲線型的數(shù)量關(guān)系。利用不同濃度的甲醇和乙醇標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別擬合出描述電極輸出電壓與乙醇/甲醇濃度之間數(shù)量關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在細(xì)胞培階段和誘導(dǎo)階段,根據(jù)電極的輸出電壓,分別利用各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到乙醇和甲醇的濃度。

1.3.2 菌濃測(cè)定

測(cè)量方法與參考文獻(xiàn)[8]相同。

1.3.3 HSA-GCSFm濃度測(cè)定

SDS-PAGE蛋白電泳。使用5%的濃縮膠和8%的分離膠定性檢測(cè)。利用尿微量蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定樣品中HSA的含量,根據(jù)公式C(HSA-GCSFm)=1.30×C(HSA)來(lái)計(jì)算融合蛋白的濃度(g/L),其中1.30代表HSA與HSA-GCSFm的相對(duì)分子質(zhì)量之比。

1.3.4 總蛋白濃度測(cè)定

采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定發(fā)酵液中的總蛋白濃度,操作步驟與參考文獻(xiàn)[9]相同。

1.3.5 乙醇和甲醇濃度的離線測(cè)定

乙醇和甲醇濃度使用氣相色譜儀測(cè)定,色譜條件與參考文獻(xiàn)[10]相同。

1.3.6 山梨醇的檢測(cè)方法

采用高效液相色譜法測(cè)定。檢測(cè)之前,發(fā)酵上清液樣過(guò)0.22 μm 膜處理。色譜條件如下:氨基柱(Agilent);示差折光檢測(cè)器 (RID);檢測(cè)器溫度 30 ℃;柱溫 30 ℃;流動(dòng)相 70% 乙腈和 30% 超純水;流速 1 mL/min;進(jìn)樣量 20 μL。

1.3.7 O2利用速率,CO2釋放速率的計(jì)算

利用尾氣分析儀(LKM2000A,韓國(guó)LOKAS公司)在線檢測(cè)發(fā)酵尾氣中的CO2和O2的分壓,按文獻(xiàn)[11]中的公式進(jìn)行計(jì)算O2利用速率(oxygen uptake rate OUR),CO2釋放速率(carbon dioxide rate CER),并借助RS232通信接口將數(shù)據(jù)傳輸記錄于工業(yè)控制計(jì)算機(jī)中。

1.3.8 甲醇及山梨醇代謝關(guān)鍵酶比酶活測(cè)定

醇氧化酶(alcohol oxidase,AOX),甲醛脫氫酶(formaldehyde dehydrogenase,F(xiàn)LD),甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase,F(xiàn)DH),異檸檬酸脫氫酶(isocitrate dehydrogenase,IDH)以及α-酮戊二酸脫氫酶(α-ketogluarate dehydrogenase complex, α-KD)比酶活按文獻(xiàn)[12]報(bào)道方法測(cè)定。

1.3.9 不同誘導(dǎo)條件下產(chǎn)HSA-GCSFm的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

誘導(dǎo)HSA-GCSFm表達(dá)36 h后,分別取10 mL誘導(dǎo)策略Ⅰ和誘導(dǎo)策略Ⅱ條件下的發(fā)酵液。委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司提取胞內(nèi)RNA,并采用RNA-seq法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。分析兩種發(fā)酵策略下基因的差異表達(dá)情況,并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG功能富集分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同誘導(dǎo)策略下的發(fā)酵性能

前期研究表明,將DO控制在10%~15%時(shí),Mut+型畢赤酵母細(xì)胞能夠高效表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap蛋白[13]。因此,在本研究中,將10%~15%的DO水平定為“高DO”。對(duì)于本研究中使用的Mut+型畢赤酵母菌株,在甲醇供應(yīng)充足條件下醇氧化酶被大幅度激活,細(xì)胞耗氧劇烈,導(dǎo)致DO始終處于0%。想要將DO控制在10%~15%的高水平,必須要限制細(xì)胞對(duì)甲醇的消耗速率。通過(guò)調(diào)節(jié)甲醇流加速率將DO控制在10%~15 %(高DO)時(shí),甲醇濃度必然處于極低的水平(1 g/L以下),此時(shí)的甲醇濃度被認(rèn)為是“低甲醇濃度”。DAMASCENO等人發(fā)現(xiàn),將甲醇濃度控制在5 g/L時(shí),可以獲得最高的目的蛋白產(chǎn)量(A33scFv)[14];DING等人發(fā)現(xiàn),將甲醇濃度控制在5 g/L以上時(shí),甲醇供應(yīng)充足,畢赤酵母細(xì)胞能夠高效表達(dá)豬α干擾素[15]。在本研究中,將高于5 g/L的甲醇濃度界定為“高甲醇濃度”。將甲醇濃度控制在5 g/L以上時(shí),DO自然處于接近0%的水平,此時(shí)的DO水平被認(rèn)定為“低DO”。

利用誘導(dǎo)策略Ⅰ實(shí)現(xiàn)上述的“高DO-低甲醇濃度”誘導(dǎo)條件,將DO設(shè)定在10%,甲醇濃度自然;利用誘導(dǎo)策略Ⅱ?qū)崿F(xiàn)上述的“低DO-高甲醇濃度”誘導(dǎo)條件,將甲醇濃度設(shè)定在5 g/L,DO自然。實(shí)際的控制性能如圖1所示,在誘導(dǎo)策略Ⅰ下,DO在絕大多數(shù)時(shí)間內(nèi)都被維持在10%~15%,而甲醇濃度則始終被維持在1 g/L以下。與此相反,在誘導(dǎo)策略Ⅱ中,DO始終維持在0%,而甲醇濃度則始終被維持在5~8 g/L。圖2a是2種誘導(dǎo)策略下發(fā)酵液樣品SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果,從中可以看出,誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下的HSA-GCSFm表達(dá)水平明顯高于誘導(dǎo)條件Ⅱ下的相應(yīng)值。直接測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵液樣品中的HSA-GCSFm濃度,也得到相同的結(jié)論。如圖2b所示,采用誘導(dǎo)策略Ⅰ時(shí),誘導(dǎo)60 h后HSA-GCSFm的濃度達(dá)到587.5 mg/L;采用誘導(dǎo)策略Ⅱ時(shí),誘導(dǎo)60 h后HSA-GCSFm的濃度僅達(dá)到106 mg/L。

圖1 不同誘導(dǎo)策略下的DO及甲醇濃度變化Fig.1 Variations of DO and methanol concentration in different induction strategies誘導(dǎo)策略Ⅰ:低甲醇濃度-高DO;誘導(dǎo)策略Ⅱ:高甲醇濃度-低DO

圖2 不同誘導(dǎo)策略下的HSA-GCSFm表達(dá)水平Fig.2 The expression level of HSA-GCSFm in different induction strategies誘導(dǎo)策略Ⅰ:低甲醇濃度-高DO;誘導(dǎo)策略Ⅱ:高甲醇濃度-低DO

2.2 不同誘導(dǎo)策下的呼吸特性

OUR和CER是發(fā)酵過(guò)程中重要的在線狀態(tài)參數(shù),可以直接反應(yīng)菌體的呼吸代謝狀況。圖3比較了誘導(dǎo)策略Ⅰ和誘導(dǎo)策略下的OUR和CER。從中可以看出,采用誘導(dǎo)策略Ⅰ的批次其OUR和CER在誘導(dǎo)期內(nèi)分別維持在50 mmol/(L·h)和40 mmol/(L·h);采用誘導(dǎo)策略Ⅱ的批次其OUR和CER在誘導(dǎo)期內(nèi)分別維持在90 mmol/(L·h)和60 mmol/(L·h)。在誘導(dǎo)策略Ⅱ的調(diào)節(jié)下,甲醇濃度能夠被維持在5~8 g/L,從而保證甲醇的充足供應(yīng),甲醇代謝活性被大幅度提高,這就導(dǎo)致該條件下的OUR和CER均明顯高于采用誘導(dǎo)策略Ⅰ的批次。在采用誘導(dǎo)策略Ⅱ的批次中,HSA-GCSFm表達(dá)水平較低。由此可以看出,高代謝呼吸活性并不一定能夠促進(jìn)HSA-GCSFm的高效表達(dá)。

圖3 不同誘導(dǎo)策略下細(xì)胞CER和OUR變化Fig.3 Variations of CER and OUR in different feeding strategies誘導(dǎo)策略Ⅰ:低甲醇濃度-高DO;誘導(dǎo)策略Ⅱ:高甲醇濃度-低DO

2.3 不同誘導(dǎo)策略下的碳代謝關(guān)鍵酶活性

如圖4所示,AOX是甲醇代謝途徑中最關(guān)鍵的酶,它催化甲醇代謝過(guò)程中的第一步反應(yīng),將甲醇氧化為甲醛。AOX的活性則直接決定細(xì)胞對(duì)甲醇的利用速率,從而影響發(fā)酵產(chǎn)蛋白的速率。不同的誘導(dǎo)策略在誘導(dǎo)期的細(xì)胞干重基本相同,AOX的比活性實(shí)際體現(xiàn)了不同誘導(dǎo)條件下細(xì)胞代謝甲醇的能力。由圖5a可知,誘導(dǎo)策略Ⅰ下的AOX比活性活性比采用誘導(dǎo)策略Ⅱ的批次提高了一倍多。這表明在高DO環(huán)境下畢赤酵母細(xì)胞具有更強(qiáng)的代謝甲醇的能力。但在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下,由于甲醇供應(yīng)收到限制,實(shí)際的甲醇消耗速率仍然低于采用誘導(dǎo)策略Ⅱ的批次,如圖5b所示。

圖4 畢赤酵母胞內(nèi)碳代謝路徑Fig.4 Carbon metabolism pathways in Pichia pastoris

:誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO);:誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖5 不同誘導(dǎo)策略下的AOX比酶活和甲醇消耗速率Fig.5 Specific activities of AOX and methanol consumption rate in different induction strategies

FLD和FDH是甲醇異化途徑(Pathway B)中的關(guān)鍵酶,分別催化甲醛氧化為甲酸和甲酸完全氧化為CO2的反應(yīng)。由圖6a和圖6b可知,誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下的FLD和FDH比酶活均明顯高于誘導(dǎo)策略Ⅱ。因此,在采用誘導(dǎo)策略Ⅰ時(shí)畢赤酵母細(xì)胞能夠快速分解甲醛和甲酸,減輕了甲醛和甲酸對(duì)細(xì)胞的毒害作用。如圖4所示,輔助碳源山梨醇的代謝是通過(guò)糖酵解途徑和TCA途徑(Pathway C)完成的,α-KD和IDH是TCA途徑中的關(guān)鍵酶。由圖6c和6d可知,誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下的α-KD和IDH比酶活均明顯高于誘導(dǎo)策略Ⅱ。因此,誘導(dǎo)策略Ⅰ能夠提高畢赤酵母細(xì)胞代謝山梨醇的效率,為蛋白合成途徑提供更多的能量,促進(jìn)HSA-GCSFm的高效表達(dá)。

:誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO);:誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖6 不同誘導(dǎo)策略關(guān)鍵酶的比酶活Fig.6 Specific activities of the key enzyme using different feeding strategies

2.4 不同誘導(dǎo)策略下基因的差異表達(dá)

2.4.1 差異表達(dá)基因的篩選

利用RNA-seq技術(shù)分析獲得誘導(dǎo)策略Ⅰ(高DO-低甲醇濃度)和誘導(dǎo)策略Ⅱ(低DO-高甲醇濃度)條件下、誘導(dǎo)中期(36 h)的細(xì)胞樣本各基因的轉(zhuǎn)錄水平數(shù)據(jù)。以Foldchange≥1.5和qvalue≤0.05為條件,篩選不同誘導(dǎo)條件下的差異表達(dá)基因。根據(jù)篩選結(jié)果,差異化表達(dá)的基因共有514個(gè),其中上調(diào)表達(dá)的基因數(shù)為278個(gè),下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)為236個(gè)。

2.4.2 差異表達(dá)基因的 GO功能富集分析

Gene Ontology(GO)是一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化的基因功能分類體系,通過(guò)GO功能顯著性富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的生物學(xué)功能[16]。因此,本研究對(duì)不同誘導(dǎo)策略下的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析,結(jié)果表明(表1):差異表達(dá)基因主要集中于水解酶活性、氧化還原等分子功能和羧酸代謝過(guò)程、細(xì)胞呼吸等細(xì)胞過(guò)程。

2.4.3 差異表達(dá)基因的KEGG Pathway代謝途徑分析

在生物體內(nèi),不同基因相互協(xié)調(diào)行使其生物學(xué)功能,通過(guò)途徑顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息的數(shù)據(jù)庫(kù),它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究[17]。因此,對(duì)不同誘導(dǎo)條件下的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG信號(hào)通路分析,符合P≤0.05則被定義為顯著性差異富集的信號(hào)代謝通路,結(jié)果如表2所示:TCA循環(huán)、甲醇代謝、氨基酸合成、氮代謝等途徑相關(guān)的基因都有不同程度的上調(diào)或下調(diào),表明不同誘導(dǎo)策略可以引起畢赤酵母細(xì)胞代謝途徑的變化。這些代謝通路改變對(duì)研究不同甲醇濃度及DO影響畢赤酵母表達(dá)HSA-GCSFm的分子機(jī)制具有重要意義。

表1 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析

表2 差異表達(dá)基因的KEGG Pathway 功能集分析

2.5 不同誘導(dǎo)策略影響HSA-GCSFm表達(dá)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)理

2.5.1 與甲醇相關(guān)代謝基因轉(zhuǎn)錄水平變化

甲醇是蛋白表達(dá)過(guò)程的誘導(dǎo)劑和主要碳源,因此首先比較不同誘導(dǎo)策略下甲醇代謝相關(guān)基因的表達(dá)水平。如圖7所示,在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下,ALOX1基因轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)。ALOX1基因編碼醇氧化酶,其轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)會(huì)引起醇氧化酶活性的提高(圖5a)。FDH是編碼甲酸脫氫酶的基因,在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下明顯上調(diào), FDH酶具有更高的活性(圖6b),使得酵母細(xì)胞更易分解甲醇代謝產(chǎn)生的有毒中間產(chǎn)物甲酸。MTHR2編碼四氫葉酸還原酶,四氫葉酸是一碳單位的攜帶者,MTHR2基因在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下的上調(diào)表明細(xì)胞的甲醇代謝能力得到大幅提升。ACS1和SERB分別編碼乙酰輔酶A合成酶B和磷酸絲氨酸磷酸酶,也與甲醇代謝密切相關(guān)。由此可見(jiàn),誘導(dǎo)策略Ⅰ能夠提高諸多甲醇代謝相關(guān)酶的表達(dá)水平,進(jìn)而顯著激活甲醇代謝通路。

:誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO);□:誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖7 與甲醇代謝相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.7 Transcriptional analysis of genes relate to methanol metabolism

2.5.2 與TCA代謝路徑轉(zhuǎn)錄水平

輔助碳源山梨醇被攝入酵母細(xì)胞后,通過(guò)TCA循環(huán)完成其代謝過(guò)程。TCA循環(huán)中所產(chǎn)生的中間物代謝可以作為其他代謝途徑的前體,如氧化磷酸化,氨基酸合成,脂肪酸以及其它生物大分子的合成。山梨醇的添加,能夠明顯緩解甲醇的供能壓力,并為HSA-GCSFm的合成提供充足的碳源。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn),在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下,有部分TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶基因顯著上調(diào)(圖8)。檸檬酸合酶由CIS基因編碼,是TCA循環(huán)中最關(guān)鍵的限速酶,對(duì)TCA循環(huán)的整體活性有調(diào)節(jié)作用。CIS基因的上調(diào)可以提高TCA循環(huán)的整體代謝活性。IDH2基因編碼編碼異檸檬酸脫氫酶; KDL基因編碼催化α-酮戊二酸生成琥珀酰CoA的復(fù)合酶系;MDHC基因編碼蘋果酸脫氫酶。IDH2,KDH和MDHC在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下均有不同程度的上調(diào)。由此可知,采用誘導(dǎo)策略Ⅰ時(shí),細(xì)胞代謝山梨醇的能力更強(qiáng),能夠?yàn)榈鞍缀铣商峁└映渥愕哪芰亢吞荚础?/p>

:誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO);□:誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖8 與TCA循環(huán)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.8 Transcriptional analysis of genes relate to tricarboxylic acid cycle

2.5.3 與蛋白酶體代謝途徑基因轉(zhuǎn)錄水平

蛋白酶體由2個(gè)19S調(diào)節(jié)蛋白和1個(gè)20S核心蛋白組成。Rpn11是19S的蛋白PA700中Lid的成員,Rpn11是調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)鍵亞基,能夠直接影響調(diào)節(jié)蛋白的活性[18]。Rpn2、Rpn13、Rpt3分別參與編碼26S蛋白酶的調(diào)節(jié)亞基N2、N13、T3。PSB3和PSB5分別編碼20S核心蛋白的β3和β5亞基。上述基因編碼的蛋白主要參與ATP依賴的蛋白水解,其在誘導(dǎo)策略Ⅰ條件下均明顯下調(diào)(圖9)。這說(shuō)明在采用誘導(dǎo)策略Ⅰ進(jìn)行發(fā)酵時(shí),細(xì)胞內(nèi)的蛋白酶含量減少,錯(cuò)誤折疊的蛋白數(shù)減少,蛋白合成效率提高。

:誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO);□:誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖9 與蛋白酶體代謝基因轉(zhuǎn)錄變化Fig.9 Transcriptional analysis of genes relate to proteasome

2.5.4 與過(guò)氧化物酶體代謝轉(zhuǎn)錄水平

過(guò)氧化物酶體在O2代謝起到十分重要的作用,它能夠調(diào)節(jié)O2濃度,降低O2對(duì)細(xì)胞造成的傷害[19]。一旦溶氧上升,細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶體氧化應(yīng)激反應(yīng)上調(diào),用于緩解高濃度氧給細(xì)胞帶來(lái)的毒害作用。PXMP4編碼過(guò)氧化物酶體上的膜蛋白酶4,主要參與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)和催化功能。SODM編碼超氧化物歧化酶(SOD),SOD能夠催化體內(nèi)的O2-發(fā)生歧化反應(yīng),從而將其清除。PMP20基因的編碼產(chǎn)物則屬于抗氧化蛋白超家族,主要起到還原過(guò)氧化物的作用。SPS19和LCF1的編碼產(chǎn)物則主要編碼參與不飽和脂肪酸的氧化。CACM編碼肉毒堿-O-乙?;D(zhuǎn)移酶,它也是參與清除過(guò)氧化物的酶類之一。如圖10所示,上述與O2代謝相關(guān)的基因在誘導(dǎo)策略Ⅰ下均有不同程度的上調(diào)。這是由于誘導(dǎo)策略Ⅰ下的DO水平明顯高于誘導(dǎo)策略Ⅱ,大量O2通過(guò)自由擴(kuò)散進(jìn)入胞內(nèi),引起O2-等有毒副產(chǎn)物的生產(chǎn)。而細(xì)胞本身則通過(guò)上調(diào)上述基因,合成相關(guān)酶,降解O2代謝中的有毒副產(chǎn)物,保證細(xì)胞生理活動(dòng)的正常進(jìn)行。

:誘導(dǎo)策略Ⅰ(低甲醇濃度-高DO);□:誘導(dǎo)策略Ⅱ(高甲醇濃度-低DO)圖10 與過(guò)氧化物酶體相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄變化Fig.10 Transcriptional analysis of genes relate to peroxisome

3 結(jié)論

本研究在甲醇/山梨醇共混誘導(dǎo)條件下,對(duì)比了“低甲醇濃度-高DO”和“高甲醇濃度-低DO”2種誘導(dǎo)策略。結(jié)果表明,“低甲醇濃度-高DO”條件更有利于HSA-GCSFm的高效表達(dá)。利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析技術(shù)揭示產(chǎn)生上述現(xiàn)象的分子機(jī)制,結(jié)果發(fā)現(xiàn):“低甲醇濃度-高DO”條件下甲醇代謝途徑、TCA循環(huán)和過(guò)氧化物酶體相關(guān)的部分基因發(fā)生不同程度的上調(diào),而與蛋白水解相關(guān)的部分基因則發(fā)生了不同程度的下調(diào)。這說(shuō)明“低甲醇濃度-高DO”條件下甲醇和山梨醇代謝的活性更高,細(xì)胞抗高DO沖擊的能力更強(qiáng),錯(cuò)誤折疊的蛋白減少,蛋白合成效率更高。

[1] MACAULEY-PATRICK S, FAZENDA M L, MCNEIL B, et al. Heterologous protein production using thePichiapastorisexpression system [J]. Yeast, 2005, 22(4): 249-270.

[2] ZSEBO K M, COHEN A M, MURDOCK D C, et al. Recombinant human granulocyte colony stimulating factor: molecular and biological characterization [J]. Immunobiology, 1986, 172(3-5): 175-184.

[3] BAHRAMI A, SHOJAOSADATI S A, KHALILZADEH R, et al. Two-stage glycerol feeding for enhancement of recombinant hG-CSF production in a fed-batch culture ofPichiapastoris[J]. Biotechnology Letters, 2008, 30(6): 1 081-1 085.

[4] DARRELL S, JASON C, LESLIE R E. Albumin as a versatile platform for drug half-life extension [J]. Biochimica Et Biophysica Acta, 2013, 1830(12): 5 526-5 534.

[5] 朱書峰. 計(jì)算機(jī)輔助HSA-hGCSF融合蛋白的分子改造 [D]. 無(wú)錫; 江南大學(xué), 2008.

[6] 李清亮, 周月涵, 丁健,等. 畢赤酵母GS115表達(dá)HSA-GCSF~m的誘導(dǎo)工藝研究 [J]. 工業(yè)微生物, 2016, 02): 8-13.

[7] 李清亮. 畢赤酵母表達(dá)HSA-GCSFm融合蛋白的發(fā)酵與純化研究 [D]. 無(wú)錫:江南大學(xué), 2015.

[8] BLAKE M S, JOHNSTON K H, RUSSELL-JONES G J, et al. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots [J]. Analytical Biochemistry, 1984, 136(1): 175-179.

[9] JIN Hu, ZHENG Zhi-yong, GAO Min-jie, et al. Effective induction of phytase inPichiapastorisfed-batch culture using an ANN pattern recognition model-based on-line adaptive control strategy [J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 37(1): 26-33.

[10] WANG Zhi-hao, WANG Yun, ZHANG Dong-xu, et al. Enhancement of cell viability and alkaline polygalacturonate lyase production by sorbitol co-feeding with methanol inPichiapastorisfermentation [J]. Bioresource technology, 2010, 101(4): 1 318-1 323.

[11] GAO Min-jie, ZHAN Xiao-bei, ZHENG Zhi-yong, et al. Enhancing pIFN-alpha production and process stability in fed-batch culture ofPichiapastorisby controlling the methanol concentration and monitoring the responses of OUR/DO levels [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 171(5): 1 262-1 275.

[12] GAO Min-jie, DONG Shi-juan, YU Rui-song, et al. Improvement of ATP regeneration efficiency and operation stability in porcine interferon-α production byPichiapastorisunder lower induction temperature [J]. Korean Journal of Chemical Engineering, 2011, 28(6): 1 412-1 419.

[13] DING Jian, ZHANG Chun-ling, GAO Min-jie, et al. Enhanced porcine circovirus Cap protein production byPichiapastoriswith a fuzzy logic DO control based methanol/sorbitol co-feeding induction strategy [J]. Journal of Biotechnology, 2014, 177(1)35-44.

[14] DAMASCENO L M, PLA I, CHANG H J, et al. An optimized fermentation process for high-level production of a single-chain Fv antibody fragment inPichiapastoris” [J]. Protein Expression and Purification, 2004, 37(1): 18-26.

[15] DING Jian, GAO Minjie, HOU Guoli, et al. Stabilizing porcine interferon-α production byPichiapastoriswith an ethanol on-line measurement based DO-Stat glycerol feeding strategy [J]. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2014, 89(12): 1 948-1 953.

[16] YOUNG M D, WAKEFIELD M J, SMYTH G K, et al. Gene ontology analysis for RNA-seq: accounting for selection bias [J]. Genome Biology, 2010, 11(2): 1-12.

[17] MAO X, CAI T, OLYARCHUK J G, et al. Automated genome annotation and pathway identification using the KEGG Orthology (KO) as a controlled vocabulary [J]. Bioinformatics, 2005, 21(19): 3 787-3 793.

[18] LUO Honglin, WONG J, WONG B. Protein degradation systems in viral myocarditis leading to dilated cardiomyopathy [J]. Cardiovascular Research, 2010, 85(2): 347-356.

[19] MARKS V D, HO S S D, GK V D M, et al. Dynamics of the yeast transcriptome during wine fermentation reveals a novel fermentation stress response [J]. Fems Yeast Research, 2008, 8(1): 35-52.

Enhanced HSA-GCSFmproduction byPichiapastorisunder “l(fā)ow methanol concentration-high dissolved oxygen” induction strategy and its transcriptome analysis

TU Ting-yong, JIA Lu-qiang, SUN Jiao-wen, CHEN Shan-shan, SHI Zhong-ping*

(Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In the process of producing HSA-GCSFmwith methanol/sorbitol co-induction byPichiapastoris, the consumptions of methanol and O2couple with each other, making it difficult to maintain methanol concentration and dissolved oxygen (DO) at high level simultaneously. In this study, induction strategies of “high methanol concentration-low DO” and “l(fā)ow methanol concentration-high DO” were adopted, and the performances of HSA-GCSFmproduction were investigated. As a result, the titer of HSA-GCSFmunder “high methanol concentration-low DO” and “l(fā)ow methanol concentration-high DO” strategies were 587.5 mg/L and 106 mg/L, respectively. The molecular mechanism of the two induction strategies causing different HSA-GCSFmexpression level was revealed by transcriptome analysis. Under the “l(fā)ow methanol concentration-high DO” strategy, the partial genes correlated with methanol metabolic pathway, TCA cycle and peroxisome were up-regulated, while the partial genes involved in proteolysis were down-regulated. That indicated the higher metabolic activities of methanol and sorbitol, the enhanced resistance to the shock of high DO and reduced protein misfolding.

Pichiapastoris; methanol concentration; dissolved oxygen; transcriptome analysis

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703001

碩士研究生(史仲平教授為通訊作者,E-mail:jnbioprocess@163.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(21606106);江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150127)

2016-09-05,改回日期:2016-11-23

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