石群，張慶芳，楊麗娜，任楠楠，喬慧，遲乃玉*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

肌酐水解酶菌株S-09發(fā)酵條件優(yōu)化及酶的分離純化

石群1，2，張慶芳1，2，楊麗娜1，2，任楠楠1，2，喬慧1，2，遲乃玉1，2*

（1.大連大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧大連116622；2.遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心，遼寧大連116622）

該實(shí)驗(yàn)以海洋來源的微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）S-09為出發(fā)菌株，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基和產(chǎn)酶條件進(jìn)行優(yōu)化。并將粗酶液經(jīng)硫酸銨鹽析、透析、超濾離心和Sephadex G-100凝膠過濾層析進(jìn)行分離純化。結(jié)果表明，其最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為0.5%的肌酐作為碳源、0.3%胰蛋白胨和0.2%玉米漿作為復(fù)合氮源，誘導(dǎo)物肌酸含量為0.3%；其最佳發(fā)酵條件為作用pH值7.5、溫度25℃、裝液量50 mL/250 mL、接種量3%。Fe2+和Mn2+能顯著促進(jìn)產(chǎn)酶。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠電泳結(jié)果顯示，純化后的肌酐水解酶分子質(zhì)量為24.3 ku。

肌酐水解酶；培養(yǎng)基；發(fā)酵條件；優(yōu)化；分離純化

肌酐水解酶（creatininase）EC 3.5.2.10可偶聯(lián)肌氨酸氧化酶將肌酐降解為肌酸、甲醛和過氧化氫[1]。作為一種重要的診斷酶制劑，肌酐水解酶被應(yīng)用于臨床檢測(cè)血清中的肌酐含量[2-3]，用來診斷腎臟功能的健康程度。

肌酐含量檢測(cè)已成為臨床常規(guī)的檢測(cè)項(xiàng)目，但國(guó)內(nèi)因原酶提取技術(shù)不成熟、臨床需酶量大、誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴等因素使得酶促檢測(cè)法的推廣受到延滯[4-5]，普遍采用的化學(xué)檢測(cè)法因其特異性差、易受樣品干擾而使得檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確[6]。肌酐水解酶作為酶促反應(yīng)中的第一步[7]，其酶的純度及酶學(xué)性質(zhì)因來源不同而有一定差異，會(huì)直接影響作用效果，如分子質(zhì)量、亞基組成和蛋白質(zhì)組成等[8-10]，因此研究其純度及性質(zhì)變得尤為重要。此外，肌酐作為腎臟功能性障礙及尿毒癥患者血液中僅次于尿素氮的第二大毒素[11]，其含量的累積對(duì)紅細(xì)胞有一定的損害[12]。而我國(guó)關(guān)于清除肌酐的藥物研究涉及較少，因此研究開發(fā)肌酐水解酶的特性并應(yīng)用于醫(yī)療事業(yè)是研究者當(dāng)前面臨的重要問題和挑戰(zhàn)。

本實(shí)驗(yàn)利用海洋資源篩選出一株產(chǎn)肌酐水解酶的微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）S-09，通過單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化S-09產(chǎn)酶條件，粗酶液經(jīng)鹽析、透析及Sephadex G-100凝膠柱層析進(jìn)行分離純化。目的是增加菌種來源、提高原酶純度，為探究清除肌酐藥物研制及進(jìn)一步開發(fā)國(guó)產(chǎn)診斷酶制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

微小桿菌（Exiguobacteriumsp.）S-09：分離自渤海海域（123°371′E，39°6972′N）海泥樣品中，現(xiàn)由遼寧省海洋微生物工程技術(shù)研究中心保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

固體活化培養(yǎng)基采用LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，瓊脂2%，NaCl 1%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

種子培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母浸粉0.5%，NaCl 1%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：肌酐0.5%，胰蛋白胨0.5%，K2HPO40.1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KCl 0.05%，水1 000 mL，pH 7.0，121℃滅菌20 min。

1.1.3 化學(xué)試劑

肌酐（分析純）：大連凱美化工工程配套有限公司；肌酸（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；苦味酸（分析純）：生工生物工程（上海）股份有限公司；蛋白Marker：加拿大Fermentas公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HZP-250全溫振蕩培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌器：日本三洋電機(jī)株式會(huì)社；LTI-700恒溫培養(yǎng)箱：上海愛朗儀器有限公司；HD-1360超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)：廣州市龍煜生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化

無(wú)菌條件下，將保存于4℃條件下的斜面菌株接種到固體活化培養(yǎng)基中，25℃培養(yǎng)24h，純化2次以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.3.2 種子培養(yǎng)

無(wú)菌條件下挑取斜面上菌體一環(huán)，于裝液量為100 mL/ 250mL的種子培養(yǎng)基中，于25℃、180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng)

按接種量1%吸取一定的種子液于裝液量為200 mL/ 500mL的發(fā)酵培養(yǎng)基中，于25℃、180r/min搖床培養(yǎng)36h。

1.3.4 肌酐水解酶活測(cè)定方法[13-14]

取0.1 mL的酶液加入0.9 mL肌酸溶液中，37℃反應(yīng)10 min后取出0.1 mL反應(yīng)液加入1 mol/L NaOH和0.5%苦味酸（各1 mL）終止反應(yīng)，加入0.9 mL蒸餾水，于25℃水浴鍋水浴20 min后于波長(zhǎng)520 nm處測(cè)吸光度值。肌酐水解酶活力定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化1 μmol肌酐轉(zhuǎn)變成產(chǎn)物所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.5 發(fā)酵條件單因素優(yōu)化

通過對(duì)菌株生長(zhǎng)的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，最終獲得最適合菌株生長(zhǎng)及其發(fā)酵條件，在原來的基礎(chǔ)上提高發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量，以期達(dá)到生產(chǎn)最大發(fā)酵產(chǎn)物的目的，是微生物產(chǎn)業(yè)化中重要的一步[15]。本實(shí)驗(yàn)以菌株S-09為出發(fā)菌株，探究發(fā)酵培養(yǎng)基配比和發(fā)酵的最優(yōu)條件。

（1）最適誘導(dǎo)物濃度對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

選取肌酸為誘導(dǎo)物，探究不同加入量（0、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%）對(duì)酶活的影響。種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（2）不同碳源對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別選用0.5%不同碳源（肌酐、可溶性淀粉、花生油、乳糖、蔗糖、檸檬酸鈉）作為唯一碳源，種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（3）不同氮源對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別選用0.5%不同氮源（胰蛋白胨、酵母膏、魚粉蛋白胨、牛肉膏、玉米漿）作為唯一氮源，種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（4）復(fù)合氮源配比對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

在選取最適氮源的基礎(chǔ)上以（胰蛋白胨+玉米漿）為復(fù)合氮源，胰蛋白胨與玉米漿配比分別為0.2%∶0.2%、0.2%∶0.3%、0.2%∶0.4%、0.3%∶0.2%、0.3%∶0.3%、0.3%∶0.4%，探究不同復(fù)合氮源配比對(duì)菌株產(chǎn)酶性能的影響。種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（5）pH對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

分別設(shè)置培養(yǎng)基初始pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（6）培養(yǎng)溫度對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

設(shè)置培養(yǎng)溫度為15℃、20℃、25℃、30℃、35℃及不同培養(yǎng)時(shí)間的菌體（18 h、30 h、42 h），種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（7）裝液量對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

設(shè)置裝液量分別為25mL/250mL、50mL/250mL、75mL/ 250 mL、100 mL/250 mL、125 mL/250 mL、150 mL/250 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（8）接種量對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

種子培養(yǎng)基分別以1%、2%、3%、4%、5%、6%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

（9）金屬離子對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

向培養(yǎng)基中加入濃度為0.5mmol/L的不同種類的金屬離子（FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CuCl2、CoCl2、MgCl2），種子培養(yǎng)基以5%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基后，于25℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后破碎離心取上清測(cè)定酶活，相對(duì)酶活計(jì)算以同組最高酶活為100%，每次做3組平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 酶的分離純化

（1）粗酶液的制備

將純化后的菌株S-09接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)36 h。發(fā)酵菌液于4℃、4 000 r/min離心30 min得到菌體，用超純水將菌體水洗2次，4℃、4 000 r/min離心30 min。將離心得到的濕菌體用0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH7.5）溶解。冰浴條件下用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)裂菌（作用3 s，間隔3 s，120 W，共10 min）。在低溫（4℃）條件下10 000 r/min離心10 min收集上清液即為肌酐水解酶粗酶液。

（2）硫酸銨沉淀

制備6份粗酶液，參照硫酸銨鹽析溶解度表，向酶液中加入硫酸銨固體使其硫酸銨飽和度分別達(dá)到10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%。低溫（4℃）保存12 h，離心收集沉淀用磷酸緩沖液溶解，分別測(cè)定不同梯度的沉淀蛋白濃度和酶活力，繪制鹽析標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）透析和超濾

將鹽析得到的樣品裝入預(yù)先處理好的透析袋（截留分子質(zhì)量14 000 u）中，4℃條件下透析，期間更換透析液。而后加入氯化鋇溶液，直到無(wú)白色沉淀生成為止，檢測(cè)透析液中無(wú)SO42-；將完成透析的樣品轉(zhuǎn)移到超濾管中進(jìn)行蛋白濃縮，4℃、4 000 r/min離心10 min，測(cè)定肌酐水解酶酶活。

（4）SephadexG-100凝膠過濾層析

正確連接凝膠柱、核算蛋白檢測(cè)儀、自動(dòng)收集器和顯示器，控制蛋白檢測(cè)儀T值為100。待基線平衡后將超濾后的濃縮酶液2 mL加入用同樣緩沖液平衡好的Sephadex G100凝膠柱（Ф1.6 cm×60 cm）中。調(diào)節(jié)設(shè)置自動(dòng)收集器，根據(jù)顯示器上的洗脫峰，記錄相應(yīng)試管管號(hào)，測(cè)定肌酐水解酶酶活力。

1.3.7 肌酐水解酶分子質(zhì)量的測(cè)定

采用濃度為12%的分離膠和濃度為5%的濃縮膠進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），考馬斯亮藍(lán)R-250染色1 h后脫色至無(wú)色，根據(jù)分子質(zhì)量和相對(duì)遷移率的關(guān)系確定肌酐水解酶分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 肌酸含量對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

肌酐水解酶是一種誘導(dǎo)酶，而誘導(dǎo)物的昂貴價(jià)格是發(fā)酵產(chǎn)酶商業(yè)生產(chǎn)中的一大障礙[16]，因此研究肌酸的有效加入量具有重要意義。不同肌酸含量對(duì)肌酐水解酶相對(duì)酶活的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，肌酸作為誘導(dǎo)物加入培養(yǎng)基中使得酶活有所提高，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加肌酸時(shí)酶活較低，隨著肌酸含量的增加酶活呈不斷上升趨勢(shì)，當(dāng)肌酸加入量在0.3%～0.8%時(shí)，相對(duì)酶活不斷增大并在肌酸加入量為0.8%時(shí)達(dá)到100%；肌酸含量＞0.8%時(shí)，肌酐水解酶相對(duì)酶活出現(xiàn)下降趨勢(shì)。最終選取0.3%為最適肌酸加入量，原因是誘導(dǎo)物價(jià)格昂貴，加入少量誘導(dǎo)物不僅能提高酶的產(chǎn)量，而且更好的降低成本提升經(jīng)濟(jì)效益。

圖1 肌酸含量對(duì)酶活的影響Fig.1 Effect of creatine contents on enzyme activity

2.1.2 不同碳源對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

不同碳源對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖2。由圖2可知，乳糖和葡萄糖作為碳源時(shí)酶活較低，而可溶性淀粉和檸檬酸鈉作為碳源時(shí)酶活相對(duì)較高，肌酐作為碳源時(shí)相對(duì)酶活達(dá)到100%，并且肌酐還是一種誘導(dǎo)物能促進(jìn)產(chǎn)酶。因此，選取肌酐作為最適碳源。

圖2 碳源種類對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of carbon source types on enzyme activity

2.1.3 不同氮源對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

不同氮源對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響結(jié)果見圖3。由圖3可知，以魚粉作為氮源時(shí)相對(duì)酶活最低，酵母膏和牛肉膏作為氮源時(shí)能促進(jìn)產(chǎn)酶但酶活水平一般，以胰蛋白胨和玉米漿作為氮源時(shí)不僅能穩(wěn)定的促進(jìn)產(chǎn)酶而且相對(duì)酶活達(dá)到100%。因此，選擇胰蛋白胨和玉米漿作為培養(yǎng)基最適氮源。

圖3 氮源種類對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of nitrogen source types on enzyme activity

2.1.4 復(fù)合氮源配比對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

胰蛋白胨和玉米漿都能較好的促進(jìn)產(chǎn)酶，但兩者含有不同種類的氨基酸、維生素及生長(zhǎng)因子[17]。因此在選?。ㄒ鹊鞍纂?玉米漿）為復(fù)合氮源，探究胰蛋白胨與玉米漿配比對(duì)酶活的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，胰蛋白胨與玉米漿配比為0.2%∶0.4%和0.3%∶0.4%時(shí)氮源濃度較高，但其產(chǎn)酶活性并非最高，分析可能濃度過高對(duì)菌體生長(zhǎng)產(chǎn)生一定抑制。而胰蛋白胨與玉米漿配比為0.3%∶0.2%時(shí)，添加到培養(yǎng)基中能更好的促進(jìn)產(chǎn)酶，肌酐水解酶相對(duì)酶活達(dá)到100%。因此，胰蛋白胨與玉米漿最佳配比為0.3%∶0.2%。

圖4 胰蛋白胨與玉米漿配比對(duì)酶活的影響Fig.4 Effect of tryptone and corn steep liquor ratio on enzyme activity

2.1.5 pH對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

不同pH值對(duì)肌酐水解酶酶活的影響結(jié)果見圖5。由圖5可知，pH在6.5～7.5范圍內(nèi)相對(duì)酶活隨pH值的增加而增大；在pH 7.5時(shí)肌酐水解酶相對(duì)酶活達(dá)到100%；在pH＞8.0時(shí)相對(duì)酶活隨pH值的增加而降低。因此，發(fā)酵最適pH值為7.5。

圖5pH對(duì)酶活的影響Fig.5 Effect of pH on enzyme activity

2.1.6 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖6可知，生長(zhǎng)時(shí)間為18 h的菌體產(chǎn)酶量增長(zhǎng)緩慢，生長(zhǎng)時(shí)間為30 h的菌體在25℃培養(yǎng)溫度下菌體產(chǎn)酶達(dá)到最大值，相對(duì)酶活為100%，生長(zhǎng)時(shí)間為42 h的菌體產(chǎn)酶量呈下降趨勢(shì)，分析原因可能是隨著培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸消耗，菌體產(chǎn)酶能力開始下降。因此，最佳培養(yǎng)溫度為25℃。

圖6 培養(yǎng)溫度對(duì)酶活的影響Fig.6 Effect of culture temperature on enzyme activity

2.1.7 裝液量對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖7可知，裝液量對(duì)菌體產(chǎn)酶酶活的影響并不是很大，裝液量在50 mL/250 mL時(shí)肌酐水解酶相對(duì)酶活達(dá)到100%，此時(shí)溶氧量適宜菌體生長(zhǎng)，隨著裝液增多相對(duì)酶活有所下降，分析原因可能是通氣不足溶氧量較少影響菌體產(chǎn)酶能力。因此，選取50 mL/250 mL為最適裝液量。

圖7 裝液量對(duì)酶活的影響Fig.7 Effect of liquid volume on enzyme activity

2.1.8 接種量對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

由圖8可知，當(dāng)接種量為1%～2%時(shí)，相對(duì)酶活較低。當(dāng)接種量變大時(shí)酶活反而呈下降趨勢(shì)，說明此時(shí)由于營(yíng)養(yǎng)成分的逐漸消耗和溶氧不足等因素的影響，接種過量不利于發(fā)酵產(chǎn)酶。當(dāng)接種量為3%時(shí)，相對(duì)酶活為99%；當(dāng)接種量為5%時(shí)，肌酐水解酶相對(duì)酶活達(dá)到100%。但考慮到微生物的實(shí)際生產(chǎn)，選取3%為最適接種量，不僅起到高產(chǎn)量的作用還能為生產(chǎn)降低大量成本。

圖8 接種量對(duì)酶活的影響Fig.8 Effect of inoculum on enzyme activity

2.1.9 金屬離子對(duì)菌株S-09發(fā)酵產(chǎn)酶的影響

向培養(yǎng)基中加入濃度為0.5 mmol/L的不同種類的金屬離子（Fe2+、Mn2+、Zn2+、Cu2+、Co2+、Mg2+），接種后培養(yǎng)36 h取樣測(cè)定酶活力，結(jié)果見圖9。由圖9可知，Zn2+、Cu2+對(duì)酶有一定的抑制作用，與NISIHYA Y等[18]研究表明的肌酐水解酶是一種含有Zn2+的金屬酶有所不同。Co2+、Mg2+對(duì)酶活影響不大，F(xiàn)e2+、Mn2+對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的促進(jìn)作用。

圖9 金屬離子對(duì)酶活的影響Fig.9 Effect of metal ions on enzyme activity

2.2 酶的分離純化

2.2.1 硫酸銨鹽析曲線

由圖10可知，當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到40%時(shí)，沉淀中開始出現(xiàn)肌酐水解酶活性；當(dāng)硫酸銨飽和度達(dá)到60%時(shí)，沉淀中的酶活達(dá)到100%。因此，表明該酶在硫酸銨飽和度達(dá)到40%～60%飽和度之間可以被有效地沉淀分離。

圖10 硫酸銨鹽析曲線Fig.10 Salting out curve ammonium sulfate

2.2.2 Sephadex G-100凝膠過濾層析

SephadexG-100凝膠過濾層析結(jié)果如圖11所示，在整個(gè)洗脫過程中出現(xiàn)5個(gè)蛋白吸收峰，通過測(cè)定酶活可知，肌酐水解酶主要集中在最后一個(gè)蛋白吸收峰（64～75號(hào)）內(nèi)。收集最后一個(gè)蛋白吸收峰內(nèi)的酶液，濃縮后進(jìn)行下一步電泳。

圖11Sephadex G-100凝膠過濾層析結(jié)果

Fig.11 Gel filtration chromatogram results of Sephadex G-100

2.2.3 肌酐水解酶分子質(zhì)量的測(cè)定結(jié)果

圖12SDS-PAGE電泳圖Fig.12 Electrophoretogram of SDS-PAGE

分別取粗酶液、鹽析酶液和純化后的肌酐水解酶樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳。結(jié)果見圖12。由圖12可知，SDS-PAGE凝膠電泳顯示純化后的肌酐水解酶為單一條帶。根據(jù)分子質(zhì)量和相對(duì)遷移率的關(guān)系，得出分子質(zhì)量約為24.3 ku，與TSURU D等[19]研究報(bào)道的肌酐水解酶分子質(zhì)量在23～33.7 ku之間相符。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇的微小桿菌S-09為革蘭氏陽(yáng)性菌，且原始酶活較高，并對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，以及對(duì)肌酐水解酶進(jìn)行了分離純化，結(jié)果表明，肌酐0.50%、胰蛋白胨和玉米漿配比為0.3%∶0.2%、肌酸含量0.3%、最適作用pH 7.5、最適溫度25℃、通氣量50 mL/250 mL、接種量3%、Fe2+和Mn2+能顯著促進(jìn)產(chǎn)酶，SDS-PAGE結(jié)果顯示，肌酐水解酶的分子質(zhì)量為24.3 ku。通過研究影響產(chǎn)酶因素、確定最優(yōu)產(chǎn)酶條件、對(duì)酶進(jìn)行分離純化，為酶法生產(chǎn)國(guó)產(chǎn)試劑盒并實(shí)現(xiàn)商品化奠定了基礎(chǔ)。

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Optimization of fermentation conditions of creatininase-productingExiguobacteriumsp.S-09 and separation and purification of creatininase

SHI Qun1,2,ZHANG Qingfang1,2,YANG Lina1,2,REN Nannan1,2,QIAO Hui1,2,CHI Naiyu1,2*
(1.School of Life Science and Biotechnology,Dalian University,Dalian 116622,China; 2.Liaoning Marine Microbial Engineering and Technology Center,Dalian 116622,China)

UsingExiguobacteriumsp.S-09 from marine as original strain,the fermentation medium and creatininase-producing condition were optimized.The crude enzyme was separated and purified by salting out,dialysis,ultrafiltration and Sephadex G-100 gel filtration chromatography.The results showed that the optimum fermentation conditions were as follows:creatinine 0.5%,tryptone 0.3%,corn steep liquor 0.2%,creatine 0.3%,initial pH 7.5,culture temperature 25℃,liquid volume 100 ml/250 ml,inoculum 3%.Fe2+and Mn2+can strongly activate enzyme production.SDS-PAGE electrophoresis showed that molecular mass of creatininase purified was about 24.3 ku.

creatininase;medium;fermentation conditions;optimization;separation and purification

Q93

0254-5071（2017）04-0020-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.005

2017-02-08

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（2007AA021306）

石群（1990-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶工程。

*通訊作者：遲乃玉（1965-），男，教授，博士，研究方向?yàn)槲⑸锱c酶工程。