劉 燕 丁秀芳 嚴(yán)志祎 李曉娟 劉玥蕓 鄒小娟 丁鳳敏 余 濤 陳家旭,

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢，430065； 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州，450046； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

P2X2受體在肝郁脾虛證小鼠模型前額皮質(zhì)中的表達(dá)

劉 燕1,2丁秀芳3嚴(yán)志祎3李曉娟3劉玥蕓3鄒小娟1丁鳳敏1余 濤1陳家旭1,3

(1 湖北中醫(yī)藥大學(xué)，武漢，430065； 2 河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州，450046； 3 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

目的：研究胞外ATP特異性P2X2受體的表達(dá)與肝郁脾虛證發(fā)生之間的關(guān)系，為深入了解胞外ATP的釋放現(xiàn)象與肝郁脾虛證的發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。方法：48只C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、逍遙散組和氟西汀組，除正常組外其余各組小鼠均接受復(fù)合應(yīng)激21 d，建立肝郁脾虛證小鼠模型。采用免疫組化、western blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測各組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白和基因的表達(dá)。結(jié)果：與正常組比較，模型組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05)，而P2X2受體mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但存在一定的下降趨勢(P>0.05)；與模型組比較，逍遙散組和氟西汀組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，氟西汀組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。結(jié)論：本研究結(jié)果表明基于復(fù)合應(yīng)激的肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體的表達(dá)存在減少的趨勢，其可能是誘導(dǎo)肝郁脾虛證發(fā)生的一個(gè)重要原因。

P2X2受體；肝郁脾虛證；小鼠模型；前額皮質(zhì)

肝郁脾虛證指由于肝氣郁結(jié)，疏泄失司，導(dǎo)致脾胃功能紊亂，出現(xiàn)肝木克脾土的情況，表現(xiàn)為消極、適應(yīng)能力低下、泄瀉、體重降低、飲食減少等[1]。現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快，工作壓力、社會(huì)競爭、起居調(diào)攝失宜等原因，造成人們心里負(fù)荷加重，情志抑郁，氣機(jī)失于調(diào)達(dá)，而致肝郁脾虛證成為臨床的常見證候。長期以來，中醫(yī)研究者們一直試圖從多系統(tǒng)、多層次、多角度來詮釋肝郁脾虛證的實(shí)質(zhì)，挖掘其臨床變化的物質(zhì)基礎(chǔ)。

大量研究證實(shí)P2X2受體在動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)分布廣泛。P2X2受體具有多種生理功能，主要包括神經(jīng)遞質(zhì)釋放、細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)和釋放的調(diào)控，介導(dǎo)炎性反應(yīng)和免疫反應(yīng)，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷和凋亡等[2-3]。大量研究證實(shí)神經(jīng)遞質(zhì)異常[4]、免疫反應(yīng)[5]等均與肝郁脾虛證的發(fā)生密切相關(guān)。由此，可推測P2X2受體表達(dá)異常可能是肝郁脾虛證發(fā)生的上游機(jī)制。本研究通過檢測肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)組織中P2X2受體表達(dá)水平，并對P2X2在肝郁脾虛證發(fā)生中的作用機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 成年C57BL/6J小鼠48只，10周齡，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：NO.11400700088123。飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)SPF級動(dòng)物房，溫度(22±2)℃，濕度30%～40%，各組小鼠常規(guī)飼養(yǎng)，自由進(jìn)水。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組，模型組，逍遙散組和氟西汀組，每組12只，正常組6只一籠，其余3組單籠孤養(yǎng)，除正常組外，其余各組小鼠接受復(fù)合應(yīng)激造模和相應(yīng)藥物灌胃。

1.1.2 藥物 《太平惠民和劑局方》逍遙散：北柴胡30 g，當(dāng)歸30 g，炒白術(shù)30 g，茯苓30 g，白芍30 g，薄荷10 g，甘草15 g，干姜10 g。逍遙散55劑均購自北京同仁堂(亳州)飲片有限責(zé)任公司，并由中日友好醫(yī)院制劑室精制成逍遙散藥粉共3 200 g，用時(shí)以蒸餾水稀釋至所需濃度。鹽酸氟西汀膠囊(Patheon Fance公司，批號(hào)：2061A，規(guī)格：20 mg/粒)。每周定點(diǎn)測量各組小鼠體重，并調(diào)整灌胃濃度。

1.1.3 試劑與儀器 抗P2X2受體兔多克隆抗體(購自Abcam公司，規(guī)格：100 μL，批號(hào)：ab10266)；抗β-Actin鼠單克隆抗體(購自康為世紀(jì)公司，規(guī)格：20 μL，批號(hào)：：CW0281)；超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(購自中山金橋公司，規(guī)格：18 mL，批號(hào)：PV-9001)；AMV一步法RT-PCR試劑盒(購自Invitrogen公司，規(guī)格：500T，批號(hào)：L1500-01)。36012型光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS公司)；RM2245石蠟切片機(jī)(LEICA公司)；Powerpac Basi電泳儀(BIO-RAD公司)；Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(Tanon公司)；PICO17型臺(tái)式高速離心機(jī)(Thermo公司)；1600型凝膠成像系統(tǒng)(Tanon公司)；ABI ViiA7 Real Time PCR System(Applied Biosystems)

1.2 方法

1.2.1 模型制備 以復(fù)合應(yīng)激方法建立肝郁脾虛證小鼠模型，采用新環(huán)境抑制進(jìn)食實(shí)驗(yàn)、曠場實(shí)驗(yàn)、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)、血清D木糖檢測等方法對肝郁脾虛證小鼠模型進(jìn)行評價(jià)[6]。

1.2.2 標(biāo)本采集與制備 21 d造模和藥物干預(yù)結(jié)束后，以3%的戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，每組隨機(jī)選取5只小鼠，以4%的多聚甲醛進(jìn)行灌流固定，取全腦放入4%多聚甲醛溶液中備用切片，剩余的小鼠直接開顱取前額皮質(zhì)組織放入凍存管，標(biāo)記并凍存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 免疫組化檢測 免疫組化染色采用二步法。將各組小鼠前額皮皮質(zhì)置于二甲苯和梯度乙醇中脫蠟和水化后，于枸櫞酸鹽緩沖液中高壓抗原修復(fù)10 min，待自然冷卻后，滴加3% H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，采用山羊血清工作液4 ℃封閉過夜后，滴加適當(dāng)稀釋的抗P2X2受體多克隆抗體(1∶500)濕盒內(nèi)4 ℃孵育過夜，其余步驟按照試劑說明書進(jìn)行操作。以PBS代替一抗做陰性對照。圖像采集和分析：CellSens Dimension1.11圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行觀察和拍照，并采用Court & Measure Full cellSens 1.11系統(tǒng)對圖片進(jìn)行分析，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)和平均光密度(Optical Density，OD)值。

1.2.4 Western blot檢測小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá) 細(xì)胞裂解法提取小鼠前額皮質(zhì)總蛋白，BCA法測定總蛋白濃度，SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(濕轉(zhuǎn)法)，孵育一抗、二抗，ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon-5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)曝光自動(dòng)獲取蛋白條帶圖像。用系統(tǒng)自帶GIS1D 4.2圖像分析軟件對圖像灰度值進(jìn)行采集，以相同蛋白樣品的灰度值為標(biāo)準(zhǔn)對各孔灰度值進(jìn)行歸一化處理，然后以P2X2受體蛋白灰度值比相應(yīng)的β-actin灰度值的表示P2X2受體蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)P2X2 mRNA的表達(dá) Trizol法提取小鼠前額皮質(zhì)總RNA，分光光度法測定260 nm與280 nm的OD值，用且RNA純度為A260/A280比值，范圍在1.8～2.1之間。按AMV一步法RT-PCR試劑盒說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR擴(kuò)增。每次擴(kuò)增設(shè)置無模板的陰性對照和GAPDH陽性對照，上面實(shí)時(shí)熒光定量重復(fù)3次，得到3次Ct，并算出平均Ct值。引物設(shè)計(jì)與合成：序列參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列，引物由ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)，由華大基因公司合成(見表1)。SDS軟件系統(tǒng)導(dǎo)出數(shù)據(jù)模塊，根據(jù)RQ=2-△△Ct方法對P2X2 mRNA的表達(dá)進(jìn)行相對定量分析。公式：△Ct實(shí)驗(yàn)組=Ct靶基因-Ct管家基因；△Ct對照組=Ct靶基因-Ct管家基因；△△Ct=△Ct實(shí)驗(yàn)組-△Ct對照組。

表1 小鼠P2X2引物序列

2 結(jié)果

2.1 小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)情況 免疫組化結(jié)果顯示：與正常組比較模型組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白OD值和陽性細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05；P<0.01)；與模型組比較逍遙散組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白OD值和陽性細(xì)胞數(shù)顯著升高(P<0.01；P<0.05)，氟西汀組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白OD值著升高(P<0.05)。見表2和圖1。

表2 各組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白免疫組化OD值及陽性細(xì)胞數(shù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述±s)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖1 各組小鼠前額皮質(zhì)PrL區(qū)P2X2蛋白表達(dá)免疫組化圖(400×)

Western Blot檢測結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與模型組比較逍遙散組和氟西汀組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01，P<0.05)。

表3 各組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述±s)

注：與正常組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01。

圖2 各組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)

2.2 小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體mRNA表達(dá)情況 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組、逍遙散組和氟西汀組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，氟西汀組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

表4 各組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體 mRNA表達(dá)的統(tǒng)計(jì)學(xué)描述±s)

注：與模型組比較，*P<0.05。

3 討論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，胞外ATP是一種重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞外環(huán)境中，ATP可以結(jié)合到其特異性P2受體上，從而介導(dǎo)各種作用，由于大規(guī)模的ATP釋放現(xiàn)象一般出現(xiàn)在各類應(yīng)激、腦缺血、腦損傷之后，由于其具有細(xì)胞外營養(yǎng)功能，因此，可以認(rèn)為細(xì)胞外ATP在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中扮演者非常復(fù)雜的角色，具有神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療靶點(diǎn)的潛能[7]。

既往研究顯示ATP特異性P2受體在全身多個(gè)組織、器官、和系統(tǒng)中均可被檢測到。其中P2X2受體在大腦皮質(zhì)、海馬、韁核、下丘腦腹正中核、三叉神經(jīng)中腦核、迷走神經(jīng)背核和孤束核等部位均存在大量表達(dá)[8]。另外現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝郁脾虛證的病因?qū)W基礎(chǔ)與情志反應(yīng)密不可分，神經(jīng)中樞—丘腦下部—腦干植物神經(jīng)系統(tǒng)—效應(yīng)器作為情志反應(yīng)的作用軸，而前額皮質(zhì)腦區(qū)作為情緒控制、認(rèn)知、感覺和運(yùn)動(dòng)等多級協(xié)調(diào)體系的高級中樞，其形態(tài)和功能的改變均與肝郁脾虛證的發(fā)生發(fā)展存在著密切的聯(lián)系[9-10]。因此，本研究基于復(fù)合應(yīng)激肝郁脾虛證小鼠模型對肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白和基因的表達(dá)情況及逍遙散的調(diào)節(jié)作用進(jìn)行了觀察，以了解胞外ATP特異性P2X2受體的表達(dá)與肝郁脾虛證發(fā)生之間的關(guān)系，為深入了解胞外ATP的釋放現(xiàn)象與肝郁脾虛證的發(fā)生機(jī)制之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

本次研究通過免疫組化和Western blot技術(shù)觀察到肝郁脾虛證模型小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體蛋白表達(dá)較正常組均存在顯著減少的現(xiàn)象，而逍遙散和氟西汀2種藥物均能顯著改善這種現(xiàn)象。另外本次研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體mRNA的表達(dá)進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示較正常小鼠，模型組小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體mRNA的表達(dá)無顯著差異，但存在一定的下降趨勢，而逍遙散和氟西汀這2種藥物也均有改善這種現(xiàn)象的趨勢，體現(xiàn)了2種藥物對肝郁脾虛證小鼠的治療作用。從方證對應(yīng)角度來看，逍遙散為肝郁脾虛證之代表方劑，其在模型小鼠前額皮質(zhì)P2X2蛋白和基因表達(dá)方面均體現(xiàn)出較好的改善和治療作用，因此，根據(jù)方證對應(yīng)原理，我們可以判定首先此肝郁脾虛證動(dòng)物模型的建立是成功的，另外研究結(jié)果表明基于復(fù)合應(yīng)激的肝郁脾虛證小鼠前額皮質(zhì)P2X2受體的表達(dá)存在減少的趨勢，其可能是誘導(dǎo)肝郁脾虛證發(fā)生的一個(gè)重要原因，另外P2X2是胞外ATP的特異性受體，胞外ATP的釋放與應(yīng)激有著密切的關(guān)系，那么肝郁脾虛證是否還與胞外ATP的含量以及ATP釋放機(jī)制紊亂有著密切的聯(lián)系？有待進(jìn)一步深入研究。

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(2017-02-20收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

The expression of P2X2 receptor in prefrontal cortex of mice with syndrome of liver depression and spleen deficiency

Liu Yan1,2, Ding Xiufang3, Yan Zhiyi3, Li Xiaojuan3, Liu Yueyun3, Zou Xiaojuan1, Ding Fengmin1, Yu Tao1, Chen Jiaxu1,3

(1HubeiUniversityofChineseMedicine,Wuhan430036,China; 2HenanUniversityofChineseMedicine,Zhengzhou450046,China; 3BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To study the relationship between the expression of specific P2X2 receptor of ATP and occurrence of syndrome of liver depression and spleen deficiency, in order to lay the foundation for the study on relationship between the release phenomenon of ATP and occurrence of syndrome of liver depression and spleen deficiency. Methods:A total of 48 C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups as normal group, model group, Xiaoyaosan group, and Fluoxetine group. All the mice, except the normal group, received multiple stresses for 21 days to establish the mice model of syndrome of liver depression and spleen deficiency. Immunohistochemical technique, Western blot, and qPCR were used to test the expression of protein and mRNA of P2X2 receptor in prefrontal cortex of mice. Results:Compared with the normal group, the expression of protein of P2X2 receptor of mice in model group decreased significantly (P<0.05), and the expression of mRNA of P2X2 receptor of mice in model group declined, although it was not significant (P>0.05). Compared with model group, the expression of protein of P2X2 receptor of mice in Xiaoyaosan and Fluoxetine groups increased significantly (P<0.05), and the expression of mRNA of P2X2 receptor of mice in Fluoxetine group also increased (P<0.05). Conclusion:Induced by multiple stresses, the expression of P2X2 receptor in prefrontal cortex of mice with syndrome of liver depression and spleen deficiency tends to be reduced, which might be an important reason of occurrence of syndrome of liver depression and spleen deficiency.

P2X2 receptor; Syndrome of liver depression and spleen deficiency; Mice model; Prefrontal cortex

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81630104；81473597)；北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：7152093)

陳家旭，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，北京市朝陽區(qū)北三環(huán)東路11號(hào)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)診斷系83號(hào)信箱，郵編：100029，Tel：(010)64286656，E-mail：chenjx@bucm.edu.cn

R228

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.008