黃曉春，呂茉琦，杜良智，任文娟，周黨俠

(1.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系，陜西 西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061)

HLA-DRB1基因多態(tài)性與陜西漢族婦女患中重度EM風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

黃曉春1，呂茉琦2,3，杜良智2,3，任文娟2,3，周黨俠2,3

(1.西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科，陜西 西安 710004；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部病理系，陜西 西安 710061；3.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部生殖醫(yī)學(xué)中心，陜西 西安 710061)

目的 探討HLA-DRB1基因多態(tài)性在陜西漢族中重度子宮內(nèi)膜異位癥(EM)人群中的分布及其與EM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)性。方法 采用聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序技術(shù)(PCR-SBT)，檢測50例中重度EM患者和52例正常對照人群中HLA-DRB1的基因多態(tài)性分型，分析其基因型分布及其與中重度EM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果 HLA-DRB1基因在EM組和對照組人群中均呈高度多態(tài)性分布；EM組人群中檢測到22種HLA-DRB1基因型，其中基因型頻率大于5%分別為HLA-DRB1*07:01(18%)，DRB1*15:01(12%)，DRB1*09:01(11%)，DRB1*12:01(7%)，DRB1*12:02(7%)，DRB1*14:54(6%)，DRB1*15:02(6%)和DRB1*14:05(5%)。在對照組中人群中檢測到24種HLA-DRB1基因型，其中基因型頻率大于5%分別為HLA-DRB1*15:01(16.3%)，DRB1*07:01(14.4%)，DRB1*12:02(8.7%)，DRB1*12:01(8.7%)，DRB1*09:01(6.7%)和DRB1*04:05(5.8%)。HLA-DRB1各基因型在EM組與對照組中的分布未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)論 HLA-DRB1基因多態(tài)性與陜西漢族中重度EM發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無明顯關(guān)聯(lián)。

HLA-DRB1基因；子宮內(nèi)膜異位癥；基因多態(tài)性；聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序技術(shù)

子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis，EM)是女性常見病和多發(fā)病，發(fā)病率高達(dá)10%～15%，近年來發(fā)病有逐漸上升的趨勢[1]。EM臨床主要表現(xiàn)為痛經(jīng)、不規(guī)則陰道流血和不孕等，病情嚴(yán)重則影響婦女的身心健康。目前EM發(fā)生的確切病因和發(fā)病機(jī)制不明。當(dāng)前關(guān)于EM的發(fā)病機(jī)制有很多學(xué)說，包括：子宮內(nèi)膜種植學(xué)說、體腔上皮化生學(xué)說及免疫學(xué)說等。近年來，越來越多的證據(jù)表明EM是一種自身免疫性疾病[2-3]。

人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)是一種高度多態(tài)性和具有多種免疫功能的基因系統(tǒng)，HLA-DR抗原是HLA系統(tǒng)最重要的抗原之一，決定其特異性的主要編碼基因DRB1座位具有高度多態(tài)性，許多自身免疫性疾病都與其相關(guān)[4-5]。本研究將采用先進(jìn)的聚合酶鏈反應(yīng)-直接測序(polymerase chain reaction sequence-based typing，PCR-SBT)技術(shù)，對經(jīng)過臨床嚴(yán)格篩選的EM患者進(jìn)行HLA-DRB1等位基因的基因分型，探討EM患者的遺傳易感性與HLA-DRB1的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1研究對象

方法[5]，選擇2011年3月至2015年12月在西安市第四醫(yī)院收治的EM患者50例，均為在陜西地區(qū)居住的漢族，年齡22～43歲。按美國生育協(xié)會(huì)(AFS)修正標(biāo)準(zhǔn)分期均為Ⅲ～Ⅳ期，均經(jīng)手術(shù)后病理檢查證實(shí)。正常對照組為前來西安市第四醫(yī)院體檢的健康女性，月經(jīng)規(guī)律，無痛經(jīng)史，均曾足月分娩，陜西漢族，年齡28～41歲。入選EM患者和對照組均被告知研究目的、方法和意義，并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過。

1.2全血基因組DNA提取

采集外周靜脈血3mL于乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)抗凝管中，放置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。全血基因組DNA提取按照全血DNA提取試劑盒說明書(北京鼎國生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行。

1.3 HLA-DRB1基因分型

HLA-DRB1基因多態(tài)性檢測采用PCR-SBT，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行(SeCoreTM， Invitrogen)，擴(kuò)增包括DRB1第2外顯子和其兩端的部分內(nèi)含子序列，擴(kuò)增條件：96℃2min后，96℃30s；60℃30s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。將得到的PCR產(chǎn)物純化后在ABI-3730XL 測序儀上進(jìn)行測序。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

首先，利用Arlequin 3.5軟件(Laurent Excoffier，伯爾尼大學(xué)，瑞士)計(jì)算Hardy-Weinberg平衡；其次，利用PowerStat Version1.2軟件計(jì)算HLA-DRB1位點(diǎn)的觀察雜合度(homozygotes，Ho)、期望雜合度(heterozygotes，He)、多態(tài)信息量(polymorphism information content，PIC)、匹配概率(Pm)、個(gè)體識(shí)別率(power of discrimination，PD)和非父排除率(PPE)等。最后，HLA-DRB1位點(diǎn)基因多態(tài)性在EM患者和對照組間的分布差異采用Chi-square檢驗(yàn)和Fisher精確檢驗(yàn)，比值比(OR)及95%可信區(qū)間(95%CI)利用Logistic回歸模型計(jì)算，P值用Bonferroni校正(Pc)，以Pc<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡

2.2 HLA-DRB1的基因參數(shù)

觀察EM組和對照組人群HLA-DRB1基因的Ho、He、PIC、Pm、PD、PPE，這些基因參數(shù)信息常用來評(píng)估基因多態(tài)性。當(dāng)PD值大于0.8，PIC值大于0.5或者PPE值大于0.5均表明此基因是高度多態(tài)性的。

由表1可見，HLA-DRB1基因在EM組和對照組人群中的基因參數(shù)包括PD、PIC和PPE值均高于臨界值，說明HLA-DRB1基因在EM組和對照組人群中呈高度多態(tài)性分布。

表1 EM患者和對照組中HLA-DRB1基因的參數(shù)信息

Table1 Genetic parameters of HLA-DRB1 locus in EM patients and controls

2.3 HLA-DRB1基因型分布

如表2所見，在50例EM患者中檢測到22種HLA-DRB1基因型，其中基因型頻率大于5%的分別為HLA-DRB1*07:01(18%)，DRB1*15:01(12%)，DRB1*09:01(11%)，DRB1*12:01(7%)，DRB1*12:02(7%)，DRB1*14:54(6%)，DRB1*15:02(6%)和DRB1*14:05(5%)。

在52例對照組中檢測到24種HLA-DRB1基因型，其中基因型頻率大于5%的分別為HLA-DRB1*15:01(16.3%)，DRB1*07:01(14.4%)，DRB1*12:02(8.7%)，DRB1*12:01(8.7%)，DRB1*09:01(6.7%)和DRB1*04:05(5.8%)。

The simulative research of campus network based on OPNET

2.4 HLA-DRB1基因型頻率與EM易感性的關(guān)系

由表2可見，HLA-DRB1各基因型分布在EM患者與對照組中比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。雖然EM組HLA-DRB1*14:54基因型是對照組的6.574倍(95%CI0.777～55.622)，但經(jīng)過Bonferroni校正，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 高分辨率HLA-DRB1基因型在病例與對照組中的分布及其與EM易感的相關(guān)性

(轉(zhuǎn)下表)

(續(xù)上表)

HLA-DRB1對照組(n=104alleles)EM患者(n=100alleles)NAF(%)NAF(%)PPcOR(95%CI)11:0432.911.00.332NS0.340(0.035～3.325)12:0198.777.00.660NS0.795(0.284～2.222)12:0298.777.00.660NS0.795(0.284～2.222)13:0132.911.00.332NS0.340(0.035～3.325)13:0221.911.00.584NS0.515(0.046～5.772)13:0311.0-----14:0311.011.00.978NS1.040(0.064～16.863)14:0421.911.01.000NS0.515(0.046～5.772)14:0532.955.00.436NS1.772(0.412～7.618)14:541166.00.061NS6.574(0.777～55.622)15:011716.31212.00.374NS0.698(0.315～1.547)15:0232.966.00.325NS2.149(0.523～8.839)16:021111.01.000NS1.040(0.064～16.863)

注：N為等位基因數(shù)，AF為等位基因頻率(allele frequency)，NS為無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(not significant)，Pc為校正P值(Pvalue corrected by 26)， “-”表示缺失值，EM組或?qū)φ战M未出現(xiàn)此等位基因，因此未作統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

3討論

3.1 HLA基因多態(tài)性

HLA基因位于第6號(hào)染色體短臂6p21.31區(qū)，長3 600kb，是一個(gè)由一系列緊密連鎖的基因座位所組成的具有高度多態(tài)性的復(fù)合體，也是目前所知人體內(nèi)最復(fù)雜的遺傳多態(tài)系統(tǒng)[5-6]。根據(jù)最新的數(shù)據(jù)庫結(jié)果(http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html)，目前已確定的HLA等位基因達(dá)14 473個(gè)，其中DRB1位點(diǎn)1 883個(gè)。其高度多態(tài)性使得其成為最重要的疾病易感基因之一[7-8]。

3.2 HLA-DRB1基因多態(tài)性與EM的易感相關(guān)性

本研究首次應(yīng)用最先進(jìn)的PCR-SBT技術(shù)探索HLA-DRB1基因在EM患者中的分布及其與EM的易感聯(lián)系。結(jié)果顯示EM組和對照組人群之間HLA-DRB1等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。HLA-DRB1等位基因多態(tài)性與陜西漢族女性人群的EM可能無明顯相關(guān)性。

EM被認(rèn)為是一種多因素遺傳病[9]，其發(fā)病與自身免疫密切相關(guān)[10]。在盆腔異位子宮內(nèi)膜病灶或逆流經(jīng)血中子宮內(nèi)膜碎片的刺激下，產(chǎn)生一系列的活化因子而啟動(dòng)免疫反應(yīng)，導(dǎo)致腹腔液微環(huán)境改變，使“逃逸”在腹腔的內(nèi)膜異位種植并生長。Sundqvist等[11]研究發(fā)現(xiàn)HLA-DRB1的rs660895位點(diǎn)是中重度EM的易感多態(tài)性位點(diǎn)，但我國學(xué)者宗利麗等于2001年的研究發(fā)現(xiàn)中國南方婦女EM與HLA-DRB1等位基因可能無相關(guān)性。本研究結(jié)論也認(rèn)為位于中國西部的陜西漢族婦女中重度EM與HLA-DRB1等位基因可能無相關(guān)性。這些研究結(jié)果的不一致可能歸因于不一樣的HLA分型方法、樣本尺寸、民族背景和地理差異[5,11]。

3.3影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)因素分析

HLA分型方法、樣本大小及民族地理差異是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重要因素。目前HLA分型方法主要有序列特異性寡核苷酸探針(PCR-sequence specific oligonu-cleotide probing，PCR-SSOP)、序列特異性引物(PCR- sequence specific primers，PCR-SSP)和PCR-SBT。其中PCR-SBT對HLA等位基因的堿基序列進(jìn)行直接測定，是目前HLA分型最直接、最準(zhǔn)確的方法，被公認(rèn)為HLA檢測分型的金標(biāo)準(zhǔn)。本研究首次應(yīng)用最先進(jìn)的PCR-SBT技術(shù)研究HLA-DRB1基因在EM患者中的分布及其易感性，結(jié)果顯示EM組和對照組人群之間HLA-DRB1等位基因頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。位于中國西部的陜西漢族女性人群EM與HLA-DRB1等位基因可能無明顯相關(guān)性。在樣本選擇方面，本研究采用經(jīng)過臨床嚴(yán)格篩選的中重度EM患者進(jìn)行HLA-DRB1等位基因的基因分型，更能反映基因—疾病的相關(guān)性。此外，陜西地區(qū)是中華文明的發(fā)源地之一，是漢族的主要聚居區(qū)之一，陜西地區(qū)漢族人群的基因特征是中華民族漢族人群的重要分支和基礎(chǔ)。本研究的病例對照人群均選擇陜西漢族女性，也排除了民族地理差異對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

3.4結(jié)論與展望

綜上，本研究結(jié)果顯示陜西漢族女性人群EM與HLA-DRB1等位基因可能無明顯相關(guān)性，但HLA的多態(tài)性在不同民族、地域的人群中分布差異很大，而且某些疾病易感基因可能不是單一位點(diǎn)的等位基因，而是多個(gè)等位基因組成的單倍體，因此在后續(xù)的研究中，我們需要進(jìn)一步加大樣本觀察，為尋找EM的易感基因提供更有價(jià)值的線索和依據(jù)。

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[專業(yè)責(zé)任編輯：王月玲]

Association of HLA-DRB1 gene polymorphism with moderate to severe endometriosis in females of Han nationality in Shaanxi Province

HUANG Xiao-chun1, LYU Mo-qi2,3, DU Liang-zhi2,3, REN Wen-juan2,3, ZHOU Dang-xia2,3

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics,FourthHospitalofXi’anCity,ShaanxiXi’an710004,China; 2.DepartmentofPathology,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,ShaanxiXi’an710061,China; 3.ReproductiveMedicineCenter,Xi’anJiaotongUniversityHealthScienceCenter,ShaanxiXi’an710061,China)

Objective To investigate the distribution of HLA-DRB1 gene polymorphism in females of Han nationality with moderate to severe endometriosis (EM) in Shaanxi Province and its association with EM risk. Methods Polymerase chain reaction sequence-based typing (PCR-SBT) method was used for DNA genotyping at HLA-DRB1 locus in 50 patients with moderate to severe EM and 52 healthy controls in females to analyze the association between genotype distribution of HLA-DRB1 alleles and risk of moderate to severe EM. Results Both in EM group and control group HLA-DRB1 appeared highly polymorphic. Twenty-two HLA-DRB1 alleles were detected in EM group, and the frequency of following genotypes was above 5%, HLA-DRB1*07:01 (18%), DRB1*15:01(12%), DRB1*09:01(11%), DRB1*12:01 (7%), DRB1*12:02 (7%), DRB1*14:54 (6%), DRB1*15:02 (6%) and DRB1*14:05 (5%). Twenty-four HLA-DRB1 alleles were detected in control group, and the frequency of following genotype was above 5%, HLA-DRB1*15:01 (16.3%), DRB1*07:01 (14.4%), DRB1*12:02 (8.7%), DRB1*12:01 (8.7%), DRB1*09:01 (6.7%) and DRB1*04:05 (5.8%). However, no significant differences in these allelic frequencies were found between EM group and control group. Conclusion HLA-DRB1 gene polymorphism does not significantly associated with risk of moderate to severe EM in females of Han nationality in Shaanxi Province.

HLA-DRB1 gene; endometriosis (EM); gene polymorphism; polymerase chain reaction sequence-based typing (PCR-SBT)

2016-10-05

黃曉春(1970-)，女，副主任醫(yī)師，主要從事婦科診療工作。

周黨俠，教授。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.03.016

R173

A

1673-5293(2017)03-0270-04